Name: איתור של palmitoylation חלבון בנוירונים ביפוקמפוס מתורבתים ידי immunoprecipitation וacyl-Exchange ביוטין (אייב) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: למדו לזהות חלבונים מפלמיטוילים בנוירונים מהיפוקמפוס מתורבתים באמצעות שיטת אייב. שיטה ביוכימית רגישה לחקירת תנועת חלבונים תוך-תאית במערכת העצבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממכון קנדי ​​לבריאות מחקר MOP-81158.

1. מיצוי של חלבון מטרה מנוירונים ביפוקמפוס ראשוניים מתורבתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני קציר חלבון אנדוגני מתאים ביפוקמפוס עיקריים, להכין מאגר תמוגה (LB; טבלת 1) עם מעכבי פרוטאז. עד 10 מ&quot;ל של חיץ תמוגה, להוסיף פתרון 0.1 מ&quot;ל phenylmethanesulfonyl פלואוריד (PMSF) לריכוז סופי של 10 מ&quot;מימ, ולהוסיף לוח קוקטייל מעכב פרוטאז 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן N-ethylmaleimide (nem) פתרון (טבלה 1) מאבקת lyophilized. מתמוסס בעדינות EtOH 100% בטמפרטורת חדר (RT). תמיד להכין תמיסה טרייה ליום של ניסוי nem. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא לשלב חיץ תמוגה וnem. הוסף 0.5 מ&quot;ל של פתרון nem 2M לצינור טרי 50 מיליליטר חרוטים. הוסף LB 20 מ&quot;ל מעל הראש, ומהר LB המקום + nem (ריכוז סופי של 50 מ&quot;מימ) על פלטפורמת נדנדה ב 4 ° C כדי לערבב באופן מלא למשך 5 דקות. תמיד להוסיף פתרון השנייה ראשונה וLB nem / EtOH, כדי לערבב 2 כמו שצריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נוירונים בתרבית מהחממה ומקום על * קרח. בעדינות להסיר תקשורת הסלולרית, ולשטוף בעדינות פעמים עם פוספט הקר נאגר מלוח (PBS) 1x. הוסף 300 מ&quot;ל של LB + nem 50mm לבאר הראשונה של נוירונים ביפוקמפוס, ותאי סריטות באמצעות מרים תא פנוי. איסוף lysate התא, ואז לפרוק את lysate לתוך הבאר הבאה של אותה הקבוצה. לגרד תאים בתוך 2 גם באמצעות מרים התא, לאסוף, ולחזור להשתמש גם שלישי, אם יש צורך להתרכז lysate נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף lysate תא לטרום מקורר (על קרח), צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. חזור על השלב 1.4 באמצעות 100 μl של LB + nem 50mm לאסוף כל lysate תא נותר. תעבור lysate תא סך דרך מזרק מד 26 ½ 5-6 פעמים כדי לסייע בתמוגה מכאנית, נזהר שלא לפוצץ בועות לפתרון. אחד במקום יכול sonicate עבור 15 שניות על קרח, אם ציוד זמין. Nutate lysate תא ל≥ 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר את ליסה התאטה ידי צנטריפוגה XG ב 16000/30 דקות, כדי תאי גלולה בלתי lysed חומר ניקוי וחומר מסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האיסוף פינה lysate תא (supernatant) בצינור חדש מראש מקורר 1.5 מ&quot;ל על קרח. חזור על פרוטוקול קציר לכל הקבוצות של תאים. ריכוז חלבון במידה כל דגימות lysate באמצעות BCA assay, ולנרמל את עוצמת הקול של כל דגימות lysate מקבוצות של תאים יש חלבון כולל שווה בדיוק, עם מינימום מומלץ של 500 מיקרוגרם. למעלה כל הדגימות עם LB + nem 50mm לסך הנפח 500 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1-5 מיקרוגרם של נוגדן ראשוני נגד חלבון המטרה לכל אחת ממדגם lysate. Nutate דגימות נוגדנים lysate המעורבות הלילה ב 4 ° C. </li></ol> * נוירונים ביפוקמפוס עכברוש ראשוניים צריכים להיות מתורבתים בצפיפות של כ 250.000 תאים / היטב בצלחת 6-ובכן, בתקשורת סרום נטולה המכילה תוסף B27 עצבי, כפי שתואר לעיל 5, וגדל לתשוקהאורך ד של זמן, בדרך כלל 14-16 ימים, במבחנה (DIV) כדי להשיג בגרות. מינימום של 500 מיקרוגרם של חלבון כולל מומלץ immunoprecipitate הצלחה וbiotinylate חלבון עצבי יעד, אשר בדרך כלל דורש 2-3 בארות של צלחת 6-כן. 2. משקעים של חלבון מטרת נוגדן בכריכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני החשתי ולשתק חלבון המטרה, להתכונן סלארי 50% מחלבון A או חרוזי sepharose, חלבון ה-G-מצופים. באופן ספציפי, להוסיף ≥ 60 μl של חרוזי sepharose לדגימה לצינורות 1.5 מ&quot;ל, ולהבטיח כי כל הדגימות יש כמויות שווות של חרוזים. חרוזים מגנטיים מתאימים גם אם הציוד זמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של תרחיף 50% לכל דגימת הנוגדנים lysate, וnutate ל≥ 1 שעה ב 4 ° C. </li></ol> 3. Acyl-Exchange ביוטין: מחשוף hydroxylamine (שינקין) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת ביצוע שלב 2.2, להכין מספר הצינורות עם חיץ תמוגה (LB) של דיPHS fferent. PH הוא חשוב מאוד לשלבים הבאים ותמיד צריך להיות מותאם משתמש במד pH. הכן 2 מ&quot;ל של pH 7.2 LB לדגימה, ו0.5 מ&quot;ל של הצפה מחמירה לפי מדגם (טבלה 1). גם להכין LB ​​מ&quot;ל 0.5 + nem 10mm לדגימה, כמו בשלבים 1.1-1.3. הוסף טבליות מעכב פרוטאז PMSF ולכל מאגרי תמוגה, כמו בשלב 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hydroxylamine (שינקין) הוא סוכן עצמת צמצום, מחשוף שמPalmitate מcysteines נדרש לbiotinylation (איור 1), והמחדל של מחשוף HAM משמש כשליטה שלילית. פיצול כל דגימה של חרוזים לשתי דגימות, אחד השמטת צעד המחשוף HAM (-HAM), ואחד כולל את צעד HAM (+ HAM). כדי לנרמל לפירוק חלבונים הנגרם על ידי טיפול שינקין, אחד צריך לפצל כל דגימה לשלישים, עם 1/3 מהחרוזים המשמשים לבקרת HAM-, ונותרו 2/3 המשמשים לטיפול HAM +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 נוסף.5 צינורות מ&quot;ל על קרח, שכותרתו שליטת HAM-עבור כל מדגם. בעקבות צעד 2.2, עדינות סרכזת חרוזים של כל הדגימות בדקות XG 0.5 / 1 ב 4 ° C (צנטריפוגה במהירות זו, משך זמן, וטמפרטורה לכל יתר השלבים, אלא אם כן צוין אחר), הנח את הצינורות על קרח, להסיר את supernatant, ו מחדש להשעות את החרוזים ב600 μl של LB + nem 10mm. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מחדש מתלים-חרוזים של הדגימות במאגר תמוגה + nem 10mm, לאסוף באופן מיידי 200 μl של slurry lysate של החרוזים של המדגם, והזרמה למדגם שהצינור של HAM-על קרח. הוסף 300 μl נוסף של LB + nem 10mm למדגם HAM-, ו100 μl נוסף מדגם HAM + עבור סכום כולל של 500 μl בכל דגימה. דגירת הצינורות למשך 10 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות (לשטוף) HAM-ודגימות HAM + בעדינות עם חיץ מחמיר 0.5 מ&quot;ל, למדגם. לבצע שלב זה במהירות, כמו דגירת SDS עוד תגרום להסרה של נוגדן מאוגד מחרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את כל הדגימות שלוש פעמים ב0.5 מ&quot;ל / מדגם LB של pH 7.2, וספין למטה בין הכביסות שכן ב3.2b צעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת ביצוע שלב 3.5, להכין חיץ HAM (טבלה 1). הוסף נפח המתאים של פתרון hydroxylamine לצינור חדש, כדי להשיג ריכוז סופי של 1M בנפח של pH 0.5 מ&quot;ל LB 7.2 + לדוגמה, הם. תמיד להכין את החיץ הטרי ליום של ניסוי HAM. הוסף 0.5 מ&quot;ל / מדגם של pH 7.2 LB קטעים מכל בשר חזיר, ו0.5 מ&quot;ל / מדגם של חיץ HAM לכל דגימות HAM +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Nutate כל הדגימות לשעה 1 בטמפרטורת חדר (RT). אל תחרוג משעה 1. </li></ol> 4. Acyl-Exchange ביוטין: תיוג ביוטין-BMCC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת ביצוע שלב 3.6, להכין 2 מ&quot;ל של pH 6.2 LB לפי מדגם (טבלה 1), כמו בשלב 3.1. הנח את pH 6.2 LB על קרח עד הצורך. גם להכין פתרון מניות של ביוטין-BMCC (1 טבלה) מייד לפני השימוש. תשקול את exactly 2.1 מ&quot;ג של ביוטין-BMCC, לאסוף בצינור מ&quot;ל 1.5, ומתמוסס בעדינות sulfoxide דימתיל המ&quot;ל 0.5 (DMSO) על ידי נחת על פלטפורמה מתנדנדת RT, כדי להשיג ריכוז 8mm (לא משתמש בפיפטה כדי לשבור את האבקה ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלב 3.6 הושלם, לשטוף בעדינות את החרוזים בעבר במאגר תמוגה pH 6.2, כדי להסיר חיץ HAM שיורית. הסר את supernatant ולמקם את הדוגמות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביוטין-BMCC היא מולקולת ביוטין מצומדת maliemide שיש זיקה גבוהה לקבוצות thiol חופשיות של cysteines (איור 1). בעת ביצוע השלב 4.2, להכין 0.5 מ&quot;ל של הצפת ביוטין-BMCC (טבלה 1) לפי מדגם, בריכוז עבודה בין 0.5 מיקרומטר עד 5 מיקרומטר. ריכוזים העולים על 5 מיקרומטר צפויים להרוות את חלבון המטרה 6, ובדרך כלל לא צריך להיות חריגים, אולם זה עשוי להשתנות בהתאם לחלבון המטרה הרצויה. הוסף 0.5 מ&quot;ל של חיץ ביוטין-BMCC לכל דגימה, וnutate בדיוק לשעה 1 ב4 &amp;מעלות; ג אל תחרוג משעה 1. </li></ol> 5. Elution של חלבון מטרת ביוטין מצומדות וSDS-PAGE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלב 4.3 הושלם, לשטוף בעדינות את כל הדגימות פעם אחת בחומציות LB 6.2. שמור את כל הדגימות על קרח בין כביסות. הסר מאגר לדוגמא SDS 2x ללא סוכני הפחתה (טבלה 1) מ-20 ° C אחסון ולהפשיר לאט על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות דגימות שלוש פעמים בחומציות LB 7.5 + PMSF / מעכבים, ולשמור על קרח בדגימות בין כביסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מהכביסה השלישית, משאיר את חרוזי pelleted בתרחיף עם חיץ שנותר בתחתית של תחתית. טבול פיפטה עם טיפ קטן בקוטר (טיפ טעינת ג&#39;ל או קצה פיפטה P2 מספיק) לחלק התחתון ביותר של הצינור דרך slurry, ולאסוף במהירות כל חיץ שנותר, נזהר שלא לקחת את כל חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוספת המאגר לדוגמא SDS 2x עם DL-Dithiothreitol (DTT) כדי להשיג ריכוז סופי של 5 מ&quot;מ. להוסיף40-50 μl של מאגר לדוגמא 2x + DTT 5mm לכל דגימה. במידת הצורך, מערבולת החרוזים לערבב לחלוטין עם חיץ המדגם, וחובצה מייד במהירות גבוהה כדי לאסוף את כל החרוזים בגלולה, שקועים בחיץ מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיח את כל הדגימות ל10 דקות ב 75-80 ° C. תן דוגמאות מגניבות RT ל≥ 10 דקות על גבי ספסל, וצנטריפוגה XG ב 16000/3 דקות לגלולה לחלוטין את החרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח מלא של חלבון eluted (supernatant) מכל דגימה לנתיב אחד בתוך הג&#39;ל polyacrylamide מתאים למערב סופג, באמצעות 7 SDS-PAGE. לארגן את כל הדגימות כך שeluent-HAM השליטה וeluent HAM + ליחיד מדגם מנוהלים באופן מיידי סמוכים זה לזה במהלך SDS-PAGE (איור 2). בעקבות SDS-PAGE, להעביר לPVDF או קרום ניטרוצלולוזה. </li></ol> 6. מערבי סופג ואיתור של palmitoylation של חלבון מטרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שיושלם שלב 5.6, לשטוף את הממברנהפעמים בטריס-נאגר מלוח (TBS 1x) למשך 10 דקות על פלטפורמת נדנדה בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר חסימה כדי לחסום תיוג לא ספציפי על ידי שקילה החוצה אלבומין בסרום שור (BSA), כדי להשיג משקל של 3% בנפח של TBS 1x + Tween-20 0.05% (TBS-T) כי די בכך כדי להטביע את הקרום באופן מלא . לstreptavidin סופג, תמיד לחסום עם BSA ולא אבקת חלב. חסום את הקרום לשעה 1 בRT על פלטפורמת נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון נוגדן של TBS-T + BSA 0.3%. הוסף נוגדן HRP-streptavidin מחדש ב1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במים מזוקקים, בדילול 1:5,000-1:10,000. לאחר השלב 6.2 הושלם, לשטוף את הממברנה פעם אחת בTBS-T למשך 10 דקות, ואז דגירת הקרום בפתרון נוגדן streptavidin על פלטפורמת נדנדה לאו לשעה 1 בRT, או הלילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הממברנה שלוש פעמים בTBS-T למשך 10 דקות על פלטפורמת נדנדה. על מנת לאתר את אות palmitoylation, לחשוף את הארת HRP שימוש כימיערכת המצע iluminescent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנרמל את רמות palmitoylation לכמות החלבון של עניין שimmunoprecipitated, להפשיט את קרום חיץ באמצעות הפשטת כתם מערבי לדקות 5-10 על פלטפורמת נדנדה בRT. חזור על שלבים 6.1-6.4 באמצעות נוגדן הראשוני נגד החלבון של ריבית ששמש במקור לimmunoprecipitation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת palmitoylation של החלבון של עניין באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, ולנרמל את רמות palmitoylation לכמות חלבון immunoprecipitated. </li></ol>

