Name: חקר מחסום הניזק לדנא באמצעות Xenopus תמציות ביצה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: חקור את מחסום הנזק ל-DNA באמצעות תמציות ביצה של Xenopus. הפרוטוקול כולל הכנת תמציות, יצירת נזק באמצעות MMS ו-UV, והפעלת מסלול ATR-Chk1 לחקר יציבות גנומית ותהליכי תיקון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי כספים הניתנים על ידי אוניברסיטת צפון קרוליינה בשארלוט, קרן יסוד Wachovia למצוינות סגל, ומענק מNIGMS (R15GM101571).

1. הכנת LSE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפרדעי נשים (Xenopus laevis) מוזרקות פעמים לאיסוף ביצים. הזריקה הראשונה (יחול) היא 100 U PMSG (Mare הסרום גונדוטרופין הריון) לצפרדע. צפרדעים חייבות להיות דרוכות לפחות ימים לפני ביצת גרימת הנחת וצפרדעים דרוכות הן שמישות לתקופה של עד שבועות. לצפרדעי ממשלה, להזריק PMSG תת עורית בגב הצ&#39;קים הלימפה באמצעות מזרק 3 מ&quot;ל ומחט 27 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לגרום להטלת ביצים, להזריק 500 U (gonadotrophin כוריוני האנושי) hCG לצפרדע דרוכה תת עורי בגב הצ&#39;קים הלימפה באמצעות מחט 27 G. דגירת צפרדעים הזריקו בדלי נפרד המכיל 2 ליטר של הפתרון של 1x מארק modified של רינגר (MMR). אפשר צפרדעים 14-20 שעות כדי להטיל את ביצים לפני שהאוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצפרדעים מהדליים ולשפוך את פתרון MMR עד לסביבות 100 מ&quot;ל שנותר. להשיג ביצים מהדליים ידי העברת ביצים לכוס 250 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצי Dejelly ידי הוספת 100 מ&quot;ל של ציסטאין 2% (להתאיםpH ל -7.8 עם 10 M KOH). ערבלו בעדינות את הביצים עם pipet הפוך זכוכית פסטר (0.7 סנטימטרי קוטר) בערך כל שנייה 30. למזוג ולהחליף עם ציסטאין הטרי פעמים במהלך דגירה. תהליך dejellying יושלם בכ 5-15 דקות, כאשר את הביצים ליצור שכבה מרוכזת יותר בתחתית הכוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את פתרון ציסטאין ולשטוף ביצים שלוש פעמים עם MMR 0.25x. לערבל את הביצים בפתרון על ידי pipet זכוכית. ביצים &quot;רעות&quot; נקבעות על ידי בדיקה ויזואלית פשוטה ולבן &quot;נפוח&quot; בהופעה. את הביצים &quot;הרעות&quot; תצטברנה במרכז הכוס לאחר מתערבל. הסר ביצים &quot;רעות&quot; על ידי pipet פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הביצים עם ביצת תמוגה חוצצת (ELB) שלוש פעמים. הסר את כל ביצים נוספות &quot;רעות&quot; על ידי pipet פסטר. יוצק את הביצים לתוך צינור 14 מ&quot;ל פלקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צינור פלקון עבור 55 שניות ב188 XG (1,100 סל&quot;ד) באמצעות צנטריפוגות הקלינית CL2 IEC טבלה העליונה עם הרוטור דלי מתנדנד לדחוס את הביצים. הסר חיץ עודף מעליון של שכבת הביצה. הוסף 0.5 μl של / מניות Aprotinin Leupeptin ו -0.5 μl של מניית B Cytochalasin למ&quot;ל של ביצים דחוסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ביצים ב16500 XG (10,000 סל&quot;ד) במשך 15 דקות ב 4 ° C באמצעות Sorvall RC6 תוספת צנטריפוגה SuperSpeed ​​עם הרוטור הדלי HB6 מתנדנד. לאחר צנטריפוגה, ביצים מופרדות לשלוש שכבות בצינור: שומנים, חילוץ וחלמון / פיגמנט מלמעלה עד למטה, בהתאמה. לנקב את הצד של צינור פלקון בחלק התחתון של שכבת תמצית האמצע עם מחט 21 G. מוציא בזהירות את המחט כפי שהכשילה את מחט הניקוב בפלסטיק. הכנס מחט טריה 21 G מחוברת למזרק 1 