Name: 4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: למדו הדמיית 4D של דינמיקת חלבונים בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי מסלולי חלבונים מקופפים, פירוק ושקיעה בזמן אמת לחקר בריאות תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. הכנות שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך זני שמרים עם פלסמיד שנשא GAL1-GFP-Y68L (UBC9 ts) קלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול שמרים בתקשורת סינטתית המכילה raffinose 2% עבור 24 שעות וחוזרים לדילול של 2% מדיה המכילה גלקטוז עבור 16 שעות או O / נ דגירת תאים ב 30 מעלות צלזיוס בזמן רועד ב 200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבוקר שלמחרת, מדלל את מתח השאילתה לOD 600 = 0.2. Shake עבור 4-6 שעות של 30 ° C (200 סל&quot;ד) עד שהתרבות מגיעה OD 600 = 0.8-1.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדחיק ביטוי (כדי לפקח על הברכה תורגמה-כבר מקופלת ורק של ה-GFP-Ubc9 ts), תקשורת ישתנה לתקשורת הסינטתית עם תוספת סוכר 2% (SD) 30 דקות לפני ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול - הלם חום התאים ל20 דקות ב 37 ° C כדי לגרום misfolding, או באופן רציף במיקרוסקופ חממה לעקוב צבירת חלבון בתנאי חום הלם. הערה - אם אתה משתמש במיקרוסקופ בכל טמפרטורה מעל RT, מראש חום for כ 2 שעות לאזן את הטמפרטורה לאורך הגוף של המיקרוסקופ ואת המטרות (ראה להלן). </li></ol> 2. צלחת \ הכנות שקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר צלחת מתאימה. השיקול העיקרי הוא היכולת לשמור על מיקוד ברכישת הדמיה. הנקודות הבאות הן קריטיות עבור 4D הדמיה ולא לפערי הזמן 2D או 3D הדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרובה בארות צלחת תחתית הבארות השונות לא יכולה להיות הומוגנית (כלומר הבארות יהיו בגבהים יחסית למטרה שונים). זה יעשה את זה קשה לשמור על פוקוס לאורך נקודתי XY ונקודתי זמן, ללא קשר לשימוש בטכניקת autofocusing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומרי שקופיות: זכוכית לעומת פלסטיק. שקופיות זכוכית תחתיות יותר Z-הומוגני בין הבארות, אך הם יקרים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובי של תחתית של הצלחת: אנחנו בדרך כלל להשתמש בצלחות coverslip-תחתונת מדד 1.5, אבל 1 מדד הוא גם מקובל בהתאם למטרה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Covאה תחתון של צלחת \ שקופית עם ConA (0.25 מ&quot;ג / מ&quot;ל) למשך 10 דקות. ConA משמש לדבוק תאים לשקופית, המאפשרת בעקבות תא בודד לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ConA ודגירת השקופיות בברדס כימי כך שConA העודף יתאדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 μl צלחת מדגם שמרים (OD 600 = 0.5) לConAed היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 15 דקות, על מנת לאפשר לתאים להיצמד למשטח של הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את המדיום, ולשטוף שלוש פעמים עם מדיום חדש כדי לקבל שכבה אחת של תאים. הערה: אם פקיעת זמן מתוכנן, את תאי הזרע בדלילות, כך שהניצנים חדשים לא ימלא ולקטוע את האזור של עניין. </li></ol> 3. הכנות מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים בניקון A1Rsi confocal מיקרוסקופ עם כמה שינויים שאינם סטנדרטיים. עבור הדמית שמרים אנו משתמשים עד 4 לייזרים (405 ננומטר, 50 mW ליזר CUBE; 457-514 ננומטר, 65 mW ארגון יון הליזר; 561 ננומטר, 50 mW ליזר ספיר; ו640 ננומטר, 40 mW CUBE ליזר), ועד 4 PMTs מצוידיםמסננים. רוב ההדמיה שלנו נעשה עם קבוצה ירוקה מסנן לEGFP ולהגדיר מסנן אדום לmCherry וtdTomato. עם GFP וmCherry אין כמעט bleedthrough, ולכן לעתים קרובות אנו משתמשים סריקה בו זמנית. עם זאת, קו לסריקה יכולה לשמש גם כדי למנוע bleedthrough כשהוא מתרחש. confocal מצויד גם בשלב PInano Piezo (MCL), אשר יכול להפוך 3 שלבי msec בz, המאפשר 2-3 Z-ערימות (30-50 חלקים) לשנייה. המערכות יש גם רוח רפאי גלאים, פוקוס מושלם (ליזר קיזוז), ושני סורקים - סורק galvano וסורק תהודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מטרה המתאימה. שיקולים עיקריים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטרת מים / שמן / אוויר: השיקול העיקרי הוא מקדם שבירה של מדיום ההדמיה לעומת הבינוני של המדגם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתרונות אובייקטיביים שמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטרות נפט יכולות להיות פתחים מספריים גבוהים יותר (אור שמן הפסקות יותר ממים, ולכן פוטונים יותר לחזור לאובייקטיבי). מטרות נפט יכולות להיות עדלNA 1.49, לעומת 1.27 למים. (עם זאת, זה לא ממש