Name: הדמית pHluorin-תויגה הכנסת קולט לממברנה הפלזמה בנוירונים עכבר מתורבתים ראשיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: למד הדמיה בזמן אמת של הכנסת קולטים לממברנה הפלזמה בנוירונים עכבר מתורבתים ראשיים באמצעות pHluorin-תויגה. שיטה זו מאפשרת מחקר דינמיקת קולטים ותנועת חלבוני ממברנה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי קרני אתחול ממעבדת ג&#39;קסון.

1. הכנת תרבות גליה מאוסה למיזוג תרבות עצבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> T75 צלוחיות מצופות בפתרון קולגן (01:03 דילול Purecol בDDH 2 O). את הצלוחיות נקבעות זקופות והשאירו לייבוש למשך הלילה בברדס תרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ דיסקציה (aCSF: 119 mM NaCl, 5 המ&quot;מ KCl, 1 המ&quot;מ MgCl 2, 30 המ&quot;מימ דקסטרוז, 25 HEPES מ&quot;מ, 7.4 pH, ללא סידן) ותקשורת גליה (DMEM בתוספת 10% FBS, 10 יחידות / המ&quot;ל פניצילין, 10 מיקרוגרם / המ&quot;ל סטרפטומיצין, וGlutamax) מוכנים ומאוחסן ב 4 ° C עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של תרבות גליה, תקשורת גליה היא חממה במשך לפחות 30 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפני הנתיחה של מוח עכבר. עכברים עובריים או ילוד מורדמים באמצעות עריפת ראש מהירה. cortexes מוחיה הם נתחו את הנתיחה תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות מוח גזור מתעכלות בפתרון פפאין (100 המ&quot;ל פפאין וμl% DNase אני 20 1 בחיץ נתיחת מ&quot;ל 2) על 37 מעלות צלזיוס fo20 דקות r. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות עיכול פפאין, רקמות מוח נשטפות עם 10 תקשורת גליה מראש חמם מ&quot;ל. תקשורת גליה הטריה (2 מ&quot;ל) נוספה לאחר מכן לרקמות המוח מתעכלת, ואת הרקמות נכתשה עם זכוכית פיפטה פסטר אש מלוטשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת גליה הטריה (8 מ&quot;ל) הוא הוסיף לרקמות ניתקו. תא מסננת 70 מיקרומטר משמש לסינון השעית הרקמה ניתקה. תאים אז נזרע לתוך צלוחיות T75 (בדרך כלל 2-3 עוברים 1 T75 בקבוקון זרע יכול) ולהציב לתוך 37 מעלות צלזיוס תא תרבות חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, התקשורת מT75 צלוחיות היא aspirated. את הצלוחיות נשטפות עם 10 המ&quot;ל PBS. תקשורת גליה הטריה (10-15 מ&quot;ל) ואז הוא הוסיף לכל בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך 10-12 ימים, גליה בT75 צלוחיות צריכה להיות confluent. תאי גליה נשטפים עם PBS, ו5 מ&quot;ל של טריפסין 0.05% נוספים לכל T75 בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגרת טריפסין על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, תאי גליה הם תאי גלייה וניתקו מכל T75 בקבוק נחלקים לשנייםקולגן מצופים T75 צלוחיות שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדיר תרבות (Millipore PICM03050) מוכנים על ידי צבת אותם לצלחות 6 היטב, ציפוים בקולגן, וייבוש באוויר-בן הלילה. תקשורת גליה (2 מ&quot;ל כל אחת) ממוקמת מתחת לכל תותב תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גליה מT75 צלוחיות confluent הם trypsinized וזרע אל מחדיר התרבות (1 T75 בקבוק לצלחת 6 היטב, 2 מ&quot;ל כל הוספה). מחדיר תרבות גליה אלה ישמשו למצב התרבויות העצביות. </li></ol> 2. תרבות עצבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את coverslips הזכוכית עבור התרבות העצבית מנוקה על ידי שרייה ב70% 3 HNO לפחות לילה. Coverslips מכן שטף עם 2 לפחות 3 פעמים DDH O, ולייבש בתנור Isotemp (&gt; 200 מעלות) למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips ניקה מונחים בצלחת 6-טובה, אחד לכל coverslip היטב. Coverslips מצופים בפתרון פולי-L-ליזין (2 מ&quot;ל, 0.1% בחומצה בורה 100 מ&quot;מימ, pH = 8.5) בלילה 37 מעלות צלזיוס חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">פתרון פולי-L-ליזין הוא להסיר את coverslips וcoverslips נשטפים 3 פעמים עם autoclaved DDH 2 O. Coverslips אז מודגרת ב37 מעלות צלזיוס חממה בלילה בתקשורת ציפוי (Neurobasal להשלים עם סרום 5% חום מומת סוס, 10 יחידות / המ&quot;ל פניצילין, סטרפטומיצין 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל, Glutamax; 2% B27 תוסף מתווסף למדיום הציפוי ביום בו שימוש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום למחרת, תקשורת הציפוי מוסרת ו2 מ&quot;ל של מדיה ציפוי טריה עם B-27 נוסף לכל גם שיש coverslip זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברות הרות (E15-18) מורדמות עם CO 2, ועכברים עובריים מורדמים באמצעות עריפת ראש. ההיפוקמפוס או סטריאטום הוא גזור מרקמת המוח ולהציב לתוך צינור חרוטים 15 מ&quot;ל עם חיץ קר כקרח נתיחה, לתרבות של נוירונים ביפוקמפוס או נוירונים קוצניים בינוניים striatal, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות מוח גזור הן ניתקו עם פפאין כמתואר בשלבי 1.4) ו -1.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Following דיסוציאציה, מספר התאים בכל השעיה עצבית נספר עם hemocytometer. הנוירונים מכן נזרעו על כל coverslip בצפיפות של 0.4 x 10 6 תאים לכל היטב של צלחת 6-היטב, ותרבית ב37 מעלות צלזיוס חממת הלילה (הנוירונים DIV 0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין מחדיר תרבות גליה למיזוג התרבויות העצביות, תקשורת גליה יוסרה ממחדירה תרבות גליה ובינונית ציפוי טרי מתווספת (2 מ&quot;ל ובהוספת 2 מ&quot;ל מתחת למסגרת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת (DIV 1), coverslips עם נוירונים ממוקמים מתחת מחדיר תרבות גליה, coverslip אחד בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנוירונים ניזונים במחצית הנפח של המדיה טריה חומם מראש האכלה (עם B-27) כל 3-4 ימים עד שהם מוכנים לניסויי transfection והדמיה. </li></ol> 3. Transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> transfection העצבי מתבצע באמצעות Lipofectamine 2000. לכל תרבות העצבית (תרבות אחת לכל coverslip), 2 μlLipofectamine 2000 ומיקרוגרם 