Name: הר כולו RNA פלורסנט באתר הכלאה של דרוזופילה עוברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: למדו שיטת FISH פלורסנטית לכלול הר עוברים של Drosophila melanogaster. הטכניקה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של התפלגות RNA ומיקומו במהלך האמבריוגנזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה שנערכה במעבדת Lécuyer נתמכת על ידי מימון מהלאומיים למדעים והנדסת המועצה של קנדה (NSERC), מכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) וFonds דה המשוכללת והנדירה en סנטה קוויבק (FRSQ). פאביו אלקסיס לפבר וגאל Moquin-ודרי נתמכת על ידי מחקר לתואר הראשון studentships NSERC, בעוד קרול Iampietro נתמך על ידי מלגת דוקטורט אנג&#39;לו Pizzagalli.

<ol><li>Wilcox, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+principles+of+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Fundamental principles of in situ hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li>
<li>Lecuyer, E., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+gene+expression+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Mapping the gene expression universe.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).</li>
<li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).</li>
<li>Thisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+expression+of+the+zebrafish+genome+by+large-scale+in+situ+hybridization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening.</a> Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).</li>
<li>Quiring, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li>
<li>Pollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+differential+gene+expression+during+early+Xenopus+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis.</a> Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).</li>
<li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li>
<li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li>
<li>Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+blueprint+for+a+chordate+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulatory blueprint for a chordate embryo.</a> Science. 312, 1183-1187 (2006).</li>
<li>Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GEISHA%2C+a+whole-mount+in+situ+hybridization+gene+expression+screen+in+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos.</a> Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).</li>
<li>Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O'Farrell, P. H., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcribed+genes+are+localized+according+to+chromosomal+position+within+polarized+Drosophila+embryonic+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei.</a> Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).</li>
<li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+embryo+dechorionation%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Drosophila embryo dechorionation.</a> CSH Protoc. , (2007).</li>
<li>Stapleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+gene+collection%3A+identification+of+putative+full-length+cDNAs+for+70%25+of+D.+melanogaster+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes.</a> Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).</li>
<li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+complementary+DNA+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Drosophila complementary DNA resource.</a> Science. 287, 2222-2224 (2000).</li>
<li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+determination+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 3, (2002).</li>
<li>Terashima, J., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+available+food+into+the+number+of+eggs+laid+by+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 1711-1719 (2004).</li>
<li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).</li>
<li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila.</a> Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).</li>
<li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846(2004).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

לצעדי סינתזת בדיקה, אנחנו בדרך כלל לייצר חלליות ניגרו antisense RNA שעתוק במבחנה על ידי מcDNAs תסיסנית באורך מלא מוגבר מפלסמידים נמצאו בדרוזופילה ג&#39;ין האוסף (DGC), משאב המפורט באתר הבא: <a href="http://www.fruitfly.org/DGC/index.html" target="_blank">http://www .fruitfly.org / DGC / index.html</a> 14,15. גישה זו נמצאת בשימוש נרחב במחקרי איש בקנה מידה גדולים שנועדו ביטוי מיפוי גנטי ודפוסי לוקליזציה mRNA בעוברי זבובים 9,16. פלסמיד...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> T7, RNA פולימראז T3 או SP6 </td><td> Fermentas מדעי חיים </td><td> EP0101, EP0111, EP0131 </td><td> ערכות מכילות מאגר התגובה. </td></tr><tr><td> DIG-RNA תיוג מיקס </td><td> רוש יישומי מדע </td><td> 11 277 073 910 </td><td></td></tr><tr><td> RNAguard </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 27-0816-01 </td><td></td></tr><tr><td> יצטט נתרן 3M </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100% אתנול קר. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 70% אתנול קר. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> פתרון אקונומיקה מדוללת במים 01:01. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heptane </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> מתנול </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> proteinase K </td><td> סיגמה אולדריץ Oakville, ON, קנדה </td><td> המספר P2308 </td><td></td></tr><tr><td> 40% תמיסת פורמלדהיד, מוכן טרי </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS-Tween פתרון (PBT) </td><td></td><td> 1xPBS, 0.1% Tween-20 </td><td></td></tr><tr><td> גליצין פתרון </td><td></td><td> 2 מ&quot;ג / המ&quot;ל גליצין בPBT </td><td></td></tr><tr><td> עכבר חד שבטי HRP-מצומדות אנטי DIG </td><td> ג&#39;קסון ImmunoResearch מעבדות Inc </td><td> 200-032 - 156 </td><td> (דילול 1/400 של 1 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון המניות בPBTB </td></tr><tr><td> כבשי HRP-מצומדות אנטי DIG חד שבטיים </td><td> הרוש יישומית Science, Laval, QC </td><td> 1 207 733 </td><td> דילול 1/500 של פתרון המניות בPBTB </td></tr><tr><td> ביוטין מצומדות עכבר חד שבטי אנטי DIG </td><td> ג&#39;קסון ImmunoResearch מעבדות בע&quot;מ, מערב גרוב, פנסילבניה, ארה&quot;ב </td><td> 200-062-156 </td><td> (דילול 1/400 של 1 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון המניות בPBTB </td></tr><tr><td> Streptavidin-HRP הצמוד </td><td> בדיקות מולקולריות, יוג&#39;ין או, ארה&quot;ב </td><td> S991 </td><td> (דילול 1/100 של מניות 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr></tbody></table>