<ol><li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 161-175 (2010).</li>
<li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456, 904-909 (2008).</li>
<li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36, 276-285 (2004).</li>
<li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylated+proteins%3A+purification+and+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nat. Protoc. 2, 1573-1584 (2007).</li>
<li>Xie, C., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+hippocampal+and+cortical+neurons+in+a+mixture+of+MEM%2B+and+B27-supplemented+neurobasal+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Survival of hippocampal and cortical neurons in a mixture of MEM+ and B27-supplemented neurobasal medium.</a> Free Radic. Biol. Med. 28, 665-672 (2000).</li>
<li>Drisdel, R. C., Alexander, J. K., Sayeed, A., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Assays of protein palmitoylation.</a> Methods. 40, 127-134 (2006).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359(2010).</li>
<li>Huang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+palmitoyl+acyl+transferases+exhibit+distinct+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Neuronal palmitoyl acyl transferases exhibit distinct substrate specificity.</a> FASEB J. 23, 2605-2615 (2009).</li>
<li>Noritake, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+DHHC+palmitoylating+enzyme+mediates+activity-sensitive+synaptic+targeting+of+PSD-95%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mobile DHHC palmitoylating enzyme mediates activity-sensitive synaptic targeting of PSD-95.</a> J. Cell Biol. 186, 147-160 (2009).</li>
<li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation+by+DHHC5%2F8+Targets+GRIP1+to+Dendritic+Endosomes+to+Regulate+AMPA-R+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation by DHHC5/8 Targets GRIP1 to Dendritic Endosomes to Regulate AMPA-R Trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li>
<li>Hayashi, T., Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+palmitoylation+of+NR2+subunits+regulates+NMDA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dual palmitoylation of NR2 subunits regulates NMDA receptor trafficking.</a> Neuron. 64, 213-226 (2009).</li>
<li>Ho, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-Nitrosylation+and+S-Palmitoylation+Reciprocally+Regulate+Synaptic+Targeting+of+PSD-95%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">S-Nitrosylation and S-Palmitoylation Reciprocally Regulate Synaptic Targeting of PSD-95.</a> Neuron. 71, 131-141 (2011).</li>
<li>Iwanaga, T., Tsutsumi, R., Noritake, J., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+protein+palmitoylation+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling.</a> Prog. Lipid Res. 48, 117-127 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