1 של ה-DNA משמשים. בינוני Neurobasal טרי עם שום תוסף משמש לדילול Lipofectamine וה-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-DNA וLipofectamine מודגרת למשך 20 דקות בטמפרטורת חדר לאחר הערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור 1 מ&quot;ל של תקשורת מכל עלון מתחת תרבות גליה, ו1 מ&quot;ל מתוך כל הוספה, ולהעביר את התקשורת לצינור חרוטים. הוסף את אותו הנפח של תקשורת מלבה + B27 למדיום הציל ולדגור על 37 ° C. בינוני זו משמשת לתרבות עצבית בעקבות transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירת 20-דקות Lipofectamine / דנ&quot;א, מחדירה תרבות גליה יוסרו רגעי מהצלחות 6-כן. תערובת Lipofectamine / דנ&quot;א 200 μl מתווספת לכל coverslip עם הנוירונים. מחדיר תרבות גליה מכן חזר לכל באר, מעל לנוירונים. דור של בועות תחת הקרום של מחדירה התרבות יש להימנע. הנוירונים מודגרת עם תערובת Lipofectamine / דנ&quot;א על ​​37 מעלות צלזיוס במשך 2-4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדואר תקופת 2-4 שעתי דגירה, מוסיפה גליה יוסרה שוב. תקשורת התרבות עם תערובת Lipofectamine / DNA היא תוסר מכל טובה. התקשורת שנשמרה בשלב 3.3) מתווספת לנוירונים (2 מ&quot;ל לטוב). מחדיר תרבות גליה מוחזרים לכל באר, והתקשורת מכל גליה להוסיף מוסרת, ו2 מ&quot;ל של התקשורת מצעד 3.3) הוא הוסיף לכל הוספה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנוירונים בתרבית ל24-72 שעות נוספות כדי לאפשר ביטוי של cDNA transfected לפני TIRF ההדמיה מבוצע על הנוירונים האלה. </li></ol> 4. TIRF הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוזל השדרתי מלאכותי (aCSF: 119 mM NaCl, KCl 2.5 מ&quot;מ, גלוקוז 30 מ&quot;מימ, 2 המ&quot;מ CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 HEPES מ&quot;מ, pH = 7.4) ישמש לניסויים חייה הדמיה. מערכת הדמית TIRF היא מותאם אישית הגדרה עם 100-mW ציאן ליזר לעירור, וחיוב כפל אלקטרוני מצמידי מכשיר מצלמה (EMCCD) לגלאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ניסויי הדמיה, aCSF הוא הזהיר ב37 &amp; dלמשל; אמבט מי C לפחות 30 דקות. להוסיף החימום להדמיה חייה ממוקם על במת מיקרוסקופ, ולהוסיף החימום, ליזר, והמצלמה התחממו לפחות 30 דקות לפני תחילת ניסויי ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip עם הנוירונים transfected הוא כנס לתוך התא חייה ההדמיה. ACSF מראש התחמם הוא ממוקם בתא אחרי התא מורכב; שלב זה אמור להסתיים במהירות אפשרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתא ממוקם על הוספת החימום על במת מיקרוסקופ, הנוירונים transfected מזוהים ויזואלית תחת מצב הדמיה עלית ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר נוירונים בריאים transfected מזוהים (ראה איורים 1 ו 2), אנחנו בדרך כלל לבצע 1 דקות של צילום אקונומיקה כדי לחסל פלואורסצנטי pHluorin קיים מראש על קרום הפלזמה, כמו pHluorin-קולטנים על קרום הפלזמה יש רמות גבוהות מאוד כאשר קרינה TIRF ההדמיה ראשונה התחילה, אשר מפריע להדמיה של תוספות אישיותאירועי ertion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות photobleach, הגדרת מכפיל הרווח של האלקטרון במצלמת EMCCD מוגדרת למקסימום, וההקלטה מתבצעת על דקות 1 ב 10 רץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הקלטה תכיל 600 תמונות. אירועי הכנסה מזוהים בשמם על ידי משחק חזרה ההקלטה באמצעות ImageJ. אירועי החדרה בודדים מנותחים באופן ידני באמצעות ImageJ. </li></ol> 5. נציג תוצאות התרבות העצבית העקבית היא המפתח לניסויים מוצלחים חייה הדמיה. איור 1 מציג נוירונים ביפוקמפוס עכבר התרבית באמצעות פרוטוקולנו בין 11 ל DIV דיב 18. זה ברור מהתמונות שהנוירונים פתחו תהליכים נרחבים וכי התהליכים דנדריטיים מכוסים בצפיפות עם קוצים הדנדריטים, סימנים שהנוירונים האלה הם בריאים בתרבות. פרוטוקול התרבות שלנו יכול לשמש גם לסוגים אחרים של תאי עצב במוח. לדוגמה, לאחרונה שימוש בפרוטוקול זה לתרבותהנוירונים striatal בינוניים קוצניים במחקר במטרה לבחון הקולטן D2 דופמין (DRD2) כניסה בנוירונים בתרבית עכבר striatal בינוני קוצני 9. איור 2 מראים נוירונים קוצניים בינוניים striatal עכבר תרבית באמצעות פרוטוקולנו בDIV 8. יש לנו גם בצע בהצלחה TIRF הדמיה של DRD2s pHluorin המתויג-superecliptic בסוג זה של תא עצב. איור 3 מציג ביטוי של pHluorin מתויג-DRD2 (pH-DRD2) בנוירון בינוני קוצניים ויזואליזציה של pH-DRD2 כניסה בתא עצב זה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig1.jpg" /> איור 1. תרבות היפוקמפוס עכבר תוך שימוש בשיטת תרבות הממשק. DIV: ימים במבחנה, ביום של התרבות נחשב DIV 0. מהתמונות ניכר כי נוירונים ביפוקמפוס הבוגרים בסוג זה של התרבות שבין 11 ל 15 DIV DIV. בשעת 11 וDIV 13, הדנדריטים עצביים מכוסים בקוצי filipodia ולא בשלים. בגיל 15 וDIV18, הדנדריטים עצביים מכוסים בקוצים גדולים, אינדיקציה של נוירונים בוגרים יותר. לוחות שמאל:-הגדלה נמוכה תמונות של נוירונים ביפוקמפוס עכבר בגילים שונים. לוחות נכונים: תמונות בהגדלה גדולה (זום על הדנדריטים עצביים של הפנל השמאלי) של תהליכים דנדריטיים עצביים עם קוצים הדנדריטים בגילים שונים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig2.jpg" /> איור 2. התרבות המאוסה striatal הבינוני הקוצנית נוירון בשיטת תרבות הממשק. הנוירונים שבתמונות הם בDIV 8. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig3.jpg" /> איור 3. נוירון עכבר striatal הבינוני הקוצני transfected עם סופר קולט האקליפטית pHluorin מתויג-דופמין D2 (pH-DRD2). תמונה מהשמאל היא הקרנת עוצמתו מרבית של הקלטת זמן לשגות (600 תמונות, 100 אלפית שני לכל תמונה). ראשי חץ לבנים מצביעים על החדרת שלפוחי בודדה של pH-DRD2. תמונה זו שומרת מידע הכנסה בממד xy אבל מאבדת את המידע בזמן. תמונה מהימין מציגה הקרנת עצמה מרבית yt, שבו מחסנית xyt היא מסובב 90 מעלות סביב ציר y, ופיקסל המקסימאלי בכל שורת ציר x מוקרן על פיקסל בודד ציר y. תמונה זו שומרת מידע החדרה לאורך ציר yt אבל מאבדת את מידע ציר x.

