חקר מחסום הניזק לדנ"א באמצעות

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור את נקודת הבקרה של נזקי ה-DNA באמצעות תמציות ביצים של xip כדגם מחקרי. ראשית, הכינו תמצית במהירות נמוכה מביצי xip. לאחר מכן, הכינו כרומטין של זרע פגום באמצעות גישות לגרימת נזק ל-DNA כגון MMS ואור UV.

הכינו גם את המבנה המדמה נזק ל-DNA. השתמשו ב-T 70 כדי להפעיל את נקודת הבקרה של נזק ל-DNA ב-LSE עם כרומטין של זרע פגום או ב-T 70. בסופו של דבר, תוצאות מה-blots יכולות לספק תובנות לגבי נקודת הבקרה של נזק ל-DNA המתווכת על ידי a TR check one בתמצית ביצים של xenopus.

שלום לכולם. אני CH Y מהמחלקה לביולוגיה ב-UNC Charlotte. היום נראה לכם כיצד משתמשים בתמצית מוגלה כמערכת מודל לחקר הנזק בסיגנלינג של tech point.

שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום האי-יציבות הדינמית, כגון האופן שבו מופעל נקודת הבקרה של נזקי ה-DNA. פרוטוקול זה מיועד להכנת תמצית ביצי של opus וכן להכנת ריאגנטים המשרים את נקודת הבקרה של נזקי ה-DNA, ולניתוח של נקודת הבקרה של נזקי ה-DNA ו-xap. טכניקות אלו ניתנות להתאמה למגוון גישות לגרימת נזק ל-DNA, כולל four NQO ואטופוסיד.

כדי לחקור את נקודת הבקרה של נזקי ה-DNA, נתחיל בתהליך. כדי להכין את נקבות הצפרדעים להטלת ביצים, יש להזריק לתאי הלימפה הגביים (dorsal lymph sacs) 100 units של PMSG תת-עורית. לאחר המתנה של יומיים לפחות מההכנה, יש להשרות את הטלת הביצים על ידי הזרקה תת-עורית של 500 units של human chorionic gonadotropin לכל צפרדע מוכנה בתוך תאי הלימפה הגביים. יש להדגיר את הצפרדעים המוזרקות למשך 14 עד 20 שעות בדליים נפרדים המכילים שני ליטרים של Marx modified ringer solution.

הוציאו את הצפרדעים מהדליים ושפכו את תמיסת ה-MMR עד שיישארו כ-100 milliliters. לאחר מכן, העבירו את הביצים מהדליים לכלי כימי (beaker) של 250 milliliter והסירו את הג'לי מהביצים על ידי הוספת 100 milliliters של 2% cysteine pH 7.8 בערך כל 30 שניות. ערבבו בעדינות את הביצים באמצעות פיפטת פסטור מזכוכית הפוכה בקוטר של 0.7 centimeters, שפכו את הנוזל והחליפו אותו ב-cysteine טרי פעמיים.

תהליך ה-de detailing יושלם תוך כ-5 עד 15 דקות. כאשר הביצים יוצרות שכבה דחוסה יותר בתחתית הביקר, לאחר השלכת תמיסת ה-cysteine, שטפו את הביצים שלוש פעמים עם תמיסת 0.25 XMMR. ערבלו את הביצים בעזרת פיפטת זכוכית ובדקו אם קיימות ביצים פגומות, לבנות ונפוחות, הנוטות להצטבר במרכז הביקר.

הסר את הביצים הפגומות באמצעות פיפטת פסטור. לאחר מכן, שטוף את הביצים שלוש פעמים בבuffer לליזת ביצים. הסר ביצים פגומות נוספות, ולאחר מכן שפוך את הביצים למבחנת פלקון בנפח 14 milliliter.

דחסו את הביצים באמצעות סרכוז למשך 55 שניות ב-188$\times$g. באמצעות צנטריפוגה שולחנית קלינית עם רוטור בעל דליים נדנדים, הסירו את תמיסת ה-puffer העודפת שמעל שכבת הביצים. כעת, עבור כל מיליליטר של ביצים דחוסות, הוסיפו 0.5 $\mu$L של aprotinin, leptin או AL בריכוז 10 mg/mL ו-0.5 $\mu$L של cytokine B או cyto B בריכוז 5 mg/mL. סרכזו את הביצים ב-16,500$\times$g למשך 15 דקות ב-4 °C. השתמשו בצנטריפוגה Sarva RC six plus super speed עם רוטור HB six בעל דליים נדנדים. לאחר הסרכוז, הביצים מופרדות לשלוש שכבות בתוך המבחנה: תמצית ליפידים ופיגמנט חלמון, מהחלק העליון לתחתון בהתאמה. נקבו את דופן מבחנת הפאלקון בחלק התחתון של שכבת התמצית האמצעית באמצעות מחט בכיול 21G.

הסר בזהירות את המחט, שכן ייתכן שהמחט שביצעה את הדקירה נחסמה על ידי פלסטיק. הכנס מחט חדשה במידה 21 G המחוברת למזרק של 1 ml לאתר הדקירה, כדי לאסוף את התמצית.

שאבו באיטיות את התמצית, תוך הימנעות מבועות אוויר ומזיהום משכבות הליפידים ופיגמנט החלמון. העבירו את התמציות למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter מקוררת. עבור כל milliliter של תמצית ביצה, הוסיפו 10 microliters של 10 milligrams per milliliter.