בדיקת ה-IP-ABE מוצג כאן היא שיטה פשוטה ורגישה מאוד לאיתור חלבוני palmitoylated בנוירונים ביפוקמפוס בתרבית ראשונית, תוך שימוש בטכניקות ביוכימיות בעיקר סטנדרטיות. זה הופך את הבדיקה להתאמה בקלות למעבדות מצוידות כבר עם חומרים מוחים מערביים. בדיקת ה-IP-ABE משלבת פרוטוקול סטנדרטי immunoprecipitation לבודד ולשתק את חלבון המטרה של אחד, ואחריו תאר בעבר אייב כימית 2-4 במהירות כדי לזהות רמות Palmitate על חלבון מצע. טכניקת אייב יש מגוון רחב של יישומים לבחינת חלבוני palmitoylated ברקמות שונות וקווים סלולריים, כולל סריקות רחבות היקף Palmitoyl-proteomic של פרופילי palmitoylation הגלובליים, ואיתור מהיר של רמות palmitoylation של חלבון מטרה אחת. תיאורים קודמים של אייב כימיה נצלו תמוגה שונה שיטות תא והפקת חומרי ניקוי מprot העצביEins 2, 9, בחסמי thiol חופשיים 10, 11, biotinylation, וטיהור של חלבון המטרה 4, בהתאם ליישום של הניסוי. התוספת של Palmitate לתוצאות חלבונים עצביות במיקוד שלהם לכיוון קרום תא, וזיהוי של שבריר palmitoylated של חלבון המטרה תחייב חילוצו מהקרומים האלה. מתודולוגיות אייב שתוארו לעיל יש שימוש במגוון של 9 יוניים וחומרי ניקוי שאינם יוניים 8 לחלץ חלבוני היעד רצוי, ושימוש בחומרי ניקוי מסוימים תלוי בחלבון המטרה וסחר הקרום הידוע שלה. כאן, אנו מנצלים את הלא denaturing וחומר ניקוי לא יוני IGEPAL CA-630 כדי לחלץ חלבוני palmitoylated, שיש לנו תוקף לחילוץ וזיהוי של חלבון δ-catenin העצבי palmitoylated (איור 2). מבנה IGEPAL CA-630 כולל קבוצה שאינה קוטבית ראש מגושמת ונוקשה שאינהלשבש קונפורמציה חלבון יליד או אינטראקציות, אך המאפשר הקשר שלה עם האזורים ההידרופובי של חלבוני קרום קשורים ל, ובכך מקנה להם miscibility ומאפשר המיצוי שלהם. חלבונים עצביים רבים מותאמים להממברנה הסינפטית או צפיפות פוסט סינפטי של סינפסות יש לחלצם באמצעות IGEPAL CA-630, עם זאת חלק לא יכול solubilize לחלוטין, ועשוי לדרוש שימוש בחומרי ניקוי שונים שאינם denaturing כמו טריטון X-100, שבו יש כבר נוצל בעבר לאייב כימיה 2, 8. כמה תיאורים של אייב כימיה גם מנוצלים מגיב biotinylation thiol-reactive שונה מהמולקולה מתוארת כאן, בשם ביוטין-HPDP (Thermo Scientific), שמחייבת גם אמצעים שונים של טיהור חלבונים 4. ביוטין-HPDP היא עוד מולקולת thiol-reactive, maliemide מצומדות ביוטין המכילה קשר דיסולפיד בזרוע המקשרת maliemide, מבני דifferentiating מביוטין-BMCC, אשר אינו מכיל קשר דיסולפיד זה. בעקבות thiol-biotinylation של ציסטאין בחינם או palmitoylated של חלבון על ידי ביוטין-HPDP, קשר דיסולפיד כתוצאה בין חלבון המטרה וקבוצת יוטין ניתן בקע ידי הפחתת ריאגנטים לשחרר את קבוצת יוטין ולחדש את החלבון וללא שינוי שלה, מה שהופך biotinylation ביוטין-HPDP חולף והפיך. שימוש, אפוא, מגיב biotinylation זה דורש טיהור של חלבון מטרה על ידי חומרים כימיים avidin חסר יכולת תנועה, כגון חרוזי streptavidin מצופים. עם זאת, thiol-biotinylation של חלבון מטרה על ידי ביוטין-BMCC, כפי שנתואר כאן, הוא יציב וקבוע יחסית, ודורש טיהור של חלבון המטרה על ידי נוגדן מכוון נגד היעד, ומשותק על חרוזי sepharose. שני טכניקות אייב כבר נוצל בעבר למסכים בקנה מידה גדול, ואיתור של palmitoylation של חלבונים בודדים 2, 8-10, 12, ובדיקת ה-IP-ABE אנו מתארים כאן היא אופטימלית לאיתור מהיר של palmitoylation של חלבוני היעד עצביים יחידים. רוב מכריע של palmitoylation הסלולרי כרוך בנוסף ההפיך של Palmitate לקבוצת thiol של cysteines (שמכונה S-palmitoylation, בו אנו מכלילים כ &#39;palmitoylation&#39; בפרוטוקול זה), אולם קבוצה מצומצמת מאוד של חלבונים חשופות לpalmitoylation בלתי הפיך בגליצין ושאריות ציסטאין באמצעות יצירת קשרים אמידים יציבים, כינו N-palmitoylation 13. מגבלה אחת של אייב כימיה היא חוסר יכולתה לזהות בגלל N-palmitoylation ליציבות של הקשר האמיד, וכן הקרנה של חלבון המטרה חדשה לpalmitoylation יש לאשר באמצעות תיוג מטבולית 3H-Palmitate 1. כאמור, בדיקת IP-ABE ניתן להתאים בקלות לבחינת palmitoylation בתמציות חלבונים ממקורות מרובים, כולל טראןsfected קווי Heterologous תא, רקמה עיקרית, ותרבויות העצביות עיקריות מאזורים במוח מרובים. בדיקת ה-IP-ABE נוצלה לבחינת הסתפקות palmitoylation של חלבונים שעברו מוטצית ציסטאין לסרין כדי לזהות את מיקומו של ציסטאין palmitoylated יחד חלבון המטרה 8, לבחינת מחזור Palmitate דינמי על חלבונים סינפטיים בנוירונים בתרבית בתנאי בסיס, 10, ושינויים ברמות palmitoylation של חלבונים עצביים בעקבות אינדוקציה של פעילות עצבית 9. הרגישות וההסתגלות של assay IP-ABE להפוך אותו אידיאלי לבחינת פרופילי palmitoylation של חלבונים עצביים, ואופטימלי לאיתור שינויים דינמיים בpalmitoylation.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> IGEPAL CA-630 </td><td> סיגמא </td><td> I8896 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Fluka </td><td> 93482 </td><td></td></tr><tr><td> קוקטייל מעכב פרוטאז </td><td> רוש מיני מלא </td><td> 11 836 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> Nem </td><td> סיגמא </td><td> E3876 </td><td></td></tr><tr><td> פתרון HAM </td><td> סיגמא </td><td> 46780-4 </td><td></td></tr><tr><td> ערכת Assay חלבון BCA </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td><td> להבטיח תאימות עם חומר ניקוי שנבחר </td></tr><tr><td> חלבון חרוזי sepharose G / מצופה </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6002-35 </td><td></td></tr><tr><td> ביוטין-BMCC </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21900 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-HRP </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21126 </td><td> לשקם ב1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במים </td></tr><tr><td> מערבי כתם מאגר העקירה </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21059 </td><td></td></tr></tbody></table>

