ניתוח ובניית מבני חומצות גרעין עם 3DNA

המטרה הכוללת של הליך זה היא להביא את חבילת התוכניות התלת-ממדית NA למדעני מעבדה ואחרים כדי לחקור את הארגון המרחבי של DNA ו-RNA עם כלים חישוביים מתקדמים. זה מושג על ידי הורדה ראשונה של התוכנה מפורום 3D NA והתקנתה במחשב מקומי. השלב השני הוא ניתוח מבנה DNA מייצג ברמת שלבי זוג הבסיסים המרכיבים.

לאחר מכן, אותו מבנה DNA משתנה ברמת צעד זוג הבסיסים, ולאחר מכן נבנה מחדש באמצעות פרמטרי צעד זוג הבסיס שהוגדרו לאחרונה. השלב הבא הוא ניתוח של אנסמבל גדול של מבנים קשורים. השלב האחרון הוא יישור של קבוצה של מבני DNA קשורים על מסגרת ייחוס משותפת על מנת לדמיין עיוותים גלובליים של המבנים.

בסופו של דבר, כלי ה-NA התלת-ממדיים משמשים כדי לבחון כיצד צעדי זוגות בסיסים בודדים, כולל אלה הקשורים לתרופות וחלבונים, תורמים לקיפול הכולל של ה-DNA ולזיהוי האתרים והכיוונים של עיוותים גלובליים גדולים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שהתוכנה חזקה וישימה באופן נרחב למגוון מבנים שונים המכילים חומצות גרעין. השיטה יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביוכימיה ובביופיזיקה, כגון כיצד גנומים מאורגנים בתלת מימד, ואיזה סוג של דפורמציה DNA יכול לאמץ.

כדי להתחיל בהתקנת חבילת התוכנה, התחבר לשלושת ארגוני DA website@xthreed"ב ולחץ על הקישור לפורום 3D NA בתוך הפורום. בחר את הקישור להרשמה ופעל לפי ההוראות כדי ליצור חשבון חדש.

לאחר שנוצרו שם משתמש וסיסמה, היכנס לפורום, בחר את קישור ההורדות בקטע הפתיחה, ובעמוד החדש, בחר הורדת 3D NA. לחץ פעמיים על קובץ tar gz כדי ליצור תיקיה בשם X 3D NA dash V 2.1, המכילה את תוכנת 3D NA. פתח את יישום המסוף, שנמצא בדרך כלל תחת כלי עזר במקינטוש, ושנה לספריית X 3D NA dash V 2.1.

הפעל את קובץ ה- Script של ההתקנה הדרוש כדי ש- 3D NA יפעל כראוי. ניתן למצוא את כל הפקודות המשמשות בסרטון זה בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, העתק את שתי הגדרות ייצוא הקו המופיעות מודפסות על המסך.

אם המשתמש מיקם את התוכנה בספריית היישומים, שתי השורות אמורות להופיע כפי שמוצג כאן. פתח את יישום עריכת הטקסט שנמצא בספריית היישומים. תחת תפריט עיצוב, בחר צור טקסט רגיל.

אם קיים קובץ BRC, פתח את הקובץ בטקסט, ערוך והדבק את הגדרות הייצוא בסוף הקובץ. אם לא, קובץ bash RC קיים, הדבק את הגדרות הייצוא בקובץ ריק ושמור עם שם הקובץ bash RC בספריית הבית. על מנת שההגדרות החדשות יהיו זמינות, הפעל את קובץ Bash RC החדש שנשמר בתוך תוכנית המסוף.

סרטון זה מדגים את הניתוח של מבנה חומצת גרעין מייצג, ה-DNA הקשור לחלבון HBB מהחיידק Borrelia bergdorf eye. השלב הראשון בניתוח NA תלת מימדי הוא יצירת קובץ המפרט את כל הבסיסים הזוגיים. זה נעשה על ידי הקלדת פקודה להחלת תוכנית Find para על המבנה האטומי המאוחסן בקובץ ל-NP two, MP two pdb.

השלב הבא בניתוח הוא קביעת הפרמטרים הגיאומטריים המאפיינים את המבנה. ניתוח הפקודות לוקח כקלט את קובץ זוג הבסיס ויוצר מספר קבצי פלט המופיעים בספריית העבודה. לאחר מכן ניתן לחשב את הערכים הגיאומטריים על ידי הקלדה, לנתח שני מגה פיקסל שני bps.

קבצי הפלט שנוצרו כוללים שני MP שניים החוצה, המכיל סקירה כללית של הפרמטרים המחושבים ו-bpco step par, המכיל רשימה של פרמטרי הגוף הקשיח בנוסף לניתוח מבנה חומצת גרעין, תוכנת ה-3D NA מספקת את היכולת לבנות מודל מבני מפרמטרי גוף קשיחים באמצעות פקודת הבנייה מחדש על מנת ליצור מודל אטומי משוער, הכולל קואורדינטות הן עבור עמוד השדרה והן עבור אטומי הבסיס. הקלד את הפקודה המופיעה בטקסט. פקודה זו מורה ל-3D NA להציג אישור עמוד שדרה סטנדרטי של BDNA בבניית מודלים מפרמטרי גוף קשיחים.