סיקלוהקסימיד (Cycloheximide) בנפח של 1 µL בריכוז של 10 mg/mL. פרונין لپטין (pronin leptin) בנפח של 1 µL בריכוז של 5 mg/mL, ציטוקין B בנפח של 1 µL בריכוז של 1 M DTT ו-0.33 µL בריכוז של 10 mg/mL. יש לערבב על ידי הפיכה של תמצית הביצה לפחות 10 פעמים בעדינות, אך יש להשתמש בתמצית במהירות שכן איכות ה-LSE נפגעת לאחר ארבע שעות.

לאחר ארבע שעות או הפשרה חופשית, המס את שני האוליגונוקלאוטידים הסינתטיים במים בריכוז של 2 µg/µL. הוסף 100 µL מכל אוליגו למבחנה של מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 mL והדגר למשך חמש דקות בבלוק חימום בטמפרטורה של 95 °C. הוצא את בלוק החימום עם המבחנה המכילה את תערובת האוליגואים והשאר אותה להתקרר לטמפרטורת החדר; חלק לאליקוטים של 10 µL לאחסון בטמפרטורה של 20- °C.

דגימת ה-AL היא כעת דופלקס A T 70 בריכוז סופי של 2 µg/µL. הכין כרומטין של זרע נורמלי כפי שתיארו Tudor ו-Walter עבור 0.5 mL של כרומטין. הוסף 5.5 µL של MMS בריכוז 9.1 M.

הנח את מבחנת הדגימה על רוטטור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות תוך שימוש בצנטריפוגה קלינית IE CCL two עם רוטור מסוג swinging bucket ומתאמי מבחנות. סובב את הדגימה ב-686 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השלף את העלייה (supernatant) ושטוף את המשקע ב-0.5 milliliters של בופר X המכיל B-S-A-D-T-T-A proin ו-leptin.

חזור על תהליך זה שלוש פעמים והשהה מחדש את המשקע ב-0.5 milliliters של Buffer x. קבע את ריכוז כרומטין הזרע באמצעות hemo cytometer.

לאחר מכן, דללו את הדגימה ל-100,000 תאי זרע למיקרוליטר ואחסנו מנות של 5 µL בטמפרטורה של 80°C-

השתמש בכרומטין של הזרע שעבר טיפול ב-UV באופן מיידי כדי להשרות נקודת בקרה של נזק ל-DNA בתמצית במהירות נמוכה (LSE) שהוכנה. ערבב 50 microliters של LSE, microliter אחד של תערובת אנרגיה ושני microliters של כרומטין של זרע פגום. דגרי את התגובה בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות, תוך הקפדה על נקישה (flicking) של המבחנה מדי 10 דקות לאחר 30 דקות לפחות.

במהלך האינקובציה, טפטפו מיקרוליטר אחד של תערובת התגובה על סלייד של מיקרוסקופ והוסיפו מיקרוליטר אחד של תמיסת nuclear dice. הניחו זכוכית כיסוי ובדקו את היווצרות הגרעינים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה. בדרך כלל, גרעינים עגולים ייווצרו לאחר 30 דקות של אינקובציה, דבר המעיד על כך ששכפול ה-DNA החל.

בנוסף, יש להעריך 10 µL מתערובת התגובה באמצעות immuno blotting באמצעות נוגדני anti check one. ערבבו 50 µL של LSE, 1 µL של תערובת energy ו-1.6 µL של מלאי toto mycin במבחנת מיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן, הוסיפו 1.25 µL של T 70 DNA duplex בריכוז 2 µg/µL, או מים עבור הביקורת השלילית.

דגרו את התגובות בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות ונערה בעדינות את מבחנות התגובה בכל 10 דקות. כעת, הוסיפו 10 µL מתערובת התגובה ל-90 µL של באפר דגימות (sample buffer) לצורך אנליזת western blot של חלבון check one. כרומטין של תאי זרע פגומים או מבנה המדמה נזקי DNA מפעילים ביעילות את נקודת הבקרה לנזקי DNA המתווכת על ידי ATR check one במערכת תמצית ביצי xop, בהשוואה להשראה הנגרמת על ידי MMS בביקורת.

בדוק את הפוספורילציה של Checkpoint 1 ב-Ser344, המהווה אינדיקטור להפעלה של TR kinase. באופן דומה, T70, המשמש כמבנה המדמה נזק ל-DNA, מעורר אף הוא פוספורילציה של Checkpoint 1. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים את הכנת ה-LSE בתוך כשעה.

מכיוון שאיכות התמצית פוחתת לאחר כארבע שעות, מהירות ויעילות הן חיוניות. ניתן לשלב שיטות אלו עם גישות אחרות כדי לענות על שאלות קריטיות בנוגע לאיתות של נקודות בקרה של נזקי DNA. לדוגמה, ניתן לבצע דילול אימונולוגי (immuno depletion) כדי לבחון אם חלבון מטרה נחוץ בנקודת הבקרה של נזקי ה-DNA.

לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן חקר נקודת הבקרה של נזק D תוך שימוש בתמצית pus כמערכת מודל. תודה לצפייתכם ובהצלחה בניסוי שלכם.