מ&quot;ל לאתר לנקב לאסוף את התמצית. לאט לשאוב לתוך מזרק התמצית, כדי למנוע בועות אוויר וזיהום מים עם השומנים וחלמון / פיגמנט שכבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את התמציות לתוך צינור microcentrifuge מצונן 1.5 מ&quot;ל. לכל מ&quot;ל של תמצית ביצים, להוסיף את פתרוני המניות הכימיות הבאים לריכוז סופי dicated (בסוגריים): (1) 10 Cycloheximide μl (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל); (2) 1 μl Aprotinin / Leupeptin (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​כל אחד); (3) 1 μl Cytochalasin B (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ); (4) 1 Dithiothreitol μl (מ&quot;מ 1); ו( 5) Nocodazole μl 0.33 (3 מיקרוגרם / מ&quot;ל). הפוך את הביצה לחלץ לפחות 10 פעמים בעדינות. זה LSE, שחייבת להתבצע טרי ולהשתמש בו בתוך 4 שעות. איכות LSE נפגעת לאחר 4 שעות או הקפאה, הפשרה. </li></ol> 2. טיפול בכרומטין הזרע עם DNA גישות לגרום ניזק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הכרומטין זרע התקין על פי השיטה שתוארה בעבר 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הכרומטין זרע MMS טופל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הכרומטין זרע נורמלי ב0.5 מ&quot;ל המאגר X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ~ 5.5 μl של MMS (9.1 מ &#39;במלאי) עד 500 μl resuspended הכרומטין לריכוז סופי של 100 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הכרומטין זרע בצינור microcentrifuge בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות ברוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מ &#39;צינור icrocentrifuge ב686 XG (2,100 סל&quot;ד) למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר באמצעות צנטריפוגות הקלינית IEC CL2 עם הרוטור דלי מתנדנד ומתאמי צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלול ב 0.5 מ&quot;ל של ההצפה X בתוספת BSA (3%), DTT (0.1 מ&quot;מ) וAprotinin / Leupeptin (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים (4) ו (5) פעמים כדי לשטוף את הכרומטין הזרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הריכוז של הכרומטין זרע עם hemocytometer ולדלל ל100.000 זרע / μl. שמור 5 aliquots μl במקפיא ° C -80 לשימוש נוסף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הכרומטין הזרע UV טופל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף סכום רצוי (10 μl למשל) של הכרומטין הזרע התקין על פני השטח של פיסת Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח Parafilm לcrosslinker UV. הגדרת פרמטר רצוי אנרגיה, בהתאם לניסוי שלך, ולהתחיל לפגוע הכרומטין הזרע באמצעות אור UV. לדוגמה, זה לוקח כ 21 שניות כדי להגיע ל1000 J / מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר UV irradiation הכרומטין, UV טופל הזרע יש להוסיף לתמציות ביצים באופן מיידי. </li></ol></li></ol> 3. הכנת מבנה ה-DNA ניזק מחקים (AT70) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמס 2 oligonucleotides הסינטטי פולי-(DA) 70 (מיועד כA70) ופולי-70 (dT) (מיועד כT70) במים לריכוז של 2 מיקרוגרם / μl, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של A70 ו 100 μl של T70 לצינור microcentrifuge 1 1.5 מ&quot;ל. מרתיח פתרון מעורב סינטטי Oligo למשך 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס בheatblock. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח בלוק האמבטיה היבשה החוצה (עם הצינור המכיל תערובת AT בו), ולתת לו להתקרר לטמפרטורת חדר על שולחן מעבדה. התאמת טמפרטורה זה לוקחת בערך 45-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התערובת המקוררת היא AT70 עם ריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / μl. 10 μl החנות של AT70 aliquots ב-20 ° C מקפיא לשימוש נוסף. </li></ol> 4. מפעיל מחסום הניזק לדנ&quot;א בLSE עם הכרומטין זרע הפגום או ניזק לדנ&quot;אמחקי מבנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחסום לגרום ניזק לדנ&quot;א בLSE בכרומטין זרע פגום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של LSE לצינור microcentrifuge מ&quot;ל 1.5 ומשלים אותו עם μl 1 מתוך תערובת אנרגיה ו2 μl של הכרומטין זרע הפגום (ריכוז סופי ~ 4000 זרע / תגובת μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת צינור התגובה בטמפרטורת חדר למשך 90 דקות ולהעיף את הצינור כל 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר μl 1 מתוך תערובת תגובה לשקופית מיקרוסקופ השלימה עם μl 1 מתוך פתרון לצבוע גרעיני לאחר דגירה 30-דקות. הנח תלוש כיסוי מעל תערובת התגובה ולבדוק להיווצרות גרעינים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדרך כלל, גרעיני סיבוב יהוו לאחר 30 דקות של דגירה, המציין שכפול הדנ&quot;א יזם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 10 μl של תערובת התגובה ל90 μl של חיץ מדגם. דגימות מנותחות באמצעות immunoblotting באמצעות אנטי Chk1 P-S344 או נוגדנים כנגד Chk1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום ניזק לדנ&quot;א במחסום עם LSEAT70 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של LSE לצינור microcentrifuge מ&quot;ל 1.5 בתוספת עם μl 1 מתוך תערובת אנרגיה ו -1.6 μl מניות Tautomycin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.25 μl של AT70 המוכן מראש (2 מיקרוגרם / μl) או מים (כשליטה שלילית) לכל תגובה. דגירה את התגובות בטמפרטורת חדר במשך 90 דקות. פליק צינורות התגובה כל 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של תערובת התגובה ל90 μl של חיץ מדגם. דגימות נבדקות באמצעות immunoblotting באמצעות אנטי Chk1 P-S344 או נוגדנים כנגד Chk1. </li></ol></li></ol> 5. נציג תוצאות הכרומטין הזרע הפגום או מבנה ה-DNA ניזק מחקים יכול לגרום הניזק לדנ&quot;א מחסום ATR/Chk1-mediated במערכת תמצית ביצת Xenopus. מופעי 2A דמות שMMS גורם Chk1 זירחון בSer344 (Chk1 P-S344), המהווה אינדיקטור הפעלת קינאז ATR. 2B האיור מראה כי AT70, כמו ה-DNA ניזק מחקי struצלום, גם מפעיל Chk1 זרחון. דגימות Chk1 סך הכל משמשות כטעינת פקדים בשתי הדוגמות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig1.jpg" /> איור 1. תרשים של איתות מחסום הניזק לדנ&quot;א. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig2.jpg" /> איור 2. Chk1 זירחון מושרה על ידי אחד MMS או AT70 טיפולים בתמציות Xenopus ביצים. () הזרע הכרומטין MMS שהניזוק (MMS) או הכרומטין הזרע הנורמלי (קון) מודגרת בתמציות ביצים עבור 90 דקות. Chk1 זירחון בSer344 (Chk1 P-S344) וChk1 המוחלט בתמציות ביצה נבחנים דרך immunoblotting. (ב) AT70 או מים (קון) מתווסף לתמציות ביצה, בהתאמה. דוגמאות גם מנותחות באמצעות immunoblotting כמו ב().