<ol><li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation+by+DHHC5%2F8+targets+GRIP1+to+dendritic+endosomes+to+regulate+AMPA-R+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li>
<li>Anggono, V., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic.</a> Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).</li>
<li>Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+AMPA+receptor+function+by+the+human+memory-associated+gene+KIBRA%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA.</a> Neuron. 71, 1022-1029 (2011).</li>
<li>Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+bi-directional+regulation+of+AMPA+receptor+phosphorylation+and+trafficking+by+JNK%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK.</a> EMBO J. 27, 361-372 (2008).</li>
<li>Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PICK1+and+phosphorylation+of+the+glutamate+receptor+2+%28GluR2%29+AMPA+receptor+subunit+regulates+GluR2+recycling+after+NMDA+receptor-induced+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization.</a> J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).</li>
<li>Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+trafficking+by+palmitoylation+of+two+distinct+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites.</a> Neuron. 47, 709-723 (2005).</li>
<li>Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+AMPA+receptor+extrasynaptic+insertion+by+4.1N%2C+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation.</a> 12, 879-887 (2009).</li>
<li>Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+insertion+of+the+AMPA+receptor+GluA2+subunit+is+regulated+by+NSF+binding+and+Q%2FR+editing+of+the+ion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).</li>
<li>Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Two+Functionally+Distinct+Endosomal+Recycling+Pathways+for+Dopamine+D2+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor.</a> Journal of Neuroscience. , (2012).</li>
<li>Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+delivery+of+internalized+signaling+receptors+to+the+somatodendritic+surface+by+sequence-specific+local+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion.</a> J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).</li>
<li>Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+modes+of+regulated+receptor+insertion+to+the+somatodendritic+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane.</a> Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).</li>
<li>Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+discrete+exocytic+events+mediating+surface+delivery+of+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors.</a> J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).</li>
<li>Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+AMPA+receptors+%28AMPARs%29+from+synapses+is+preceded+by+transient+endocytosis+of+extrasynaptic+AMPARs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs.</a> J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).</li>
<li>Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GluR1+links+structural+and+functional+plasticity+at+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses.</a> J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).</li>
<li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+incorporation+into+synapses+during+LTP%3A+the+role+of+lateral+movement+and+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis.</a> Neuron. 64, 381-390 (2009).</li>
<li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+versus+global+synaptic+plasticity+on+dendrites+controlled+by+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience.</a> Neuron. 72, 1001-1011 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+Vb+mobilizes+recycling+endosomes+and+AMPA+receptors+for+postsynaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity.</a> Cell. 135, 535-548 (2008).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+receptor+trafficking+by+using+alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