לאחר מכן ניתן לבנות מודל סליל כפול עם פרמטרי הגוף הקשיחים המצויים במבנה H-B-B-D-N-A על ידי הקלדת הפקודה המתאימה. ניתן לערוך את קובץ ה-bpco step par כדי ליצור מבנה שונה. כאן, זוויות הגלגול הקיצוניות שנוצרו בשני האתרים של הכיפוף הגדול ביותר משתנות.

לאחר מכן המבנה נבנה עם קבוצת פרמטרי השלבים שהשתנתה כקובץ הקלט. ניתן לצפות בשני המודלים עם צופה מולקולרי סטנדרטי בניגוד לניתוח של מבנה המכיל חומצת גרעין בודדת. חלק זה של הסרטון יראה כיצד לנתח אנסמבל גדול של מבנים בקבוצה של קבצים, החל מהשמות MD קו תחתון מוגדר PDB אחד וכלה במספר.

השלב הראשון בניתוח הוא זיהוי הבסיסים הזוגיים המתקבלים על ידי הרצת תוכנית הזוג Find כמו קודם, מכיוון שכל קבוצת המבנים חולקת את אותה סכימת זיווג בסיסים, צריך להריץ את Find pair פעם אחת בקובץ מייצג כאן, הקובץ מסתיים ב-1001. פעולה זו יוצרת את מידע ההתאמה הבסיסי ומאחסנת אותו בקובץ MD ב-BPS PS אחד. השלב הבא מוצא את הפרמטרים הגיאומטריים של כל מערך המבנים באמצעות אנסמבל ה-ncore של Command X 3D. לנתח. לאחר מכן ניתן לחלץ את פרמטרי הגוף הקשיח הרצויים מקובץ הפלט של הסקירה הכללית MD בסט הראשון.

זה מבוצע באמצעות תמצית אנסמבל Command X שלוש DCO. זוויות הגלגול מחולצות ונוצר קובץ טקסט מופרד בפסיקים של זוויות הגלגול. ניתן לקרוא קובץ זה לתוכניות אחרות להמשך ניתוח ושרטוט.

הגרסה העדכנית ביותר של 3D NA כוללת תכונה חדשה המאפשרת למשתמש להסתכל על מבנים מרובים מנקודת מבט משותפת. פקודת הכיוון מחדש של אנסמבל X three DCO מעלה אוסף של מבנים קשורים על צעד של זוג בסיסים משותף או זוג בסיסים, כמו בפרוטוקולים קודמים. השלב הראשון הוא לחשב את זיווג הבסיס של ה-DNA עם תוכנית הזוג למצוא.

במקרה זה, קובץ הקלט הוא שני KEK pdb הקובץ המכיל את 10 המבנים של ה-CIA coli, אופרטור O 3D NA הקשור לכיסוי הראש של חלבון LAC Repressor. הכיוון מחדש של אנסמבל Command X Three DCO יישר את הדגמים הבודדים במבנה מרובה מודלים על מסגרת ייחוס משותפת. פקודה זו דורשת הן את קובץ ה-PDB והן את קובץ ההתאמה הבסיסי מהשלב הקודם כקלט.

כמו כן כלולה בפקודה זהות צמד הבסיסים צעד שכנגדו כל המבנים מיושרים. ממשק האינטרנט W 3D NA כולל כמה תכונות פופולריות של חבילת התוכנה 3D NA. חלק זה של הסרטון מפנה את תשומת הלב ליכולת לבנות מודלים תלת מימדיים של DNA מעוטר בחלבון עם שרת האינטרנט.

הצעד הראשון בבניית מודל DNA מעוטר בחלבון הוא לבקר באתר האינטרנט של W 3D NA הממוקם בכתובת W שלוש d.rutgers.edu. בחירת שחזור מהתפריט בצד שמאל למעלה של הדף מפעילה את יכולות בניית המודל המקוון. השלב הבא הוא לבחור את הקישור לתבנית ה-DNA של החלבון הקשור שנמצא בתיבה המוצללת קלות באמצע העמוד החדש.

בחירה זו תפעיל תפריט נפתח, המאפשר למשתמש לציין את מספר החלבונים הקשורים. בחירת מספר החלבונים הקשורים מובילה לדף מפרט חדש. לאחר מכן המשתמש יכול להקליד או להדביק ברצף הרצוי.

בתיבת הטקסט, באמצע העמוד החדש, יש תפריט נפתח מתחת לתיבת הטקסט לבחירת האישור הסליל של האזורים הלא מאוגדים של ה- DNA. יש תיבת טקסט ליד החלק התחתון של דף המפרט כדי להזין את מיקומי הכריכה ושמות הקבצים של החלבונים המאוגדים. מיקום הקישור מציין את מיקום מרכז המקטע הקשור לחלבון ברצף ה-DNA.

בתחתית דף המפרט, יש תיבה המאפשרת למשתמש ליצור תצוגה מקדימה של ה-DNA הקשור לחלבון. במקרה זה, תיבה זו מסומנת ולוחצים על כפתור המשך. פעולה זו יוצרת דף סקירה המפרט את הפרמטרים שנבחרו, וכן שגיאות שעשויות לנבוע מחפיפה של אתרי הכריכה שנבחרו.

