יישום קליני של

פרוטוקול זה משנה גנטית תאי T כדי להכניס קולטני אנטיגן כימריים ספציפיים לאנטיגנים של גידולים, ולאחר מכן מפיץ מספרים משמעותיים מבחינה קלינית על תאים המציגים אנטיגן מלאכותי מעוצב. התחל בהעברה חשמלית של היפהפייה הנרדמת. טרנספוזיציה של פלסמידים של DNA לתאים חד-גרעיניים שקטים המבודדים מדם טבורי היקפי או טבור.

לאחר מכן מדוד את יעילות הטרנספקציה באמצעות ציטומטריית זרימה. התרבות המשותפת הבאה, תאי T שעברו טרנספטציה במשך שבעה ימים על K 5 62 הפיקו תאים מציגים אנטיגן מלאכותי בתוספת ציטוקינים אקסוגניים בגירוי של ארבעה שבועות. מחזורי התפשטות ממשיכים לנתח שימור בהקפאה ולשחרר את תאי ה-T החיוביים לרכב האלקטרופוטרים והמופצים ליישום אנושי.

מערכת הטרנספוזיציה של היפהפייה הנרדמת מציעה אלטרנטיבה לגישות העברת גנים מבוססות ויראליות להחדרה יציבה של גן לתא הבחירה. אחד היתרונות העיקריים של מערכת היפהפייה הנרדמת הוא שניתן לשלב גנים בעלות מופחתת בהשוואה לפלסמידים של DNA המשתלבים באמצעות רקומבינציה לא הומולוגית לא לגיטימית. לפיכך, היתרון הוא שניתן להשתמש במערכת היפהפייה הנרדמת כדי לבטא גן בעלות נמוכה וביעילות גבוהה.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יצטרכו בתחילה להתגבר על היעילות של תאי T אלקטרו-T בהתפשטות סלקטיבית של תאי T חיוביים לרכב על תאים המציגים אנטיגן מלאכותי. שני השלבים מאתגרים לשליטה בגלל הצורך בתרבות משותפת. תאי T מהונדסים גנטית על תאים המציגים אנטיגן מלאכותי.

שיטה זו שימושית בתחום האימונותרפיה המאמצת, במיוחד בהעברת גנים יעילה ויצרנית מספר משמעותי קלינית של תאי T. היישום הרחב יותר משתרע לטיפול בסרטן מכיוון שתאי T ממערכת החיסון יכולים להשתנות כך שיהיו ספציפיים לגידול. מי שידגים את ההליך יהיו מרגרט דוסון ומתיו פיולה.

טכנאים מהמעבדה שלי מדללים תחילה את הדם ההיקפי בנפח שווה של P-B-S-E-D-T-A ודם טבורי עם ארבעה נפחים של P-B-S-E-D-T-A, ומניחים לאט לאט 25 מיליליטר של דם מדולל על 12 מיליליטר של פיאל בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את שיפוע הפיאל ב-400 Gs למשך 30 עד 40 דקות ללא הפסקה. כעת העבירו את חלק התא החד-גרעיני לצינור צנטריפוגה טרי של 50 מיליליטר עם P-B-S-E-D-T-A.

העלו את הנפח ל -50 מיליליטר וקצרו את התאים באמצעות צנטריפוגה. שוטפים בעדינות את התאים פעם ב -50 מיליליטר של תרבית שלמה, מדיה וצנטריפוגה ב -400 גרם למשך 10 דקות. לאחר מכן אסוף את כדורי התא ב- CCM בצע ספירת תאים.

שימוש בשיטת אי-הכללת טריאם כחול. התאים החד-גרעיניים יכולים כעת לשמש לאלקטרופורציה או לשימור בהקפאה לשימוש עתידי. אם משתמשים ב-MNC שמור בהקפאה מפשירים במהירות פעמיים 10 עד התאים השמינית לאלקטרופורציה בקנה מידה מלא, העבירו בעדינות את התאים לצינור צנטריפוגה בגודל מתאים המכיל חימום מראש.

אמצעי תרבית RPMI נטולי פנול מלא וגלולה את התאים על ידי צנטריפוגה משעים מחדש את התאים החד-גרעיניים ב-P-F-R-P-M-I מבצעים ספירת תאים ומעבירים את התאים לכלי תרבית תאים בגודל מתאים בריכוז של 10 מתוך ששת התאים למיליליטר. מאזנים את התאים בחממה לחה למשך שעתיים. קצרו את ה-MNC על ידי צנטריפוגה, ואז השעו בעדינות ושלבו את כדורי התאים ב-P-F-R-P-M-I וספרו את התאים כעת העבירו פעמיים 10 ל-MNC השמיני לצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מיליליטר וצנטריפוגה ב-200 גרם למשך 10 דקות ללא הפסקות.

שאפו את הסופרנטנט כך שלא תישאר שאריות מדיה סביב כדור התא. הכינו צלחת סטרילית של 12 בארות עם 10 בארות המכילות ארבעה מיליליטר P-F-R-P-M-I חם ואזנו את הצלחת בחממה לחה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן הרכיבו מחדש את תמיסת האפקטור של Lonzo Nucleo מערכת תאי ה-T האנושיים בהתאם להוראות היצרן לכל תגובה.