מסיבות שאינן ידועות, הנוירונים עכבר הם תמיד קשים יותר לתרבות מאשר תאי עצב בעכברים. מניסיוננו, תרבות מעורבת של תאי עצב וגליה עובדת היטב עבור נוירונים עכבר תרבית ראשוניים. עם זאת, תרבות כזו מעורבת אינה מתאימה לניסויי TIRF הדמיה, כמו בסוג זה של נוירונים התרבות והתהליכים שלהם נוטים לגדול על גבי תאי גליה, situating somata העצבי ותהליכים דנדריטיים מעבר להישג ידם של מיקרוסקופיה TIRF. לכן, תרבות עצבית נמוכה יותר בצפיפות עם כמה גליה על coverslip היא אידיאלית עבור TIRF הדמיה. בדקנו לראשונה ...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; שם מגיב</strong</td&gt;<td<strong&gt; חברה</strong</td&gt;<td<strong&gt; מספר קטלוגים</strong</td&gt;<td<strong&gt; תגובות</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פתרון קולגן שור מטוהר (Purecol)</td&gt;<td&gt; המתקדם Biomatrix</td&gt;<td&gt; 5005-B</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; תמיסת המלח המאוזן של האנק (HBSS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14185-045</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פניצילין סטרפטומיצין (עט דלקת)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 15140-122</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פירובט נתרן</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 11360-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; גלוקוז הגבוה DMEM</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 10313-021</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; סרום שור עוברי (FBS)</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GlutaMAX</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 35050-061</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פפאין</td&gt;<td&gt; ורטינגטון קורפ יוכימית</td&gt;<td&gt; LS003126</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Deoxyribonuclease אני מלבלב שור (DNase)</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; DN25-10 מ&quot;ג</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdפוספט&gt; של Dulbecco נאגר מלוח (DPBS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14190-144</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0.05% טריפסין</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 25300-054</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdhydrobromide&gt; פולי-L-ליזין</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; P2636-1G</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; חומצה בורה</td&gt;<td&gt; פישר סיינטיפיק</td&gt;<td&gt; BP 168-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; בינוני Neurobasal</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 21103-049</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B-27 תוספת סרום חינם</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; סרום סוס חום פעיל</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 26050-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lipofectamine 2000</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11668 019</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; פישר סיינטיפיק</td&gt;<td&gt; BP310-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&lt;הוספת תרבות</td&gt;<td&gt; Millipore</td&gt;<td&gt; PICM03050</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