<ol><li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li>
<li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR%3A+an+essential+regulator+of+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li>
<li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li>
<li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li>
<li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li>
<li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li>
<li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li>
<li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li>
<li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li>
<li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claspin%2C+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li>
<li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li>
<li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li>
<li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891(2008).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

ישנם מספר יתרונות בלימוד מחסום הניזק לדנ&quot;א באמצעות תמציות Xenopus ביצים. השימוש בתמציות ביצה מספק כמות גדולה של תמציות תא חינם מסונכרנות בשלבי ביניים של מחזור התא. ניתן תמציות הביצים בקלות ובזול. זה יחסית קל לפגוע DNA או הכרומטין ולחשוף פגם במחסום הניזק לדנ&quot;א לאחר immunodepleting חלבון מטרה מתמצית ביצה. בהמשך, פגם פונקציה פוטנציאלית ניתן &quot;הציל&quot; על ידי addback מסוג בר או חלבונים רקומביננטיים מוטציה. לכן, Xenopus ביצת התמצית היא מערכת מודל רבת ע...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> ריאגנטים </td></tr><tr><td> Anti-P-S344 Chk1 נוגדן </td><td> איתות תא </td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן אנטי Chk1 </td><td> סנט קרוז </td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinin </td><td> Biomedicals MP </td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> סיגמא </td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td> Cytochalasin B </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCG </td><td> סיגמא </td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-ציסטאין </td><td> סיגמא </td><td> C7352-1 ק&quot;ג </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptin </td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td> מתיל methanesulfonate (MMS) </td><td> סיגמא </td><td> 129925-5G </td><td></td></tr><tr><td> Nocodazole </td><td> סיגמא </td><td> M1404-2MG </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> חיץ מדגם </td><td> סיגמא </td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycin </td><td> Wako כימיקלי ארה&quot;ב </td><td> 209-12041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד </td></tr><tr><td> דלי להטלת ביצים </td><td> מוצרי Rubbermaid המסחריים </td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td> צנטריפוגה CL2 IEC עם הרוטור דלי מתנדנד </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> הרוטור דלי HB6 נדנוד </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11860 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RC6 תוספת צנטריפוגה SuperSpeed </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46910 </td><td></td></tr><tr><td> crosslinker UV </td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> פתרונות </td></tr><tr><td> 1x MMR </td><td></td><td></td><td> 100 המ&quot;מימ NaCl, 2 המ&quot;מ KCl, 0.5 mM 4 MgSO, 2.5 המ&quot;מ CaCl 2, 5 HEPES מ&quot;מ, להתאים pH ל -7.8 עם 10 M NaOH </td></tr><tr><td> Aprotinin / מניות Leupeptin </td><td></td><td></td><td> 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​כל אחד במים. אחסן 20 aliquots μl ב -80 ° C. </td></tr><tr><td> X החיץ </td><td></td><td></td><td> סוכרוז 0.2 מ &#39;, 80 המ&quot;מ KCl, 15 המ&quot;מ NaCl, 5 המ&quot;מ MgCl 2, 1 mM EDTA, 10 HEPES מ&quot;מ, להתאים pH ל -7.5 ידי HCl </td></tr><tr><td> מניית Cycloheximide </td><td></td><td></td><td> 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במים. החנות 1 aliquots המ&quot;ל ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> Cytochalasin B המניות </td><td></td><td></td><td> 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בDMSO. אחסן 20 aliquots μl ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> מניית Dithiothreitol (DTT) </td><td></td><td></td><td> M 1 במים. החנות 1 aliquots המ&quot;ל ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> 0.25 סוכרוז M, 1 mM DTT, 50 מיקרוגרם / המ&quot;ל cycloheximide, 2.5 המ&quot;מ MgCl 2, 50 mM KCl, 10 HEPES מ&quot;מ, pH7.7 </td></tr><tr><td> Nocodazole המניות </td><td></td><td></td><td> 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בDMSO. אחסן 5 aliquots μl ב -80 ° C. </td></tr><tr><td> תערובת אנרגיה </td><td></td><td></td><td> פוספט 375 מ&quot;מ קריאטין, 50 mM ATP, ו25 מ&quot;מ MgCl 2. Aliquots נשמרים ב-80 ° C. </td></tr><tr><td> פתרון לצבוע גרעיני </td><td></td><td></td><td> 0.4 מיקרוגרם / המ&quot;ל Hoechst 33258, גליצרול 25%(V / v), ב1x PBS </td></tr><tr><td> מניית Tautomycin </td><td></td><td></td><td> 100 מיקרומטר בDMSO. אחסן 10 aliquots μl ב -80 ° C. </td></tr></tbody></table>