איתור של palmitoylation חלבון בנוירונים ביפוקמפוס מתורבתים ידי immunoprecipitation וacyl-exchange ביוטין (אייב)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation הוא שינוי שומנים שלאחר translational לערב את הקובץ המצורף של חומצת 16-פחם רווי שומן, Palmitate, לשאריות ציסטאין של חלבונים באמצעות מצע רופף thioester אג&quot;ח [סקר ב1]. Palmitoylation של חלבון מצע מגדיל hydrophobicity, ובדרך כלל מאפשר הסחר שלה לכיוון קרום תא. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו palmitoylation להיות אחד שינויי השומנים הנפוצים ביותר בתאי העצב 1, 2, טוען כי מחזור Palmitate הוא מנגנון חשוב שבו תאים אלה להסדיר את המיקוד ואת הסחר של חלבונים. זיהוי והאיתור של מצעי palmitoylated לכן יכולים לשפר את ההבנה שלנו של סחר בחלבון בתאי עצב. איתור של palmitoylation חלבון בעבר כבר הפריע מבחינה טכנית עקב חוסר הסכמה בין רצף חלבוני מצע, וההסתמכות על labeli מטבוליתng של Palmitoyl-חלבונים עם 3 H-Palmitate, assay יוכימי זמן רב עם רגישות נמוכה. פיתוח של assay acyl-Exchange ביוטין (אייב) מאפשר זיהוי מהיר ורגישות גבוה יותר של חלבוני palmitoylated 2-4, והוא אופטימלי למדידת התחלופה הדינמית של Palmitate על חלבונים עצביים. Assay אייב מורכב משלושה צעדים ביוכימיים (איור 1): 1) בלתי הפיך מצור של קבוצות thiol ציסטאין ללא שינוי באמצעות N-ethylmaliemide (nem), 2) מחשוף ספציפי והסרת מסכות קבוצת thiol של ציסטאין palmitoylated ידי hydroxylamine (שינקין), ו 3) תיוג סלקטיבית של ציסטאין palmitoylated באמצעות ריאגנט biotinylation thiol-reactive, ביוטין-BMCC. טיהור של חלבוני thiol-biotinylated בעקבות הצעדים שלאייב שונה, בהתאם למטרה הכללית של הניסוי. כאן, אנו מתארים שיטה לטיהור חלבון palmitoylated עניין בhippocamp העיקריהנוירונים al ידי immunoprecipitation ראשוני (IP) צעד באמצעות נוגדן המכוון נגד החלבון, ואחרי בדיקת אייב והמערבי סופגים ישירות כדי למדוד את רמות palmitoylation של חלבון, הנקרא בדיקת ה-IP-ABE. תרבויות בצפיפות הנמוכה של נוירונים ביפוקמפוס עכברוש העובריים היו בשימוש נרחב כדי ללמוד את הלוקליזציה, פונקציה, וסחר בחלבונים עצביים, מה שהופך אותם אידיאלי ללימוד palmitoylation חלבון העצבי באמצעות בדיקת ה-IP-ABE. בדיקת ה-IP-ABE בעיקר דורשת IP סטנדרטי וריאגנטים מוחים מערביים, ומוגבל רק על ידי הזמינות של נוגדנים נגד מצע היעד. assay זה יכול בקלות להיות מותאם לטיהור והגילוי של חלבונים בתרבויות palmitoylated transfected Heterologous סלולריים, תרבויות העצביות עיקריות הנגזרות מרקמות מוח השונות של עכבר והן את העכברוש, ורקמת מוח אפילו עיקרית עצמו.