הדמית phluorin-תויגה הכנסת קולט לממברנה הפלזמה בנוירונים עכבר מתורבתים ראשיים

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

הבנה טובה יותר של מנגנונים המסדירים את הסחר בין קולט הפלזמה ממברנה (PM) והתאים תאיים דורשת גישה ניסויית להחלטות מרחב ובזמן מצוינים. יתר על כן, גישה כזו יש גם יש יכולת להבחין קולטנים מותאמים בצהריים מאלו בתאים תאיים. והכי חשוב, גילוי קולטנים בשלפוחית ​​אחת דורש רגישות גילוי יוצאת דופן, שכן כל שלפוחית ​​נושא רק מספר קטן של קולטנים. גישות סטנדרטיות לבחינת סחר קולט כוללות biotinylation פני שטח בעקבות זיהוי ביוכימי, שאין לו לא את ההחלטות דרושות מרחב ובזמן; ובדיקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של הקולטנים immunolabeled, אשר דורשים קיבוע כימי של תאים ולכן לוקה ברזולוציה הטמפורלית מספיקה 1-6. כדי להתגבר על המגבלות האלה, אנחנו ואחרים פתחנו והעסקנו Stra חדשtegy המאפשר הדמיה של ההחדרה הדינמית של קולטנים לשעה עם רזולוציות מרחב ובזמן מצוינים 7-17. הגישה כוללת תיוג של ה-GFP-pH רגישה, 18 pHluorin superecliptic, לתחום התאי N-המסוף של הקולטנים. Superecliptic pHluorin יש את המאפיין הייחודי של הניאון ב-pH הניטראלי ולא ניאון ב-pH חומצי (pH &lt;6.0). לכן, את הקולטנים המתויגים הם כאשר אנשים שאינם ניאון בתוך לומן חומצי של שלפוחית ​​סחר תאי או תאי endosomal, והם הופכים בקלות דמיינו רק כאשר הם נחשפים לסביבת ה-pH הניטראלית התאית, על פני השטח החיצוניים של ראש הממשלה. האסטרטגיה שלנו וכתוצאה מכך מאפשרת לנו להבחין הקולטנים PM מאלה בתוך שלפוחית ​​סחר תאית. כדי להשיג החלטות מספיק מרחב ובזמן, כמו גם את הרגישות הנדרשת כדי ללמוד סחר דינמי של קולטנים, שהועסקנו כולל פנימי משקףמיקרוסקופיה יון הניאון (TIRFM), שאפשר לנו להשיג הרזולוציה מרחבית האופטימלית של דימות אופטי (~ 170 ננומטר), ההחלטה הזמנית של מיקרוסקופיה וידאו שיעור (30 מסגרות / שני), ואת הרגישות לגילוי קרינה של ה-GFP אחת מולקולה. על ידי הדמית pHluorin-תויג תחת קולטנים TIRFM, הצליחו ישירות לדמיין אירועי הכנסת קולט בודדים לתוך PM בנוירונים בתרבית. גישת הדמיה זו יכולה באופן פוטנציאלי להיות מיושמת על כל חלבון קרום בתחום תאי שאפשר לתייג עם pHluorin superecliptic, ותאפשר נתיחה של המנגנונים המפורטים המרכזיים שמנחים החדרה של חלבוני קרום שונים (קולטנים, תעלות יונים, מובילים, וכו &#39;) כדי PM.

על ידי תיוג התחומים התאיים של קולטנים בממברנה עם pHluorin superecliptic, ועל ידי הדמית קולטנים היתוך אלה בתרבית תאי עצב של עכבר, אנו יכולים לחזות אירועים ישירות החדרת שלפוחי בודדים של הקולטנים לממברנת הפלזמה. טכניקה זו תהיה סייעה להבהרת המנגנונים המולקולריים השולטים הכנסת קולט לממברנת הפלזמה.