חקר מחסום הניזק לדנ&quot;א באמצעות<em&gt; xenopus</em&gt; תמציות ביצה

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

על בסיס יומי, תאים נחשפים למגוון של עלבונות אנדוגניים וסביבתיים. כדי להתמודד עם העלבונות האלה, תאים התפתחו מחסום ניזק לדנ&quot;א איתות כמנגנון מעקב לחוש ניזק לדנ&quot;א ותגובות תאיות ישירות לניזק לדנ&quot;א. ישנן מספר קבוצות של חלבונים הנקראים חיישנים, מתמר וגורמים מעורבים באיתות מחסום ניזק לדנ&quot;א (איור 1). במסלול איתות מורכבת זו, ATR (כספומט וRad3 קשור) הוא אחד מקינאזות העיקרית שיכול להגיב לניזק לדנ&quot;א, ומתח שכפול. הפעיל ATR יכול phosphorylate מצעי מורדה כגון Chk1 (קינאז מחסום 1). כתוצאה מכך, פוספורילציה והפעיל Chk1 מוביל לתופעות רבות במורד מחסום הניזק לדנ&quot;א, כוללים מעצר מחזור תא, הפעלת שעתוק, תיקון ניזק לדנ&quot;א, ואפופטוזיס או הזדקנות (איור 1). כאשר ה-DNA פגומה, שלא הצליח להפעיל את תוצאות מחסום הניזק לדנ&quot;א בunrepניזק שודר, ועקב כך חוסר יציבות, הגנומי. המחקר של מחסום הניזק לדנ&quot;א יבהיר כיצד תאים לשמור על שלמות גנטית ולספק הבנה טובה יותר של איך מחלות אנושיות, כגון סרטן, להתפתח. תמציות Xenopus laevis ביצה מתגלות כמערכת חזקה תא חינם תמצית מודל במחקר מחסום ניזק לדנ&quot;א. תמצית מהירות נמוכה (LSE) בתחילה תארה Masui קבוצת 1. התוספת של הכרומטין הזרע demembranated לתוצאות LSE בהיווצרות גרעינים שבו DNA משוכפל באופנת semiconservative פעם אחת בכל מחזור התא. מסלול איתות מחסום ATR/Chk1-mediated מופעל על ידי ניזק לדנ&quot;א או מתח כפול 2. שתי שיטות עיקריות משמשת כיום כדי לגרום הניזק לדנ&quot;א מחסום: גישות מזיקות DNA ומבני ניזק-DNA מחק 3. ניזק לדנ&quot;א יכול להיגרם על ידי קרינת אולטרה סגולה (UV), γ-קרינה, מהתיל methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-התחמוצת (4-NQO), או aphidicolin 3, 4. MMS הוא סוכן אלקילציה שמעכב שכפול הדנ&quot;א ומפעיל את מחסום הניזק לדנ&quot;א ATR/Chk1-mediated 4-7. קרינת UV גם מפעילה 8 מחסום הניזק לדנ&quot;א ATR/Chk1-dependent. מבנה ה-DNA ניזק מחקי AT70 הוא מורכב משני annealed oligonucleotides פולי-(DA) 70 ופולי-70 (dT). AT70 המערכת פותחה במעבדתו של ביל דאנפי ונמצאת בשימוש נרחב כדי לגרום ATR/Chk1 איתות מחסום 9-12. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים (1) כדי להכין תמציות ביצת תא חינם (LSE), (2) לטיפול בכרומטין זרע עם DNA Xenopus שתי שונים לפגוע גישות (MMS ו UV), (3) כדי להכין את מבנה ה-DNA ניזק המחקים AT70, ו( 4) כדי לעורר את מחסום הניזק לדנ&quot;א ATR/Chk1-mediated בLSE בכרומטין זרע פגום או מבנה ה-DNA ניזק מחקים.

Xenopus ביצת התמצית היא מערכת מודל שימושית לחקור מחסום הניזק לדנ&quot;א. פרוטוקול זה מיועד להכנת תמציות ביצת Xenopus ריאגנטים ישכנעו מחסום ניזק לדנ&quot;א. טכניקות אלה הן התאמה למגוון של גישות מזיקות DNA במחקר של איתות מחסום הניזק לדנ&quot;א.