המשתמש יכול לבחור בלחצן 'הקודם' אם יש צורך לבצע שינויים כלשהם, או בלחצן הבנייה כדי להמשיך. העמוד הבא מציג תמונה סטטית של קומפלקס חלבון ה-DNA בסידורו המורחב ביותר ומאפשר הדמיה אינטראקטיבית מקוונת דרך האינטרנט. המשתמש יכול גם להוריד קובץ המכיל קואורדינטות אטומיות.

כלי התוכנה התלת-ממדיים של NA משמשים באופן שגרתי לניתוח מבנים של חומצות גרעין. הערכים של פרמטרי הגוף הקשיח חושפים עיוותים במבנה תלת מימדי, כגון שני האתרים של DNA קיצוני המתכופפים לתוך החריץ הראשי עם זוויות גלגול חיוביות גדולות שנמצאות בשלבים 13 ו-22. בקומפלקס הגבישי של ה- DNA עם בורליה ברגדורף, חלבון RHBB.

היכולת של התוכנה לבנות מחדש מבנים מכמויות אלה מאפשרת לקבוע כיצד צעדים בודדים של בסיס וזוג בסיסים תורמים לקפל המולקולרי הכולל. כפי שמודגם כאן, הכיפוף הגלובלי של ה-DNA המושרה על ידי HBB משקף יותר משני עיוותי התפקיד הקיצוניים שצוינו לעיל. ה-DNA נשאר מעוקל מאוד כאשר הוא משוחזר עם מדרגות זוג הבסיסים הללו מיושרות.

זה כאשר שני הערכים הגדולים ביותר של התפקיד הוגדרו לאפס. היכולת החדשה ב-3D NA לבחון מספר רב של מבנים קשורים מאפשרת לחלץ דפוסים תלויי רצף וזמן בסידורים המרחביים של מולקולות DNA ו-RNA מדומות. לדוגמה, ציפוי הצבע הצהוב של זוויות הגלגול בין זוגות בסיסים עוקבים בשתי קבוצות גדולות של מבני DNA מדומים חושף את הכיפוף המועדף של מולקולות אלה בשלבים של זוגות בסיסי פורין פרמי.

הערכים הגבוהים יותר של גליל המתוארים באדום הנמשכים לתקופות קצרות בקצות ה-DNA מרמזים על התכה מקומית וכריעה מחדש של המבנה הסליל הכפול. הדפוסים הווריאציונליים של פרמטרים אחרים של גוף קשיח, כגון הזוויות והמרחקים בין בסיסים משלימים, יכולים לעזור לפענח את העיוותים המבניים המדויקים. היכולת של תוכנת ה-NA התלת-ממדית לכוון מחדש מולקולות קשורות במסגרת ייחוס משותפת חושפת מאפיינים של מבנה כללי החבוי ברבים מהקבצים המאוחסנים במאגר נתוני החלבון.

לדוגמה, היישור הקונבנציונלי של מבנים קשורים על בסיס התאמה ריבועית ממוצעת של אטומים תואמים מייצר סדרה של מסלולים מרחביים דומים המונחים זה על זה בערך כאן, 10 המודלים מבוססי התמ"ג של Esia coli, אופרטור O 3D NA הקשורים לחלקי הראש של חלבון מדכא LAC, מיקום העל של אותם מבנים על מסגרת קואורדינטות משותפת על חמשת זוגות הבסיסים הסופיים הראשוניים של כל דופלקס חושף עיוותים ניכרים של המבנה הגלובלי שבו המולקולות מתגמשות בכיוונים שונים במידה ניכרת. השונות המבנית עשויה להשפיע על הקלות שבה חלבון מדכא ה-CIA coli LAC נקשר ל-O שלוש וגורם ללולאה בין O שלוש למפעילים מרוחקים ברצף בפעולת ה-LAC. כפי שמודגם כאן, למיקום המדויק של חלבון ארכיטקטוני כמו HBB מ-Borrelia burgdorferi יכולה להיות השפעה דרמטית על הקיפול הכולל של ה-DNA.

אם שני עותקים של המבנה הידוע ברזולוציה גבוהה מופרדים על ידי 43 זוגות בסיסים, זוג בסיסים של 81, שבר ה-DNA נסגר לתצורה הדוקה, כמעט מעגלית. אם שני החלבונים מופרדים על ידי חמישה זוגות בסיסים נוספים, ה-DNA עוקב אחר מסלול מתפתל פתוח. הסידורים השונים מאוד של הדופלקס המעוטר בחלבון מראים כיצד המרווח של חלבונים אדריכליים יכול להשפיע על המחזוריות או הלולאה של ה-DNA לאחר התפתחותו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה המבנית של חומצות הגרעין לחקור אינטראקציות חלבון DNA, RNA, קיפול ועיצוב ננו-חלקיקים על מנת להשיג הבנה טובה יותר של פגמים התפתחותיים ומחלות כגון סרטן ולתכנן טיפולים חדשים.