הדמית pHluorin-תויגה הכנסת קולט לממברנה הפלזמה בנוירונים עכבר מתורבתים ראשיים

הבנה טובה יותר של המנגנונים השולטים בתעבורת קולטנים בין ממברנת התא (PM) למדורי תאיים פנימיים מחייבת...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להדמות רצפטורים עצביים בעת השמתם בממברנת הפלזמה בתוך נוירונים ראשוניים של עכבר בתרבית. לצורך כך, משיגים תאי GL של עכבר מקליפת המוח של עכברים עובריים או ניונוטליים, ומגדלים אותם על תבתי תרבית חדירים למחצה מצופים בקולגן. תרביות הגליאה מושעות מעל נוירונים היפוקמפליים עובריים ראשוניים על לבישי זכוכית.לאחר שבעה ימי התנייה, מעבירים טרנספקציה לנוירונים עם רספטור דופמין D2 המסומן ב-super ecliptic fluorine. הרספטור המסומן ממוקם בתוך שלפוחיות תוך-תאיות, אך נותר לא פלואורסצנטי בתוך הסביבה החומצית של השלפוחית. עם זאת, כאשר השלפוחית מתמזגת עם ממבנה הפלסמה, ה-Florin נחשף ל-pH הניטרלי של הסביבה החוץ-תאית ופולט פלואורסצנציה חזקה, מה שמאפשר זיהוי באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (total internal reflection fluorescence microscopy).שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הובלת חלבוני ממברנה, ובכך תאפשר לנו להדגים ויזואלית את הובלה של כל חלבוני ממברנה שניתן לסמן באמצעות פלואורין, כגון קולטני גלוטמט וקולטנים המצומדים לג'י-פרוטאין. את הפרוצדורה ידגימו יחד איתי היום ברדינג דריי, ואנד, וכן שני חברים נוספים מקבוצת המחקר שלנו. יום לפני פרוצדורת הניתוח, הכינו בקבוקי T 75 עם תמיסת קולגן, הניחו את הבקבוקים במצב אנכי והניחו להם להתייבש למשך הלילה. ביום השגת תרבית הגליא, חממו את מצע הגליא למשך 30 min לפחות באמבט מים של 37 °C. לאחר המתת חסיי, בצעו דיסקציה של קליפת המוח של עכברים עובריים או ניאונטליים תחת מיקרוסקופ דיסקציה.הניחו את הקורטקסים שהוצאו במבחנה קונוית של 15 milliliter המלאה בנוזל מוחי artificial cerebral spinal fluid קר ומקובע בקרח, או A CSF. לאחר מכן, הסירו את כל ה-A CSF למעט 2 milliliter, והוסיפו 100 microliters של תמיסת pepane ו-20 microliters של 1%DNAs.One. הניחו את המבחנה במקלח קרח של 37 degrees Celsius והמתינו 20 דקות לעיכול הרקמה.לאחר העיכול, יש לשטוף בזהירות את רקמות המוח על ידי הסרה 조심נית של תמיסת הפרופאן והוספה של 10 milliliters של מצע גליאלי שחומם מראש. לאחר מכן, תוך הקפדה לא להפריע לרקמה, יש להסיר כמה שיותר מהמצע הגליאלי.הוסיפו שני מיליליטרים של מצע גליאלי טרי, ובאמצעות פיפטת זכוכית שעברה פוליש באש, בצעו טריטורציה עד שהרקמה אינה נראית עוד. הימנעו מיצירת בועות ברגע שהרקמה התפרקה לחלוטין. הוסיפו שמונה מיליליטרים נוספים של מצע גליאלי טרי ועברו בפיפטה עם התרחוף דרך מסנן תאים של 70 micron.אסוף את הנוזל שעבר דרך העמוד (flow through) למבחנה קונית בנפח 50 מיליליטר. העבר את התאים המופרדים משני עד שלושה עוברים לבקבוק T 75 מצופה קולגן והקדם אותם ב-37 degrees Celsius באינקובטור לתרביות רקמה למשך לילה. למחרת, שאב את המצע. שטוף את התאים פעם אחת עם 10 מיליליטר של PBS.לאחר מכן, הוסיפו 10 עד 15 מיליליטר של מצע גליאלי טרי לכל בקבוק. דגרו את התרביות למשך 10 עד 12 ימים, והחליפו את המצע בכל שלושה עד ארבעה ימים. לאחר הגעה לקונפלואנס (צפיפות מקסימלית), שטפו את תאי הגליאה ב-PBS.לאחר מכן, הוסיפו 5 mm של 0.05% trips לבקבוק והמתינו חמש דקות בטמפרטורה של 37 °C עד לניתוק התאים. לאחר הדגירה הקצרה, הוסיפו מצע גיליאלי (glial medium) ובצעו פיפטור כדי לנתק את ה-GL מהדופן התחתונה של הבקבוק. חלקו את התאים לשני בקבוקי T 75 חדשים מצופים קולגן.כאשר אלו יגיעו למצב של התמזגות (confluence), בצעו טריפסיזציה כפי שנעשה קודם לכן, והעבירו את תכולת כל בקבוק לצלחות עם שש בארות המכילות תבניות תרבית (inserts) מצופות קולגן. הניחו את התבניות מעל שני מיליליטר של מצע תרבית גליאלית, וגדלו את התאים למשך יום אחד עד שבעה ימים. תבניות תרבית גליאלית אלו ישמשו לה conditioning של תרביות הנוירונים.הוסיפו ארבעה מיליליטרים של מצע זריעה לכל באער של פלטה בעלת שישה באערים המכילה לכיסויות זכוכית מצופות פוליליזין שעברו ניקוי, והניחו את הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך לילה. שלב זה מעלה את הסיכוי להישרדות נוירונלית, ככל הנראה על ידי הסרת שאריות פוליליזין למחרת. הסירו את מצע הזריעה והחליפו אותו בשני מיליליטרים של מצע זריעה טרי.מילה המכילה 2% מהמדיום. תוסף B 27 לתרבית של נוירונים מההיפוקמפוס. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, בצעו דיסקציה להיפוקמפוסים מרקמת המוח של ארבעה עוברי עכברים בשלבי E 15 עד 18. העבירו את ההיפוקמפוסים לפרועת קונית של 15 מיליליטר עם באפר דיסקציה קר מאוד.