חקר מחסום הניזק לדנ&quot;א באמצעות<em&gt; Xenopus</em&gt; תמציות ביצה

על בסיס יומי, תאים נחשפים למגוון של פגיעות אנדוגניות וסביבתיות. כדי להילחם בפגיעות אלו, פיתחו התאים מנגנוני תיקון נזקי DNA...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור את נקודת הבקרה של נזקי ה-DNA באמצעות תמציות ביצים של xip כדגם מחקרי. ראשית, הכינו תמצית במהירות נמוכה מביצי xip. לאחר מכן, הכינו כרומטין של זרע פגום באמצעות גישות לגרימת נזק ל-DNA כגון MMS ואור UV.הכינו גם את המבנה המדמה נזק ל-DNA. השתמשו ב-T 70 כדי להפעיל את נקודת הבקרה של נזק ל-DNA ב-LSE עם כרומטין של זרע פגום או ב-T 70. בסופו של דבר, תוצאות מה-blots יכולות לספק תובנות לגבי נקודת הבקרה של נזק ל-DNA המתווכת על ידי a TR check one בתמצית ביצים של xenopus.שלום לכולם. אני CH Y מהמחלקה לביולוגיה ב-UNC Charlotte. היום נראה לכם כיצד משתמשים בתמצית מוגלה כמערכת מודל לחקר הנזק בסיגנלינג של tech point.שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום האי-יציבות הדינמית, כגון האופן שבו מופעל נקודת הבקרה של נזקי ה-DNA. פרוטוקול זה מיועד להכנת תמצית ביצי של opus וכן להכנת ריאגנטים המשרים את נקודת הבקרה של נזקי ה-DNA, ולניתוח של נקודת הבקרה של נזקי ה-DNA ו-xap. טכניקות אלו ניתנות להתאמה למגוון גישות לגרימת נזק ל-DNA, כולל four NQO ואטופוסיד.כדי לחקור את נקודת הבקרה של נזקי ה-DNA, נתחיל בתהליך. כדי להכין את נקבות הצפרדעים להטלת ביצים, יש להזריק לתאי הלימפה הגביים (dorsal lymph sacs) 100 units של PMSG תת-עורית. לאחר המתנה של יומיים לפחות מההכנה, יש להשרות את הטלת הביצים על ידי הזרקה תת-עורית של 500 units של human chorionic gonadotropin לכל צפרדע מוכנה בתוך תאי הלימפה הגביים. יש להדגיר את הצפרדעים המוזרקות למשך 14 עד 20 שעות בדליים נפרדים המכילים שני ליטרים של Marx modified ringer solution.הוציאו את הצפרדעים מהדליים ושפכו את תמיסת ה-MMR עד שיישארו כ-100 milliliters. לאחר מכן, העבירו את הביצים מהדליים לכלי כימי (beaker) של 250 milliliter והסירו את הג'לי מהביצים על ידי הוספת 100 milliliters של 2% cysteine pH 7.8 בערך כל 30 שניות. ערבבו בעדינות את הביצים באמצעות פיפטת פסטור מזכוכית הפוכה בקוטר של 0.7 centimeters, שפכו את הנוזל והחליפו אותו ב-cysteine טרי פעמיים.תהליך ה-de detailing יושלם תוך כ-5 עד 15 דקות. כאשר הביצים יוצרות שכבה דחוסה יותר בתחתית הביקר, לאחר השלכת תמיסת ה-cysteine, שטפו את הביצים שלוש פעמים עם תמיסת 0.25 XMMR. ערבלו את הביצים בעזרת פיפטת זכוכית ובדקו אם קיימות ביצים פגומות, לבנות ונפוחות, הנוטות להצטבר במרכז הביקר.הסר את הביצים הפגומות באמצעות פיפטת פסטור. לאחר מכן, שטוף את הביצים שלוש פעמים בבuffer לליזת ביצים. הסר ביצים פגומות נוספות, ולאחר מכן שפוך את הביצים למבחנת פלקון בנפח 14 milliliter.דחסו את הביצים באמצעות סרכוז למשך 55 שניות ב-188$\times$g. באמצעות צנטריפוגה שולחנית קלינית עם רוטור בעל דליים נדנדים, הסירו את תמיסת ה-puffer העודפת שמעל שכבת הביצים. כעת, עבור כל מיליליטר של ביצים דחוסות, הוסיפו 0.5 $\mu$L של aprotinin, leptin או AL בריכוז 10 mg/mL ו-0.5 $\mu$L של cytokine B או cyto B בריכוז 5 mg/mL. סרכזו את הביצים ב-16,500$\times$g למשך 15 דקות ב-4 °C. השתמשו בצנטריפוגה Sarva RC six plus super speed עם רוטור HB six בעל דליים נדנדים. לאחר הסרכוז, הביצים מופרדות לשלוש שכבות בתוך המבחנה: תמצית ליפידים ופיגמנט חלמון, מהחלק העליון לתחתון בהתאמה. נקבו את דופן מבחנת הפאלקון בחלק התחתון של שכבת התמצית האמצעית באמצעות מחט בכיול 21G.הסר בזהירות את המחט, שכן ייתכן שהמחט שביצעה את הדקירה נחסמה על ידי פלסטיק. הכנס מחט חדשה במידה 21 G המחוברת למזרק של 1 ml לאתר הדקירה, כדי לאסוף את התמצית.שאבו באיטיות את התמצית, תוך הימנעות מבועות אוויר ומזיהום משכבות הליפידים ופיגמנט החלמון. העבירו את התמציות למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter מקוררת. עבור כל milliliter של תמצית ביצה, הוסיפו 10 microliters של 10 milligrams per milliliter.