בדיקת ה-IP-ABE במיוחד מזהה thiol-palmitoylation של שאריות ציסטאין לאורך חלבוני מצע, והוא יכול לשמש כדי לזהות palmitoylation של חלבונים העצביים immunoprecipitated באופן מתואר באיור 1. טיפול בחלבון העצבי immunoprecipitated עם HAM (איור 1) וחותך את הצמדת thioester בין קבוצת thiol של ציסטאין Palmitate ו, המאפשר שילוב ספציפי של ביוטין-BMCC על קבוצת thiol חדש הזמינה, שניתן לאתר בהמשך באמצעות סופג מערבי. המחדל של מחשוף HAM (מינוס-HAM) מונע התאגדות של ביוטין-BMCC ופונקציות כמו שליטה שלילית לPalmitoyl-biotinylation הספציפי של המדגם בתוספת-HAM, ולכן תמיד יהיה להפעיל בסמוך למדגם בתוספת-HAM למערבי סופג ידי SDS-PAGE (איור 2). בניסוי אופטימיזציה (איור 2 א), palmitoylationאות של חלבון δ-catenin העצבי 2 יכולה להיות מזוהית בקלות על ידי סופג לביוטין-BMCC בריכוז של 1 מיקרומטר, באמצעות streptavidin מצומד עם HRP, נגד דגימות מינוס ופלוס HAM מקבילות. אות palmitoylation הספציפית ל- catenin δ מופיעה בגודל החזה שלה 160kD, רק בתוספת המדגם-HAM. הספציפיות של האות הזה אושרה על ידי reprobing לδ-catenin עם הנוגדן הספציפי שתחילה שמש לimmunoprecipitate, וכתוצאה מכך אות בשני טיפולי HAM באותו גודל חזה. אופטימיזציה של assay IP-ABE (איור 2 א) תגרום פרופיל סופג מערבי של מדגם מינוס HAM שהוא בקלות להבחין ממדגם הפלוס HAM, ומציגה מינימאלי או ללא אות palmitoylation. הריכוז של ביוטין-BMCC לשמש תווית cysteines palmitoylated דורש אופטימיזציה זהירה, ואם ריכוז להרוות סופר של דוotin-BMCC משמש במהלך שלבי אייב כימיה (איור 2 ב &#39;), הרקע מוגזם ואותות שאינם ספציפיים יהיה גלוי. עקומת תגובה ליניארי biotinylation של חלבון palmitoylated עצבי, הקולטן אצטילכולין α7 ניקוטינית, ביוטין באמצעות-BMCC העבר נקבעה 6, ומראה ליד רוויה מלאה בריכוז של 5-10 מיקרומטר. למרות שהריכוז האופטימלי של ביוטין-BMCC יסטה מעט בהתאם לחלבון המטרה העצבי, טיפול ביוטין-BMCC בריכוז העולה על 5 מיקרומטר צפויים סופר להרוות את חלבון המטרה, ותוצאה בפרופיל כתם מערבי עם רקע גלוי ואותות שאינם ספציפיים. ריכוז של 0.5 מיקרומטר לביוטין-BMCC שמש בעבר כדי לזהות palmitoylation של חלבונים עצביים אחרים כולל SNAP-25, huntingtin, יחידות משנת רצפטור AMPA GluA1 וGluA2, וparalemmin 8, וקביעת הריכוז האופטימלי לרומןחלבון המטרה יכול להתבצע על ידי ניסוי וטעייה באופן ליניארי, החל בטווח של 0.5-5 מיקרומטר שאנו מתארים כאן. פרופילי תוצאת streptavidin המערבי הכתם בין דגימות מינוס ופלוס HAM לpalmitoylation δ-catenin נראים דומים כאשר טופלו עם 4 מיקרומטר ביוטין-BMCC (איור 2 ב &#39;), עם אותות רקע נוספים בגדלים שונים, המצביעים על כך biotinylation ההולם התרחש. Hydroxylamine הוא סוכן צמצום חזק כי תוצאות בשפלה מוגבלת של חלבון המטרה, בנוסף למחשוף היעיל של thioester הצמדה. כתוצאה מכך, אופטימיזציה של אייב כימיה מחייבת אחד ללנרמל את כמות חלבון immunoprecipitated משמש לדגימות מינוס ופלוס HAM (שלבים 3.2-3.3). נורמליזציה דורשת שימוש בכמות הכפולה של חלבון המטרה משותקת בפלוס לעומת מדגם מינוס HAM, אשר למעשה גורם Wester נבדלn סופג פרופילים לחלבון המטרה, כפי שמוצגים לδ-catenin (איור 2 א &#39;, ב&#39;). עם זאת, אם כמות חלבון המטרה משותקת אינה מנורמלת בין דגימות מינוס ופלוס HAM, אות הכתם המערבית כתוצאה לחלבון המטרה בדגימה בתוספת-HAM יכולה ללכת לאיבוד, כפי שמוצגת לδ-catenin כאשר כמויות שווות של חלבון היה בשימוש בשני טיפולי HAM (האיור 2C). הספציפיות של אייב כימיה לתיוג חלבוני palmitoylated הן מאוד רגישות ודורשות אופטימיזציה. את המלכודות הנפוצות נתקלו במהלך בדיקת ה-IP-ABE כוללות את התוצאות תת אופטימליות מוצגות באיורים ו2B 2C, והשפלה של חלבון המטרה, ללא תלות בטיפול HAM, אשר בדרך כלל נגרם על ידי חומרים כימיים וחוצצים מבוגרים, וחומציות נכונה. על מנת להימנע מהמלכודות הללו ולתקן לכימית אייב תת אופטימלית, הרעננות והריכוז של החומרים כימיים הנדרשות למאגרים מופיעים בטבלה 1 תמיד יש לבחון, ואת התאמות pH של כל המאגרים תמיד יש לבדוק לפני הפעלת הניסוי. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> בלם </td><td> ריכוז עבודה </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> מאגר תמוגה (LB) </td><td> במזוקק H 2 O:% 1-630 CA pH7.5 150mm NaCl גליצרול IGEPAL 50mm טריס-HCl 10% </td><td> N / </td><td> הכן לפני הניסוי והחנות ב 4 ° C </td></tr><tr><td> פתרון nem </td><td> ב% EtOH 100: אבקת lyophilized nem </td><td> ז 2 </td><td> הכן טרי, מייד לפני השימוש. </td></tr><tr><td> מאגר מחמיר </td><td> בLB: 10 מ&quot;מימ MEM 0.1% SDS </td><td> N / </td><td> הכן זמן קצר לפני השימוש, לשמור על קרח. </td></tr><tr><td> pH 7.2 LB </td><td> בLB: התאם PH בדיוק 7.2 </td><td> N / </td><td> השתמש במד pH להתאים pH מייד לפני השימוש. </td></tr><tr><td> מאגר HAM </td><td> בחומציות LB 7.2: פתרון HAM המלאי </td><td> 1 ז (ריכוז HAM סופי) </td><td> הכן מייד לפני השימוש. </td></tr><tr><td> LB pH 6.2 </td><td> בLB: התאם את ה-pH בדיוק 6.2 </td><td> N / </td><td> זהה לרמת חומציות 7.2 LB </td></tr><tr><td> פתרון המניות ביוטין-BMCC </td><td> בDMSO: 2.1 מ&quot;ג פתרון ביוטין-BMCC </td><td> 8 מ&quot;מ </td><td> הכן מייד לפני השימוש. </td></tr><tr><td> מאגר ביוטין-BMCC </td><td> בpH 6.2 LB: הוסף פתרון ביוטין-BMCC </td><td> 1-5 מיקרומטר (ריכוז סופי ביוטין-BMCC) </td><td> הכן מייד לפני השימוש. </td></tr><tr><td> 2<html> מאגר x SDS לדוגמה, לא סוכני הפחתה </td><td> במזוקק H 2 O: 5% SDS 5% גליצרול 125mm טריס-HCL-pH 6.8 0.01% Bromophenol הכחול </td><td> N / </td><td> הכן לפני הניסוי, ולאחסן ב -20 ° C עד שימוש. להשלים עם DTT 5 מ&quot;מ לפני השימוש. </td></tr></tbody></table> טבלת 1. חוצצים וריאגנטים הנדרשים לבדיקת ה-IP-ABE. רבים של מאגרי תמוגה יכולים להיות מוכנים לפני תחילת הניסוי, לעומת זאת pH צריך להיות מסומן ומותאם מייד לפני שימוש עם מד pH, כדי להבטיח את ההצלחה של כימית אייב. רוב פתרוני מניות צריכים להיות מוכן טרי עבור כל ניסוי, מייד לפני השימוש. רבים מהמאגרים דורשים ריאגנטים משותפים למרבית המעבדות המצוידות לביוכימיה, וריאגנטים מיוחדים עם פרטי ספקים מופיעים בטבלה של חומרים כימיים ובציוד. דף = &quot;תמיד&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1.jpg" alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1highres.jpg" /> איור 1. סכמטי של immunoprecipitation וassay Exchange acyl-ביוטין (IP-ABE) כדי לטהר ולזהות palmitoylation של חלבונים עצביים. נוירונים ביפוקמפוס מתורבתים הם lysed, (1) חלבון המטרה הוא אז מטוהר באמצעות נוגדן היעד ספציפי, ומשותק על sepharose חרוזים מצופים בחלבון G או A. חלבון המטרה המטוהרת אז (2) טופל בN-ethylmaliemide (nem) באופן בלתי הפיך לקשור ולחסום קבוצות בחינם thiol (-SH) יחד cysteines ללא שינוי (C). חלבון המטרה הוא לאחר מכן (3) נתון לטיפול עם hydroxylamine (שינקין), וכתוצאה מהמחשוף ספציפי של אג&quot;ח thioester בcysteines palmitoylated והסרת מסכות קבוצת thiol palmitoylated חופשיה (-SH). בשלב בא, חלבון המטרה הוא (4) treateד עם מולקולת thiol-reactive ביוטין, ביוטין-BMCC, וכתוצאה מbiotinylation הספציפי של ציסטאין palmitoylated. לבסוף, (5) חלבון המטרה biotinylated הוא eluted והוסר מהנוגדנים והחרוז. חלבון המטרה עם ציסטאין palmitoylated (הים) מתויג בביוטין הוא עכשיו מתאים לאלקטרופורזה SDS פולי acrylamide ג&#39;ל (SDS-PAGE), וסופג עם streptavidin לזהות לpalmitoylation של החלבון העצבי המטוהר מערבית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה</a> . <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2.jpg" alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2highres.jpg"/> איור 2. איתור של palmitoylation של δ-catenin החלבון העצבי באמצעות בדיקת ה-IP-ABE. נוירונים ביפוקמפוס עכברוש ראשוניים היו מבוגרים בטרוםתאר מטבע דברים 5, בצפיפות של 130 תאים / מ&quot;מ 2 עד לפדיון ב14DIV, אז היו lysed, ונתונים לבדיקת ה-IP-ABE לזהות palmitoylation של מצע זוהה לאחרונה palmitoylated עצבי, δ-catenin 2. Immunoprecipitates מטוהר (IPS) של δ-catenin (חלבון המטרה) היינו מבודד באמצעות 5 מיקרוגרם של נוגדן δ-catenin לדגימה (מעבדות תמרת BD), ולאחר מכן נחשפו לSDS-PAGE במקביל מינוס ופלוס hydroxylamine (שינקין) דגימות. Palmitoylation זוהה על ידי מערב סופג (WB) עם streptavidin-HRP (palmitoylation), והקרום הופשט ונתונים לreprobe WB לδ-catenin. () תוצאה אופטימלית נציג ה-IP-ABE ל- catenin δ palmitoylated (ראש החץ) שטופל עם מיקרומטר 1 ביוטין-BMCC, הממחיש את הספציפיות של אייב כימיה לאיתור חלבוני thiol-palmitoylated מדגימות ה-IP. (ב) מייצג תת אופטימליתוצאת IP-ABE sentative ל- catenin δ, שם ריכוז עודף של 4 מיקרומטר ביוטין-BMCC היה בשימוש, וכתוצאה מאותות שאינם ספציפיים ורקע בשתי דגימות מינוס ופלוס HAM (חיצים). (ג) נציג אחר תת אופטימלי IP-ABE WB ל- catenin δ, שבו ריכוז 4 מיקרומטר מוגזם של ביוטין-BMCC היה בשימוש, ואת כמות החלבון המשמשת למדגם IP הפלוס HAM לא מנורמל לHAM-תיווך פירוק חלבונים, וכתוצאה מכך אבדה את האות בreprobe WB לδ-catenin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