בשלב הבא, בצעו דיסקציה של הסטריאטום (striatum) מרקמת המוח של שלושה עכברים עובריים בגיל E 15 עד 18, והעבירו אותם למבחנה קונית נפרדת בנפח 15 מיליליטר עם באפר דיסקציה קר מאוד. עכלו את הרקמה באמצעות פפאין כפי שבוצע קודם לכן. לאחר מכן, השתמשו בהמוסייטומטר.קבעו את מספר התאים בכל תרחיף עצבי והזריעו אותם. בכל זכוכית כיסוי יש להזריע 0.4 × 10⁶ תאים ולגדל אותם באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. כדי להכין את תבתי תרביות הגליות עבור התניית התרביות העצביות, שאבו את המצע מתבתי תרביות הגליות ומהפלטה, והחליפו כל אחד מהם ב-2 mL של מצע זריעה טרי.ביום למחרת, הניחו את לוחות הכיסוי עם הנוירונים בכל באר של הצלחת, מתחת למסנני תרבית הגליות. המשיכו בדגירה ב-37 °C. בכל שלושה עד ארבעה ימים, החליפו מחצית מהמדיום במדיום הזנה טרי ומחומם מראש המכיל B 27, עד שהם יהיו מוכנים לטרנספקציה ולניסויי דימוג.הנוירונים יועברו טרנספקציה ביום השביעי של התרבית ויידגמו ביום השמיני. תרבית נוירונים עקבית היא המפתח לניסויי דימות חיים מוצלחים. איור זה מציג נוירונים מהיפוקמפוס של עכבר שגודלו לפי פרוטוקול זה מהיום ה-11 in vitro ועד היום ה-18 in vitro.מהתמונות עולה בבירור כי הנוירונים פיתחו שלוחות נרחבות וכי השלוחות הדנדריטיות מכוסות בצפיפות בקוצים דנדריטיים. סימנים אלו מעידים כי הנוירונים בריאים בתרבית בכל תרבית נוירונים. שילוב של 2 µL של lipectomy עם 2001 µg של DNA המקודד לקולטן דופמין D2 המסומן עם super ecliptic Florin.ערבבו והדגירו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך ההדגרה, הסירו והעבירו מיליליטר אחד של המצע מהחלק התחתון ומיליליטר אחד מתוך כל תאבטג (insert) של תרבית גליאליס לאותו הפרוטוקול קוני. לאחר מכן, הוסיפו נפח זהה של מצע הזנה עם B 27 למצע שנשמר והדגירו בטמפרטורה של 37 °C.מצע זה ישמש לתרבית נוירונים לאחר טרנספקציה, בעקבות דגירה קצרה של תערובת ה-DNA עם הליפוזומים למשך 20 דקות. הוצא את התבניות להשקיעת תרביות גליא מהפלטות בעלות שש בארות. הוסף 200 µL מתערובת ה-DNA והליפוזומים לכל זכוכית כיסוי עם נוירונים.יש למנוע היווצרות בועות תחת ממבנה התרבית. החליפו את ה inserts של תרבית הגליה והדגירו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעתיים עד ארבע שעות. לאחר ההדגרה, הוציאו שוב את ה inserts של הגליה, שאבו את תמיסת הטרנספקציה מכל באר, הוסיפו את 2 milliliters של המצע שנשמר קודם לכן לנוירונים והחזירו את ה inserts של תרבית הגליה.לבסוף, הסירו את המצע הגליאלי מכל תא (insert) והוסיפו שני מיליליטר של המצע השמור לכל תרבית. השאירו את התאים למשך 24 עד 72 שעות נוספות כדי לאפשר ביטוי של ה-CD NA שעבר טרנספקציה. מערכת הדמיות ה-TIRF המשמשת בסרטון זה היא מערכת מותאמת אישית הכוללת לייזר סייאן בעוצמה של 100 מיליואט לעירור ומצלמת EMCCD כגלאי. 30 דקות לפני תחילת ההדמיה, חממו A CSF ל-37 °C בבן-מארה. כמו כן, הדליקו את הלייזר, את המצלמה ואת רכיב החממה, והניחו את רכיב החממה על במה של המיקרוסקופ.הניחו כיסוי זכוכית עם נוירונים שעברו טרנספקציה בתא תצפית לדימוי חי והוסיפו במהירות A CSF שחומם מראש. הניחו את התא על התושבת המחממת שעלבמת המיקרוסקופ במצב דימוי פלואורסצנטי-אפי (epi fluorescent), וזהו את הנוירונים שעברו טרנספקציה. לאחר מכן, במצב דימוי TIRF, בצעו פוטו-בליצ' (photobleach) לנוירונים למשך דקה אחת כדי להסיר כל פלואורסצנציה קיימת של פלואורין על ממבנה הפלזמה.בשלב הבא, הגדירו את הגבר (gain) של מכפיל האלקטרונים במצלמת ה-E-M-C-C-D למקסימום והתחילו בצילום תמונות למשך דקה אחת בתדר של 10 hertz. לאחר השלמת הצילום, כל הקלטה תכיל 600 תמונות. נתחו את הנתונים באמצעות Image J כדי לקבוע את מידת ההחדרה לממברנה של קולטן דופמין D2.נוירון קוצני בינוני (medium spiny neuron) מאזור הסטריאטום של עכבר עבר טרנספקציה עם Super Ecliptic Fluorin המשויך לקולטן דופמין D2 (PDR D2). לאחר מכן בוצע דימוי TIRF חי, במסגרתו צולמו 600 תמונות בקצב של תמונה אחת כל 100 מילישניות. תמונה זו מציגה את השליכה בעוצמה מרבית (maximum intensity projection) של הקלטת Time-lapse; חצי חצים לבנים מצביעים על המקומות שבהם שלפוחיות בודדות המכילות pH DD two התמזגו עם ממבנה הפלזמה.תמונה זו מציגה השלכה של עוצמה מקסימלית במישור YT, שבה מחסנית ה-XYT סובבב 90 מעלות סביב ציר Y, והפיקסל בעל העוצמה המקסימלית בכל קו בציר X מושלך על פיקסל בודד בציר y. כדי לספק מידע על ציר הזמן של ההחדרה, נתונים אלו מדגימים כי ניתן להשתמש בשיטה זו בהצלחה לבחינת הבקרה של החדרת רצפטורים לממברנת הפלזמה בנוירונים של עכבר בתרבית לאחר פיתוחה. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום תעבורת הרצפטורים הנוירונלית לבחון מנגנוני בקרה של רצפטורים, תעלים ונשאי ממברנה נוירונלית אחרים.