הר כולו rna פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

הערכת דפוסי הביטוי של גן, כמו גם את תכונות לוקליזציה subcellular של רנ&quot;א התעתיקים שלה, הן תכונות מרכזיות להבנת התפקוד הביולוגי שלה במהלך פיתוח. רנ&quot;א כלאה באתר (RNA-ish) הוא שיטה חזקה המשמשת להמחשת מאפייני הפצת RNA, יהיה זה ברמת האורגניזם, סלולרית או subcellular 1. RNA-ish מבוסס על הכלאה של חללית שכותרתו חומצות גרעין (למשל antisense RNA, oligonucleotides) משלימה הרצף של mRNA או יעד שאינו קידוד-RNA של עניין 2. כנוהל מחייב מידע רצף ראשוני בלבד כדי ליצור רצף בדיקות ספציפיות, זה יכול להיות מיושם באופן אוניברסלי למגוון רחב של יצורים ודגימות רקמה 3. ואכן, מספר מחקרי איש בקנה מידה גדול יושם לתעד ביטוי גנים ודינמיקת RNA לוקליזציה באורגניזם מודל שונה, מה שהוביל להקמת משאבי קהילה חשובים 4-11. בעוד מגוון של תיוג בדיקה וזיהוי אסטרטגיות פותח לאורך השנים, השימוש בשילוב של חומרים כימיים זיהוי כותרת-fluorescently וצעדי הגברת אותות אנזימטית מציע שיפורים משמעותיים ברגישות וברזולוציה של ההליך 12. כאן, אנו מתארים ניאון מותאם בשיטת כלאה באתר (FISH) העסקת הגברת אות tyramide (TSA) לדמיין ביטוי RNA ודינמיקת לוקליזציה בעוברי תסיסנית מבוימת. ההליך מתבצע ב96-PCR צלחת פורמט היטב, שמאוד מקל על העיבוד בו הזמני של מספר גדול של דגימות.

כאשר בצעו בהצלחה, הליך זה מציע רמה להדהים משופרת של פרטים במרחב ובזמן הניתוח הזמני של ביטוי גנים ודינמיקת לוקליזציה mRNA במהלך ההתפתחות עוברת תסיסנית מוקדם. ואכן, כפי שמודגם באיור 3 א לננס זוג השלטון הגנטי הקלסי (ריצה), ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לבחון ביטוי גני אירועים באמצעות זיהוי של מוקדי תמליל המתהווים בקבוצות של הבעת גרעינים. בנוסף, כפי שמוצג בפסיפס העובר באיור 3B, השיטה מאפשרת הדמיה של תכונות לוקליזציה mRNA ברזו...

כאן אנו מתארים שלם הר ניאון<em&gt; באתר</em&gt; הכלאת פרוטוקול (דגים) לקביעת מאפייני הביטוי ולוקליזציה של RNAs הביעו במהלך ההתפתחות עוברת בזבוב הפרות,<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em&gt;.