בנוסף ההפיך של Palmitate לחלבונים הוא רגולטור חשוב של סחר בחלבונים תאי. זו היא עניין מיוחד בתאי עצב שבו חלבונים סינפטיים רבים palmitoylated. אנו משתמשים בשיטה ביוכימית פשוטה לזהות חלבונים בתאי עצב בתרבית palmitoylated, שניתן להתאים למספר רבים של סוגי תאים ורקמות.

איתור של palmitoylation חלבון בנוירונים ביפוקמפוס מתורבתים ידי immunoprecipitation וacyl-Exchange ביוטין (אייב)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ולזהות חלבונים עצביים הקשורים לפואידים מנוירונים מתורבתים באמצעות בדיקה ביוכימית פשוטה וניתנת להתאמה. זה מושג על ידי מיצוי וקיבוע של חלבון המטרה בנוכחות אתיל או NEM כדי להבטיח חסימה של כל קבוצות התיול החופשי. השלב השני הוא לטפל בחלבון המטרה המשותק עם הידרוקסיל ממוצע או חזיר, כדי לבקע את קישור התיואסטר בין שאריות הציסטאין בכף היד למולקולת הפלמיטט.זה משחרר את קבוצת סגנון הציסטין הפלמית והופך אותה לזמינה לתיוג בשלב השלישי. חלבון המטרה המשותק מודגר עם קובץ ביוטין B-M-C-C-A מולקולה ספציפית המתויגת בביוטין, ביוטין זה מרומם ומתייג, קבוצת Thile שהייתה במקור pyl. השלב האחרון הוא לזהות את רמת ה-pation של חלבון המטרה על ידי דף SDS וכתמים מערביים עבור Strp Aden.בסופו של דבר, בדיקת IP A BE משמשת להצגת רמות של פלמיטט שומני המחובר באופן הפיך לחלבון מטרה עצבי, ויכול גם לזהות שינויים עדינים בחלבוני המטרה. רמות פיציון. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו זיהוי חלבון, השחתת כף היד באמצעות תיוג מטבולי עם תכונה A palmate הוא שבדיקת חילופי הביוטין של אציל רגישה יותר וגוזלת פחות זמן.בדיקת A BE מאפשרת גם הערכות כמותיות יותר של השחתת כף היד ומתאימה באופן אופטימלי לאיתור שינויים קטנים ברמות השחתת כף היד. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לזיהוי חלבונים בכף היד ונוירונים בהיפוקמפוס מתורבתים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון תרביות עצביות ראשוניות מאזורי מוח אחרים, קווי תאים הטרולוגיים ואפילו רקמות ראשוניות. כדי להתחיל במיצוי חלבון מטרה מנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס מתורבתים, הכינו את מאגר הליזיס ותמיסת NEM כמתואר בהליך הכתוב הנלווה לסרטון זה.לאחר מכן, שלב את מאגר הליזיס ותמיסת NEM על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של תמיסת NEM דו-טוחנת לצינור חרוטי טרי של 50 מיליליטר. הוסף 20 מיליליטר של מאגר ליזה מעל. הוסף תמיד תחילה את תמיסת האתנול NEM ואת מאגר הליזיס שנית, כדי לערבב כראוי את השניים בחדר קר של ארבע מעלות צלזיוס, הניחו במהירות את התערובת על משטח נדנדה לערבוב מלא למשך חמש דקות.הסר נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדות מתורבתים מהחממה הוראות כיצד לתרבית. ניתן למצוא את הנוירונים בטקסט לאחר הנחת הנוירונים המתורבתים על קרח. הסר בעדינות את המדיה הסלולרית.שטפו בעדינות את הנוירונים פעמיים עם מי מלח קרים עם פוספט. לאחר מכן, הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר ליזה בתוספת 50 מילי-מולרי NEM לבאר הראשונה של נוירונים בהיפוקמפוס וגרד תאים באמצעות מרים תאים חד פעמי. אסוף את הליזאט של התא ואז שחרר את הליזאט לבאר הבאה של אותה קבוצה.מגרדים את התאים בתוך הבאר השנייה באמצעות מרים התאים. אוספים וחוזרים על השימוש בבאר שלישית במידת הצורך. כדי לרכז עוד יותר את הליזאט, אסוף את ליזאט התא לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר לפני קירור.הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה בתוספת 50 מילי-מולרי NEM לבאר הראשונה וחזור על תהליך גירוד הריתוך כדי לאסוף את כל ליזאט התא שנותר. העבירו את הליזאט הכולל של התא דרך מזרק בגודל 26 וחצי חמש עד שש פעמים כדי לסייע בליזה מכנית. היזהר לא לפוצץ בועות לתמיסה.מוטציה של ליזאט התא למשך 30 דקות לפחות בארבע מעלות צלזיוס לאחר צנטריפוגה. אסוף את הליזאט של התא הנקי בצינור חדש של 1.5 מיליליטר לפני קירור על קרח. חזור על פרוטוקול הקציר המודגם עבור כל קבוצות התאים.מדוד את ריכוז החלבון בכל דגימות הליזאט באמצעות בדיקת BCA. לפי הוראות היצרן. נרמל את הנפח של כל דגימות הליזאט מקבוצות תאים כך שיהיה חלבון שווה בדיוק עם מינימום מומלץ של 500 מיקרוגרם.מלא את כל הדגימות במאגר ליזה בתוספת 50 מילימולר NEM עד 500 מיקרוליטר נפח כולל. לאחר מכן, הוסף 1 עד 5 מיקרוגרם של נוגדן ראשוני המכוון נגד חלבון המטרה לכל דגימת ליזאט. מוטציה של דגימות מעורבות של ליזאט נוגדנים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס לפני שתזרז ותשתק חלבון מטרה.הכן תרחיץ של 50% של מהירויות SRO מצופות חלבון A או חלבון G כמתואר בפרוטוקול הכתוב. כשלב אחרון, הוסף נפח שווה של 50% slurry לכל דגימת ליזאט נוגדנים, ובצע מוטציה למשך שעה לפחות בארבע מעלות צלזיוס. בביצוע ael, החלפת ה-pH והטמפרטורה הנכונים של כל המאגרים והריאגנטים כמו גם טריותם הם קריטיים.כדי להבטיח ניסוי מוצלח. התחל את מחשוף החזיר בהכנת מספר צינורות עם מאגר ליזה של phs שונים. ה-pH חשוב מאוד לשלבים אלה ויש להתאים אותו תמיד.בעזרת מד pH לכל דגימה, הכינו שני מיליליטר של מאגר ליזה pH 7.2 ו-0.5 מיליליטר של מאגר מחמיר שהוכן במאגר ליזה. הכן גם 0.5 מיליליטר של מאגר ליזה בתוספת 10 מילי-מולרי NEM לדגימה. הוסף טבליות PMSF ומעכבי פרוטאז לכל מאגרי הליזיס.הידרוקסיל ממוצע או חזיר משמש לפיצול הקשר התיואסטר בין הציסטאין בכף היד לחומצת השומן פלמיטט. זה חיוני כדי לשחרר את קבוצת סגנון הציסטאין בכף היד ולהפוך אותה לזמינה לתיוג עם ביוטין. השמטת מחשוף חזיר יכולה אפוא לשמש כבקרה שלילית שימושית.הכן צינורות נוספים של 1.5 מיליליטר על קרח המסומן כבקרת מינוס חזיר עבור כל דגימה לאחר הדגירה של הנוגדן עם ליזאט התא. ואז עם החרוזים, צנטריפוגה בעדינות את כל חרוזי הדגימה ב-0.5 פעמים G למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס כשהצינורות על קרח. הסר את הסופרנטנט והחזיר את החרוזים ב-600 מיקרוליטר של מאגר ליזה בתוספת 10 מילי-מולארי NEM.