imaging-phluorin-tagged-receptor-insertion-to-plasma-membrane-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לנתח, transfect דרך electroporation ועכבר תרבות נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח. לטווח קצר תרבויות ניתן להשתמש ללימודי תולדה של האקסון והדרכה, ואילו לטווח ארוך תרבויות יכול לשמש מחקרים synaptogenesis ניתוח בעמוד השדרה הדנדריטים.

Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

דו"ח זה מתאר את השימוש הדמיה תא חי וטכניקות photobleach לקבוע את הבעת פני, מסלולי תחבורה קינטיקה סחר exogenously GFP-מתוייגים הביע pH רגיש, חלבונים על הממברנה של נוירונים.

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

מקור: Schönherr, S., et. al. תיוג אימונולוגי משולב של העתק אופטוגנטי ושבר הקפאה כדי לבחון סידור ספציפי לקלט של קולטני גלוטמט באמיגדלה של העכבר. J. Vis. exp. (2016)סרטון זה מדגים את התיוג החיסוני של העתקים שבורים בהקפאה של רקמת מוח עכבר למיקרוסקופ אלקטרונים. ההעתקים השבורים והמצופים מתעכלים כדי לחשוף קולטנים. נוגדנים משניים ראשוניים ובעלי תווית זהב מתווספים כדי לסמן קולטנים ספציפיים של ממברנה עצבית. ההעתק מותקן על רשת ומוצג תחת מיקרוסקופ אלקטרונים.

תיוג חיסוני של חלבוני ממברנה עצבית בדגימה שסועה בהקפאה של רקמת מוח של עכבר

מקור: Lacin, E., et al. בניית מדווחים מהונדסים פלואורסצנטיים מבוססי תאים (CNiFERs) לזיהוי אופטי של נוירוטרנסמיטורים in vivo. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים טכניקה להדמיית שחרור נוירוטרנסמיטר in vivo באמצעות מדווחים מהונדסים פלואורסצנטיים מבוססי תאים (CNiFERs), תאי דיווח מיוחדים שהוזרקו מראש לקליפת העכבר. העכבר ממוקם תחת מיקרוסקופ של שני פוטונים, ומאפשר הדמיה של איתות סידן המושרה על ידי נוירוטרנסמיטר באמצעות פליטת פלואורסצנטיות. השיטה ממנפת קשירת נוירוטרנסמיטורים לקולטנים מצומדים לחלבון G...

שחרור נוירוטרנסמיטר הדמיה באמצעות נוירוטרנסמיטר מבוסס תאים מדווחים מהונדסים פלואורסצנטיים

כאן, מוצג הליך להפעלה סלקטיבית של חלבון עצבי עם פולס קצר של אור על ידי קידוד גנטי של חומצת אמינו לא טבעית תגובתית-אור לחלבון עצבי מטרה המתבטא בתאי עצב בתרבית או in vivo.

שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים

תיוג תחום תאי של חלבון הממברנה עם fluorophore pH רגיש, superecliptic pHluorin (ספטמבר), מאפשר לוקליזציה, ביטוי subcellular, וסחר שייקבע. הדמיה ספטמבר- שכותרתו חלבונים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM) מאפשרת כימות של רמות חלבון בקרום ER ו פלזמה הפריפריה.

ניצול רצפטורים-tagged pHluorin לפקח subcellular לוקליזציה וסחר

כאן מוצג פרוטוקול לחקור את ההשפעות המוקדמות של עמילואיד-β (Aβ) במוח.  זה מראה Aβ גורם אנדוציטוזה בתיווך clathrin וכיווץ של צמיחת עצב קונוסים. הפרוטוקול שימושי בלימוד ההשפעות המוקדמות של Aβ על צמיחת עצב קונוסים, עשוי להקל על מניעת מחלת אלצהיימר.

להמחיש התמוטטות חרוט הצמיחה עצב ואפקטים β עמילואיד מוקדם בנוירונים תרבותי. העכבר

בדו ח זה, אנו מתארים פרוטוקול פשוט עבור לימוד neurite מוצלח בנוירונים הקליפת המוח העובריים על ידי שיתוף הפעולה עם egfp ואת חלבון הריבית.

משופרת ירוק מבוסס חלבון פלואורסצנטית מבוססת על לימוד Neurite Outgrowth בנוירונים ראשוניים

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד במבחנה Ca2+ שטף בנוירונים המוח האמצעי ואת ההשפעות שלהם במורד הזרם על caspase-3 באמצעות תרביות המוח האמצעי של העכבר הראשי. מודל זה יכול להיות מועסק כדי ללמוד שינויים פתופיזיולוגיים הקשורים פעילות Ca2+ חריגה בנוירונים המוח האמצעי, ולסנן טיפולים רומן עבור תכונות אנטי אפופטוטיות.

כימות ספונטני Ca2+ שטף ואת ההשפעות במורד הזרם שלהם בעכבר ראשי נוירונים המוח האמצעי

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המשלב הזרקת וירוסים הקשורים באדנו עם השתלת חלון גולגולתי לצורך הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

למד הדמיה בזמן אמת של הכנסת קולטים לממברנה הפלזמה בנוירונים עכבר מתורבתים ראשיים באמצעות pHluorin-תויגה. שיטה זו מאפשרת מחקר דינמיקת קולטים ותנועת חלבוני ממברנה.

הדמית pHluorin-תויגה הכנסת קולט לממברנה הפלזמה בנוירונים עכבר מתורבתים ראשיים

גלה סרטונים נוספים