Q Vet מכין 100 מיקרוליטר של תערובת מאסטר DNA המכילה תמיסת אפקטור גרעינית NU משלימה. 15 מיקרוגרם של הטרנספוזיציה על פלסמיד וחמישה מיקרוגרם של פלסמיד הטרנספוזיציה. לאחר מכן, פזרו את הגלולה של תאי T והשעו מחדש תערובת מאסטר DNA של תמיסת חיבה גרעינית NU בריכוז תאים סופי של פי 10 מהתאים השביעיים לכל 100 מיקרוליטר.

העבירו בזהירות 100 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל אחת מ-10 קובטות חיבה של גרעין לונזה והקפידו להימנע מבועות. כעת הקש על ה-qve פעם אחת ואלקטרו באמצעות התוכנית U 0 1 4 עבור תאי T לא מגורים. העבירו את הקובטות ואת צלחת 12 הבאר המאזנת למכסה המנוע באמצעות אמוקס של פיפטת העברת קצה עדין ב -500 מיקרוליטר ממדיום התרבות הקדם-חם מהבאר המתאימה לכל ווט.

העבירו את התאים האלקטרופוטורים לצלחת ואפשרו לתאים להתאושש בחממת תרבית התאים למשך שעתיים. לאחר מכן העבירו את התאים מכל הבארות לצינור צנטריפוגה סטרילי וגלו את התאים לאחר שטיפה אחת, פזרו את כדור התא בעדינות והחזירו את השעיה ב-CCM כדי להשיג תרחיף תא בודד. לאחר ביצוע ספירת תאים, התאם את ריכוז התאים כך שיוטה לששת התאים למיליליטר ב-CCM.

לאחר מכן העבירו את תרחיף התא לבקבוק תרבית והניחו בחממה למשך הלילה כדי ליצור תאים שעברו טרנספטציה של EGFP. חזור על פרוטוקול האלקטרופורציה באמצעות חמש פעמים 10 מתוך ששת התאים לכל ווט עם חמישה מיקרוגרם של פלסמיד EGFP בקרת אמוקס. קצרו את התאים האלקטרופוטיים, ולאחר מכן בצעו ספירת תאים בשיטת ההדרה הכחולה של trien.

לאחר מכן צבעו פעם אחת עד פעמיים 10 מתוך ששת התאים עם נוגדן ספציפי ל-CD 3, CD 4, CD 8 וגמא IgG FC אנושית כמדידה לביטוי המכונית. לרכוש את התאים בקליבר פקס. נתח את הנתונים באמצעות תוכנת FCS express כדי לקבוע את ביטוי המכונית.

לאחר מכן חשב את התאים החיוביים לרכב בתרבית. שיבוט A PC מספר ארבע ייגזר מתאי K 5 62 כדי לבטא במשותף מולקולות גירוי משותף רצויות של תאי T להפשיר כמות של מוקרנים קפואים, A A PC באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את התאים ו-CCM ספרו את התאים הקיימים על ידי אי הכללה כחולה וחישבו את מספר ה-A A PC הקיים הנדרש לגירוי.

מערבבים את התאים החשמליים המבטאים את המכונית ואת הגמא המוקרנת A A PC במיכל סטרילי ביחס של אחד לשניים. התאם את יחס A PC לביטוי של מכונית בהתבסס על ציטומטריית זרימה ביום שלאחר האלקטרופורציה הוסף 30 ננוגרם למיליליטר של IL 21 למתלה התא. לאחר מכן Eloqua טיפל בששת התאים למיליליטר בצלוחיות T 75 או צפה בשקיות תרבית חיים וחזר לחממת התרבית, העברה אלקטרו של פלסמידים DNA והתפשטות תאי T על קרינת גמא.

ניתן להשתמש ב-A PC כדי ליצור מספרים מושכים קלינית של תאי T שמקורם בדם היקפי ודם טבורי ליישומים אנושיים. באפיון זה של תאי T מהונדסים גנטית מביטוי דם היקפי של EGFP ביום האפס של מחזור הגירוי הראשון, בקרות ליעילות ביטוי העברת הגנים של מכונית ספציפית CD 19 מוערכת על ידי זרימה ציטומטרית על CD 3 חיובי, CD 8 חיובי ו-CD 4 חיובי תאי T כ-24 שעות לאחר האלקטרופורציה. ואז 28 ימים לאחר תרבית משותפת על A A PC קינטיקה של ביטוי מכוניות על תאי T שגדלו במערכת סגורה מבחינה תפקודית.

התפשטות תאי T חיוביים לרכב שמקורם בדם היקפי לאורך זמן יכולה לייצר מספרים מושכים קלינית של תאי T המבטאים את המכונית ביציבות. לאחר ארבעה שבועות של תרבית משותפת על מחשב A, התרחבות הקיפול הממוצעת של שלושה תאי T חיוביים של CD היא כ-19,800 עם ביטוי של 90% CAR. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבחור מצעד ולהפיץ תאי T המבטאים מכונית רצויה.

זכור לעקוב אחר צמיחת יתר של תאי NK. האלקטרופורציה וההתפשטות של תאי T מתבצעים בדרך כלל על פני ארבעה מחזורי גירוי של שבעה ימים. ניתן לבצע חקירות נוספות כגון שחרור ציטוקינים ומבחני ציטוטוקסיות כדי להעריך את הספציפיות המנותבת מחדש של תאי T מהונדסים גנטית בתחום האימונותרפיה המאמצת.

טכניקה זו מסייעת לנו להבין את הפוטנציאל הטיפולי של תאי T המוחדרים לבני אדם.