לאחר ש-Resus השעתה את כל חרוזי הדגימה, אספו מיד 200 מיקרוליטר מהדגימות, חרוזי ליזאט, ופרקו לתוך צינור החזיר של הדגימה על קרח, והשאירו 400 מיקרוליטר של תמיסת חרוזי הליזאט של כל דגימה בשפופרת עבור דגימת החזיר פלוס. זאת כדי להסביר את הפירוק המוגבל של חלבון המטרה שנגרם על ידי טיפול בבשר חזיר. שליש מהחרוזים משמשים לטיפול במינוס חזיר ושני השלישים הנותרים משמשים לטיפול בבשר חזיר פלוס.הוסף עוד 300 מיקרוליטר של מאגר ליזה בתוספת 10 מילי-מולרי NEM לדגימת החזיר המינוס. פיפטה 100 מיקרוליטר נוספים לדגימת החזיר פלוס בסך הכל 500 מיקרוליטר בכל דגימה. דגרו את הצינורות למשך 10 דקות על קרח ולאחר מכן המשיכו לשטוף את דגימות החזיר מינוס ובתוספת בשר חזיר כמתואר בנוהל הכתוב לאחר שטיפת הדגימה ב-0.5 מיליליטר לדגימה של מאגר ליזה pH 7.2 לכל דגימות החזיר מינוס.הוסף 0.5 מיליליטר לדגימה של מאגר חזיר לכל דגימות החזיר פלוס. לאחר מכן בצע מוטציה של כל הדגימות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. אין לחרוג משעה אחת לאחר הטיפול בבשר חזיר.בצע החלפת אציל ביוטין על ידי תיוג ביוטין BMCC כפי שנדון בנוהל הכתוב. לאחר השלמת תיוג BMCC של ביוטין, שטפו בעדינות את הדגימות כמתואר בטקסט. הסר את חומר העל של הכביסה הסופית, והשאיר את החרוזים הגלולים בתרחיץ עם חיץ שנותר בתחתית הצינור.טבלו פיפטה עם קצה בקוטר קטן בתחתית הצינור דרך השפלה ואספו במהירות את כל המאגר שנותר. להיזהר לא לקחת חרוזים. הוסף 40 עד 50 מיקרוליטר של שני x מאגר דגימה בתוספת חמישה מילימולר DTT לכל דגימה.במידת הצורך. מערבולת את החרוזים כדי להתערבב לחלוטין עם מאגר הדגימה ומיד צנטריפוגה במהירות גבוהה כדי לאסוף את כל החרוזים בגלולה השקועה במאגר הדגימה. לאחר הרתחת הדגימות וצנטריפוגה שוב, הוסף את הנפח המלא של החלבון החמקמק בסופרנטנט מכל דגימה לנתיב יחיד בתוך ג'ל פולי אקרילאמיד המתאים לכתמים מערביים.באמצעות דף SDS, ארגן את כל הדגימות כך שבקרת החזיר מינוס elu ובתוספת ham elu עבור דגימה בודדת יופעלו מיד בסמוך זה לזה. במהלך דף SDS לאחר דף SDS שהועבר ל-A-P-V-D-F או ממברנת ניטרוצלולוזה, התחל בכתמים מערביים עם שטיפה וחסימה כמתואר בנוהל הכתוב, הכין תמיסת נוגדנים של TBST בתוספת 0.3% BSA, הוסף נוגדן סטרפטווידין HRP, שהורכב מחדש במיליגרם אחד למיליליטר במים מזוקקים. שוטפים את הממברנה פעם אחת ב- TBST למשך 10 דקות.לאחר מכן דגרו את הממברנה בתמיסת נוגדנים STREPTAVIDIN על משטח נדנדה למשך שעה בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. שוטפים את הממברנה שלוש פעמים ב- TBST למשך 10 דקות על פלטפורמת נדנדה. על מנת לזהות את אות הפציון, חשוף את זוהר ה-HRP באמצעות ערכת מצע כימילומינסנט על מנת לנרמל את רמות הפציה לכמות החלבון המעניין שהיה משקע חיסוני.הפשיטו את הממברנה באמצעות מאגר הפשטה של Western Blott למשך חמש עד 10 דקות על משטח נדנדה בטמפרטורת החדר. חזור על שלבי הכתם המערבי באמצעות הנוגדן העיקרי כנגד החלבון המעניין ששימש במקור למשקעים החיסוניים. כימות של החלבון המעניין באמצעות תוכנת ניתוח תמונה ונרמל את רמות הפציה לכמות החלבון המשקע החיסוני.בדיקת I-P-A-B-E מזהה באופן ספציפי את שאריות הציסטין לאורך חלבוני הסובסטרט וניתן להשתמש בה כדי לזהות פטציה של חלבונים עצביים משקעים חיסוניים. טיפול בחלבון העצבי המושקע החיסוני עם חריצי חזיר, הקשר התיואסטר בין פלמיטט לקבוצת סיסטין תאל המאפשר שילוב ספציפי של ביוטין BMCC בקבוצת הקבצים החדשה הזמינה, אותה ניתן לזהות לאחר מכן באמצעות כתמים מערביים. השמטת מחשוף החזיר מונעת שילוב של ביוטין BMCC ומתפקדת כבקרה שלילית על התרוממות ביוטין ספציפית של דגימת החזיר פלוס.לכן, יש להפעיל תמיד את בקרת המינוס חזיר בסמוך לדגימת פלוס חזיר לכתמים מערביים על ידי דף SDS. בניסוי אופטימלי, ניתן לזהות בקלות את אות ה-pation של החלבון העצבי דלתא קטנין על ידי ספיגת ביוטין BMCC בריכוז של מיקרו-מולרית אחת באמצעות סטרפטווידין מצומד עם HRP כנגד דגימות מקבילות מינוס פלוס חזיר. אות הפציה הספציפי לדלתא קיין מופיע בגודלו החזוי של 160 קילודלטון רק בדגימת היד הפלוס.הספציפיות של אות זה אושרה על ידי בדיקה חוזרת לדלתא קטנין עם הנוגדן הספציפי ששימש בתחילה למשקעים חיסוניים וכתוצאה מכך אות בשני טיפולי החזיר באותו גודל חזוי. אופטימיזציה של בדיקת I-P-A-B-E תביא לפרופיל כתמים מערבי של דגימת חזיר מינוס שניתן להבחין בקלות מדגימת החזיר פלוס ומציג אות פטציה מינימלי עד ללא אות. ריכוז הביוטין BMCC המשמש לתיוג PALMATED CYSTINES דורש אופטימיזציה קפדנית ואם נעשה שימוש בריכוז סופר רווי של ביוטין BMCC במהלך שלבי הכימיה A BE, ניתן יהיה לראות אותות רקע מוגזמים ולא ספציפיים.הדגימות המופשטות המתקבלות בפרופילי הכתם המערבי בין דגימות המינוס והפלוס חזיר עבור דלתא קטין והשחתת כף היד נראות דומות כאשר טופלו בארבעה BMCC ביוטין מיקרו-מולרי עם אותות רקע נוספים בגדלים שונים, מה שמצביע על כך שהתרחש ביוטין לא מתאים. מכיוון שהידרוקסי לאמין הוא חומר הפחתה רב עוצמה המביא לפירוק מוגבל של חלבון המטרה, יש צורך לנרמל את כמות החלבון המשקע החיסוני המשמש לדגימות מינוס פלוס חזיר. נורמליזציה דורשת שימוש בכמות כפולה של חלבון מטרה משותק בפלוס לעומת דגימת החזיר המינוס, מה שמביא לפרופילי כתמים מערביים בלתי ניתנים להבחנה עבור חלבון המטרה כפי שמוצג עבור דלתא קטנין.עם זאת, אם כמות חלבון המטרה המשותק אינה מנורמלת בין דגימות מינוס פלוס חזיר, ניתן לאבד את אות הכתם המערבי שנוצר עבור חלבון המטרה בדגימת פלוס חזיר כפי שמוצג עבור דלתא קטנין כאשר נעשה שימוש בכמויות שוות של חלבון בשני טיפולי החזיר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לחלץ את החלבון העצבי שבחרתם מתאי עצב בהיפוקמפוס מתורבתים. השתמש בכימיה של BE כדי לזהות אם זהו מצע להשחתת כף היד בזמן מינימלי ולהיות מסוגל להתאים פרוטוקול זה לשימוש בקווי תאים ורקמות אחרות.