סיקלוהקסימיד (Cycloheximide) בנפח של 1 µL בריכוז של 10 mg/mL. פרונין لپטין (pronin leptin) בנפח של 1 µL בריכוז של 5 mg/mL, ציטוקין B בנפח של 1 µL בריכוז של 1 M DTT ו-0.33 µL בריכוז של 10 mg/mL. יש לערבב על ידי הפיכה של תמצית הביצה לפחות 10 פעמים בעדינות, אך יש להשתמש בתמצית במהירות שכן איכות ה-LSE נפגעת לאחר ארבע שעות.לאחר ארבע שעות או הפשרה חופשית, המס את שני האוליגונוקלאוטידים הסינתטיים במים בריכוז של 2 µg/µL. הוסף 100 µL מכל אוליגו למבחנה של מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 mL והדגר למשך חמש דקות בבלוק חימום בטמפרטורה של 95 °C. הוצא את בלוק החימום עם המבחנה המכילה את תערובת האוליגואים והשאר אותה להתקרר לטמפרטורת החדר; חלק לאליקוטים של 10 µL לאחסון בטמפרטורה של 20- °C.דגימת ה-AL היא כעת דופלקס A T 70 בריכוז סופי של 2 µg/µL. הכין כרומטין של זרע נורמלי כפי שתיארו Tudor ו-Walter עבור 0.5 mL של כרומטין. הוסף 5.5 µL של MMS בריכוז 9.1 M.הנח את מבחנת הדגימה על רוטטור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות תוך שימוש בצנטריפוגה קלינית IE CCL two עם רוטור מסוג swinging bucket ומתאמי מבחנות. סובב את הדגימה ב-686 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השלף את העלייה (supernatant) ושטוף את המשקע ב-0.5 milliliters של בופר X המכיל B-S-A-D-T-T-A proin ו-leptin.חזור על תהליך זה שלוש פעמים והשהה מחדש את המשקע ב-0.5 milliliters של Buffer x. קבע את ריכוז כרומטין הזרע באמצעות hemo cytometer.לאחר מכן, דללו את הדגימה ל-100,000 תאי זרע למיקרוליטר ואחסנו מנות של 5 µL בטמפרטורה של 80°C-השתמש בכרומטין של הזרע שעבר טיפול ב-UV באופן מיידי כדי להשרות נקודת בקרה של נזק ל-DNA בתמצית במהירות נמוכה (LSE) שהוכנה. ערבב 50 microliters של LSE, microliter אחד של תערובת אנרגיה ושני microliters של כרומטין של זרע פגום. דגרי את התגובה בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות, תוך הקפדה על נקישה (flicking) של המבחנה מדי 10 דקות לאחר 30 דקות לפחות.במהלך האינקובציה, טפטפו מיקרוליטר אחד של תערובת התגובה על סלייד של מיקרוסקופ והוסיפו מיקרוליטר אחד של תמיסת nuclear dice. הניחו זכוכית כיסוי ובדקו את היווצרות הגרעינים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה. בדרך כלל, גרעינים עגולים ייווצרו לאחר 30 דקות של אינקובציה, דבר המעיד על כך ששכפול ה-DNA החל.בנוסף, יש להעריך 10 µL מתערובת התגובה באמצעות immuno blotting באמצעות נוגדני anti check one. ערבבו 50 µL של LSE, 1 µL של תערובת energy ו-1.6 µL של מלאי toto mycin במבחנת מיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן, הוסיפו 1.25 µL של T 70 DNA duplex בריכוז 2 µg/µL, או מים עבור הביקורת השלילית.דגרו את התגובות בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות ונערה בעדינות את מבחנות התגובה בכל 10 דקות. כעת, הוסיפו 10 µL מתערובת התגובה ל-90 µL של באפר דגימות (sample buffer) לצורך אנליזת western blot של חלבון check one. כרומטין של תאי זרע פגומים או מבנה המדמה נזקי DNA מפעילים ביעילות את נקודת הבקרה לנזקי DNA המתווכת על ידי ATR check one במערכת תמצית ביצי xop, בהשוואה להשראה הנגרמת על ידי MMS בביקורת.בדוק את הפוספורילציה של Checkpoint 1 ב-Ser344, המהווה אינדיקטור להפעלה של TR kinase. באופן דומה, T70, המשמש כמבנה המדמה נזק ל-DNA, מעורר אף הוא פוספורילציה של Checkpoint 1. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים את הכנת ה-LSE בתוך כשעה.מכיוון שאיכות התמצית פוחתת לאחר כארבע שעות, מהירות ויעילות הן חיוניות. ניתן לשלב שיטות אלו עם גישות אחרות כדי לענות על שאלות קריטיות בנוגע לאיתות של נקודות בקרה של נזקי DNA. לדוגמה, ניתן לבצע דילול אימונולוגי (immuno depletion) כדי לבחון אם חלבון מטרה נחוץ בנקודת הבקרה של נזקי ה-DNA.לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן חקר נקודת הבקרה של נזק D תוך שימוש בתמצית pus כמערכת מודל. תודה לצפייתכם ובהצלחה בניסוי שלכם.