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

הליך זה מתאר שיטת דגים אופטימלית להערכת תכונות ביטוי ולוקליזציה של RNA בעוברי דרוזופילה שלמים. זה מושג על ידי סינתזה ראשונה של בדיקת RNA מסומנת, משלימה למר NA או RNA שאינו מצופה מעניין על ידי שעתוק חוץ גופי של תבנית DNA שנבחרה כראוי. במקביל, כלובי אוכלוסיית זבובים משמשים לקציר, קיבוע וסלסול עוברים בשלב ההתפתחותי הרצוי.לאחר מספר שלבים לאחר הקיבוע, העוברים מוכלאים עם בדיקת ה-RNA האנטי-סנסנטית המסומנת לבסוף, לאחר שטיפה נרחבת של הדגימות, הבדיקה ההיברידית מזוהה על ידי תיוג חיסוני עם נוגדן ספציפי וריאגנטים לזיהוי מצומדים פלואורוכרום, ובכך מספקת קריאה רגישה של התפלגות ה-RNA המטרה. בסופו של דבר, התוצאות מניבות אותות פלואורסצנטיים ברזולוציה גבוהה המנותחים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי על מנת לתעד את תכונות הביטוי המרחבי והטמפורלי של RNA המטרה במהלך אמבריוגנזה של דרוזופילה.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון Northern blot או R-T-P-C-R הוא שניתן להעריך את ביטוי ה-RNA בתוך דגימת רקמה שלמה. בעוד ששיטה זו מיועדת לניתוח תכונות ביטוי RNA בעוברים מוקדמים של דרוזופילה, ניתן להשתמש בה גם לניתוח עוברים בשלבי התפתחות מאוחרים יותר של רקמה שנותחה מזחלים או זבובים בוגרים. היבט חשוב של ההליך שלנו הוא הגדלת מספר המדגם שאנו יכולים להשיג על ידי ביצוע דגים במקום PCR, מה שמגדיל באופן משמע

whole-mount-rna-fluorescent-situ-hybridization-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

דג הזברה, דגים טרופיים קטנים, הפכה לדגם פופולרי ללימוד תפקוד גן במהלך התפתחות מחלה וחוליות. הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה יכול להיקבע על...

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

אנו מתארים הליך רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-תרצה) בעוברים שלמים תסיסנית מאפשרים זיהוי סימולטני וספציפי של שלושה דפוסי הפצת mRNA שונים על ידי מנוגד משקעים צבע.

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

המתואר RNA בחיי עיר הכלאה פרוטוקול מאפשרת הגילוי של RNA כל עוברי דרוזופילה או רקמות גזור. באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter tyramide אות הגברה, תעתיקים שניתן לאתר ברזולוציה גבוהה, רגישות, ואת התפוקה, בעלות נמוכה יחסית.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

כתב יד זה מציג שיטה מפורטת ליצירת X-כרומוזום הזרוע המחקרים וכל ביצוע קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) לבדוק את מצבה של אחותך כרומטידה לכידות ב- prometaphase, מפה של עצרתי  דרוזופילה oocytes. פרוטוקול זה מתאים לקביעת אם הזרוע meiotic לכידות הוא שלם או קטועים ב שונים אחרים.

באמצעות קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) כדי לנטר את מצב היד לכידות ב- Prometaphase, מפה של אני דרוזופילה Oocytes

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור ויזואליזציה, זיהוי, ניתוח ומעקב של סחר האנטי-מסוגגני mRNA בחיים Drosophila ילה מלאנוסטר תא ביצה באמצעות משואות מולקולריות, מיקרוסקופיה דיסק מסתובב, וניתוח קוד פתוח תוכנה.

חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לגילוי ולוקליזציה של חלבון עובר Drosophila ו- RNA מאוסף להטבעה והטבעה מראש, אימונוסטיור ו- mRNA בהכלאה במקום .

פרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה והפצת RNA In-situ בתוך עובר דרוזופילה מוקדם

Expand-Assisted Fluorative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) היא טכניקה חזקה המשלבת מיקרוסקופ הרחבה עם הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לזהות ביטוי של גנים מרובים ברקמה עבה. פרוטוקול זה מתאר את ההתקדמות האחרונה בשיטה ואת התאמתה לתיוג מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה השלמה.

זיהוי מולטיפלקס של ביטוי גנים במוח הדרוזופילה השלם באמצעות פלואורסצנציה איטרטיבית בסיוע הרחבה בהכלאה באתרה

למדו שיטת FISH פלורסנטית לכלול הר עוברים של Drosophila melanogaster. הטכניקה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של התפלגות RNA ומיקומו במהלך האמבריוגנזה.

הר כולו RNA פלורסנט

גלה סרטונים נוספים