detection-protein-palmitoylation-cultured-hippocampal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הסרטון מדגים את ניתוח מצב הפלמיטוילציה של חלבוני קרום התא המבודדים מרקמת מוח העכבר. התהליך כולל חשיפת הציסטאין הלא-פלמיטוילטי וחסימתם, ולאחר מכן שימוש בפולימר שנקשר לציסטאין הפלמיטוילטי, ומסייע בהערכת מצב הפלמיטוילציה של החלבונים המבודדים.

הערכת מצב הפלמיטוילציה של חלבוני קרום התא מרקמת מוח של עכבר

סחר קרום עצבי דינמי שולט זמינה פלזמה קרום חלבון ומשמעותי עצבית משפיע. נכון להיום, זה כבר מאתגר למדוד סחר endocytic עצבי בנוירונים בוגרים. כאן אנו מתארים שיטה יעילה מאוד, כמוני למדידת שינויים מהירים בביטוי חלבון פני השטח vivo לשעבר בפרוסות מוח חריפות.

המוח פרוס Biotinylation:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

שתי שיטות biotinylation מבוססות, שנועדו לקביעת ביטוי פני התא ואת שיעור endocytic של חלבונים לידי ביטוי בקרום פלזמה, מוצגים בדוח זה.

קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation

חוקרים רבים, שינויים post-translational אנדוגני על חלבון המטרה יכול להיות מאוד מאתגר. טכניקות המתוארים כאן לנצל את פירוק ממוטבת מאגר ומסנן מערכת שפותחה עם ספציפי PTM פילוח, מטריצות זיקה לזהות את השינויים זרחון acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 וטירוזין עבור מטרה חלבון באמצעות מערכת יחיד, יעיל.

ניצול מערכת העשרה Immunoprecipitation מקיף כדי לזהות פרופיל אנדוגני שינוי Post-translational של חלבונים היעד

מאמר זה מציג פרוטוקול מודולרי עבור ליפידומיקה של רקמות ותעתיק, ושומנים פלזמה במודלים עכבר מחלה נוירולוגית מיקוד שומנים המשמשים דלקת ופעילות עצבית, שומנים ממברנה, שליחים במורד הזרם, ואנזימים קידוד mRNA/קולטנים שבבסיס תפקוד השומנים. הליכי דגימה, עיבוד מדגם, מיצוי וכימות מפורטים.

ליפידומיקה ותעתיק במחלות נוירולוגיות

Acyl-מירוץ (acyl-שרף בסיוע לכידת) הוא רגיש מאוד, אמין וקל לבצע שיטה לזיהוי שינוי השומנים הפיך של שאריות ציסטאין (S-acyl) במגוון של דגימות ביולוגיות.

זיהוי חלבון S-אכלציה באמצעות לכידת הסיוע Acylation-שרף

Palmitoylation כרוך התאגדות של 16-פחמן palmitate moiety לשקעי ציסטאין של חלבונים היעד בצורה הפיכה. כאן, אנו מתארים גישה ביוכימית, השינוי של ה-acyl-PEGyl משמרת ג'ל, כדי לחקור את מצב הפלמיטלציה של כל חלבון של עניין במוח העכבר ליסביטים.

Acyl-PEGyl החליפין ג'ל שינוי שיטת להגדרה כמותית של פלמילציה של חלבונים קרום המוח

המחקר של acylation שומן יש השלכות חשובות אינטראקציות חלבון הסלולר ומחלות. מוצג כאן הוא פרוטוקול שונה כדי לשפר את זיהוי הכימיה קליק של חלבונים acylated שומן, אשר ניתן ליישם בסוגי תאים שונים בשילוב עם בדיקות אחרות, כולל מרדף דופק ספקטרומטריית מסה.

שילוב ממוטב של אנלוגים לחומצת שומן אלקיניל לגילוי חלבונים אצטט שומניים באמצעות כימיה קליק

פרוטוקול פרוטאומיקה של ליזוזום עצבי המתייג קרבה מתואר כאן כדי לאפיין את המיקרו-סביבה הליזוזומלית הדינמית בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. חלבוני קרום ליזוזומליים וחלבונים המקיימים אינטראקציה עם ליזוזומים (ביציבות או בחולף) ניתנים לכימות מדויק בשיטה זו עם רזולוציה מרחבית תוך תאית מצוינת בנוירונים אנושיים חיים.

אפיון של אינטראקטום ליזוזום עצבי עם פרוטאומיקה לתיוג קרבה

הפרוטוקול מציג שיטה להצמדה קוולנטית in vivo של ביוטין לחלבונים על סמך קרבתם לביוטין ליגאז המותך לחלבון מעניין. שינוי זה מאפשר העשרה סלקטיבית של החלבונים באמצעות חרוזי סטרפטווידין לפי הצורך במחקרי אינטראקציה עם חלבונים.

ב Vivo ביוטינילציה של קרבה למחקרי אינטראקציה בין חלבונים ב-Paramecium tetraurelia

למדו לזהות חלבונים מפלמיטוילים בנוירונים מהיפוקמפוס מתורבתים באמצעות שיטת אייב. שיטה ביוכימית רגישה לחקירת תנועת חלבונים תוך-תאית במערכת העצבים.

איתור של palmitoylation חלבון בנוירונים ביפוקמפוס מתורבתים ידי immunoprecipitation וacyl-Exchange ביוטין (אייב)

גלה סרטונים נוספים