study-of-the-dna-damage-checkpoint-using-xenopus-egg-extracts

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Kinetochore שם SAC יוזם האות שלה ניטור הפרדה mitotic של chromatids אחותו. השיטה מתוארת לדמיין את גיוס מחזור של אחד החלבונים kinetochore ותיאום עם תנועה...

לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים סינסיציאלי

שיטה מתוארת לניתוח פירוק חלבונים באמצעות רדיואקטיבי וחלבונים לוציפראז-Fusion בתמצית ביצי Xenopus והתאמת להקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה קטנים של פירוק חלבונים.

הכינון מחדש של השפלה β-catenin ב<em&gt; Xenopus</em&gt; חלץ ביצה

השאלה כיצד הכרומטין רגולטורים ומדינות הכרומטין משפיעה על הגנום in vivo הוא מפתח להבנה של איך מוקדם החלטות גורל התא נעשות בעובר המתפתח שלנו. שבב Seq-הגישה הפופולרית ביותר לחקור תכונות הכרומטין ברמה-הוא גלובלית המפורטים כאן לעוברי צפרדעים.

Snapshot הגנום של רגולטורי הכרומטין והברית ב<em&gt; Xenopus</em&gt; עוברים על ידי שבב Seq

המנגנונים המולקולריים של דה-קונדנסטציה של כרומטין מיטוטי דחוס מאוד אינם מוגדרים כהלכה. אנו מציגים בדיקה נטולת תאים המבוססת על אשכולות כרומטין מיטוטיים שבודדו מתאי HeLa ותמצית ביצי Xenopus laevis המשחזרת נאמנה את תהליך העיבוי במבחנה.

תא Assay חינם לחקר הכרומטין Decondensation בסוף מיטוזה

אנו מציגים שיטה לדור של במבחנה עצמית מתמשכת mitotic תנודות ברמת תא בודד על-ידי לבצע תמציות ביצה של צפרדע רפואית זריזה microemulsions מים בתוך שמן.

שיחזור התנודות מחזור התא ב- Microemulsions של תמציות ביצה ללא תא צפרדע רפואית

בעקבות נזק DNA, תאים אנושיים להפעיל מסלולי תיקון חיוניים כדי לשחזר את שלמות הגנום שלהם. כאן, אנו מתארים את השיטה של חיסון עקיף כאמצעי לזיהוי חלבוני תיקון DNA, לנתח את הגיוס המרחבי והזמני שלהם, ולעזור לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון באתרים של נזק DNA.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

אנו מתארים שיטה להכנה והדמיה חיה של תמציות ציטופלסמיות לא מדוללות מביצי Xenopus laevis .

קסנופוס לאוויס הכנת תמצית ביצים ושיטות הדמיה חיות להדמיית ארגון ציטופלסמי דינמי

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בהדמיה חיה כדי לדמיין את ההשפעות של נזק חמצוני על לוקליזציה ודינמיקה של מבנים תת תאיים בשחלות Drosophila.

הדמיה של ההשפעות של נזק חמצוני על תאי ביצה Drosophila באמצעות הדמיה חיה

מאמר זה מציג שלבים חיוניים של חיסונים ואימונופרציפיטציה של כרומטין. פרוטוקולים אלה משמשים בדרך כלל כדי לחקור תהליכים תאיים הקשורים נזק DNA כדי לדמיין ולכומת את הגיוס של חלבונים מעורבים בתיקון DNA.

הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

שמירה על שלמות גנום הביצית נחוצה כדי להבטיח את הנאמנות הגנטית בעובר המתקבל. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מדויק לאיתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בתאי נבט נקביים של יונקים.

איתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בביציות עכבר

חקור את מחסום הנזק ל-DNA באמצעות תמציות ביצה של Xenopus. הפרוטוקול כולל הכנת תמציות, יצירת נזק באמצעות MMS ו-UV, והפעלת מסלול ATR-Chk1 לחקר יציבות גנומית ותהליכי תיקון.

חקר מחסום הניזק לדנ"א באמצעות

גלה סרטונים נוספים