הבדל עצום ברזולוציה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקדם השבירה של שמן תואם את מקדם השבירה של זכוכית, ולכן אין פוטונים אבדו הולכים מהמדגם, מבעד לזכוכית, למטרה. (הערה - בחרה שמן טבילה שיש שבירה שמתאימה למטרה שלך וcoverslip שלך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמן מאפשר ארוכה ללא טרחה בפעם שמעידות שכן הוא לא מתאדה. </li></ol> חסרונות אובייקטיביים שמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרזולוציה הגבוהה מופעלת על ידי NA הגבוה יותר של מטרות נפט מדרדרת במהירות אם יש האור לנסוע דרך מדיום מימי (כגון תא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות בדרך כלל יש סטיות כדוריות ויותר &quot;מתוח&quot; אפקט 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפט הוא דביק ומבולגן, וסכנה ליעדים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתרונות אובייקטיביים מים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התא עצמו הוא מימי, ולכן יש פחות עיוותים בZ, and הרזולוציה נותרת גבוה עמוקה לתוך מדגם מימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה וידידותי למשתמש. חסרונות: מים מתאדה במהירות אובייקטיבי, ולכן אינה מתאימים לסרטים ארוכים ללא הסדרים מיוחדים שנעשים כדי לשאוב מים ברציפות למטרה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתרונות אוויר אובייקטיבי: 1. אין חומר הולך לאיבוד / מתאדה במהלך רכישת נקודה מרובה או סרט ארוך. 2. נקה וידידותי למשתמש. חסרון: רזולוציה נמוכה ורגישות אות נמוכה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמפרטורת חדר ובחממה: טמפרטורה משתנית משפיעה על תכונות חומר, ובמערכות עדינות משנה את הפוקוס. הטמפרטורה צריכה להיות מותאמת לפני בחירת נקודות עבור רכישה. שינוי הטמפרטורה במהלך הרכישה ישבש הדמיה ויגרום לאובדן מיקוד. אנו נותנים למערכת מיקרוסקופ לאזן עבור 2 שעות בטמפרטורה הרצויה לפני ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קולרי תיקון: יעדים רבים מגיעים עם טבעת המאפשרת תיקוןהמטרה להיות מותאמת לעובי נתון כיסוי להחליק. אנו ממליצים להתאים את צווארון התיקון תוך שימוש בחרוזי ניאון לדמיין פונקצית התפשטות הנקודה. זה יבטיח הגדרות נכונות עבור כל מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיקי מדגם יציבים: אנו מוצאים כי מחזיקי מדגם מסחרי הזמינים ביותר הם חלק החלש ביותר של המיקרוסקופ. הם לעתים קרובות מתנדנדים ולא ישר. זה אסון לרזולוציה גבוהה, הדמית 4D ריבוי נקודות. אנו מעצבים מחזיקי המדגם שלנו, כי הם ישרים ונתאים היטב לבמה. הם יכולים גם להיות מחוזקים בברגים בעת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת ריבוי נקודות: מערכת ההדמיה שלנו מצוידת במערכת ניקון &quot;המושלמת המיקוד&quot;, שהוא בעצם מנגנון מבוסס ליזר פוקוס אוטומטי. עם זאת, autofocusing הוא לא בהכרח צורך ב4D הדמיה, במיוחד אם המערכת לא נסחפת הרבה. </li></ol></li></ol> 4. הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המערכת: לייזרים, במה, בקר, מצלמה וcompuתוכנת ter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת מניח על בעל במה, בצורה נאותה והתייצבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ביציאת עין כדי לקבוע את המיקום וכיוון של שמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש brightfield, להעריך את בריאות תא ואת כדאיות על פי צורה ומרקם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל אור epifluorescent פי fluorophore הרלוונטי (למשל FITC מסנן לGFP), ולהתמקד בתאים המציגים את הפנוטיפ אשר כפופים למחקר שלך. תאים אשר הניאון ביותר באורך גל אחד או יותר יכולים להיות מתים ולכן autofluorescent. אנו לדמיין גרעין עם fluorophore tdTomato התמזג SV40 אות NLS (NLS-TFP). פריון הכולל הוא כפול בגודלו של ה-GFP, ולכן מעל גבול דיפוזיה של הגרעין, ולכן זה עובד טוב מאוד כסמן גרעיני. אנחנו גם יכולים לרגש TFP עם ליזר ירוק (488 ננומטר) בו זמנית כGFP, אבל לאסוף את הפליטות הירוקות ואדומות לשתי PMTs הנפרד לרזולוציה ספקטרלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ההגדרות הבאות כדי למזער את הרעשוoversaturation: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוח הליזר - photobleaching וphototoxicity לעומת בהירות של תמונה צריך להיחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רווח: משפיע על רגישות מצלמה, ובכך יחס אות לרעש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוטר חריר - צריך להיות מותאם על פי הליזר עם אורך גל הקצר יותר. קוטר החריר מקובע את העובי (גובה) של הסעיף האופטי צלם. לפיכך, פתיחת החריר תאסוף יותר אור (נותן יותר פוטונים ב), אבל תקטין רזולוציה בz (confocality פחות). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצות שימושיות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם fluorophores השונה פולט אורכי גל חופפים, השתמש בתכונת רפאי הגלאים המאפשרת הבחירה של מסננים וירטואליים. זכור כי גלאי רפאים פחות רגישים מאשר PMTs הרגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם fluorophores השונה נרגש על ידי אותו הליזר, השתמש בתכונת סריקת הקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סורק מאפשר Galvano יותר רגיש, אבל יש סיכון גבוה יותר לphotobleaching. סורק תהודה מאפשר מהר יותרcquisition, ובכך להקטין את הסיכון לphotobleaching, אך הוא פחות רגיש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע בין 2 ל 16 תמונות, זה משפר את יחס אות לרעש, אבל עושה את הרכישה איטית יותר, וכמובן, כרוך בחשיפה רבה יותר של המדגם לליזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משך הרכישה תלויה בשאלות הביולוגיות (למשל JUNQ והיווצרות IPOD לוקחת ~ 2 שעות). אנחנו צלמנו שמרים עם סורק התהודה לתקופה של עד 30 שעות בזמן לשגות 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרווחי זמן לשגות מרווחים קטנים יותר ליצור סרט עקבי יותר אך עלול לגרום לתמונת הלבנה ולכן אובדן האות. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gershenson, A., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+in+the+cell%3A+challenges+and+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Protein folding in the cell: challenges and progress.</a> Current opinion in structural biology. 21, 32-41 (2011).</li>
<li>Aguzzi, A., Calella, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions%3A+protein+aggregation+and+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Prions: protein aggregation and infectious diseases.</a> Physiological reviews. 89, 1105-1152 (2009).</li>
<li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteotoxic+stress+and+inducible+chaperone+networks+in+neurodegenerative+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging.</a> Genes & development. 22, 1427-14 (2008).</li>
<li>Cohen, E., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin+paradox%3A+aging%2C+proteotoxicity+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The insulin paradox: aging, proteotoxicity and neurodegeneration.</a> Nature reviews. Neuroscience. , (2008).</li>
<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, (1998).</li>
<li>Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+strategies+for+controlling+protein+aggregation.+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 11, 777-788 (2010).</li>
<li>Treusch, S., Cyr, D. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+deposits%3A+Protection+against+toxic+protein+species%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle+%28Georgetown%2C+Tex.%29%22%5BJournal%5D)">Amyloid deposits: Protection against toxic protein species?</a> Cell cycle (Georgetown, Tex.). 8, 1668-1674 (2009).</li>
<li>Spokoini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement+to+Organelle-Associated+Inclusion+Structures+Mediates+Asymmetric+Inheritance+of+Aggregated+Protein+in+Budding+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Confinement to Organelle-Associated Inclusion Structures Mediates Asymmetric Inheritance of Aggregated Protein in Budding Yeast.</a> Cell Rep. , (2012).</li>
<li>Weisberg, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+superoxide+dismutase+1+%28SOD1G93A%29+aggregates+determines+their+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of superoxide dismutase 1 (SOD1G93A) aggregates determines their toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15811-15816 (2012).</li>
<li>Kaganovich, D., Kopito, R., Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misfolded+proteins+partition+between+two+distinct+quality+control+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Misfolded proteins partition between two distinct quality control compartments.</a> Nature. 454, 1088(2008).</li>
<li>Betting, J., Seufert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+Ubc9+mutant+protein+with+temperature-sensitive+in+vivo+function+is+subject+to+conditional+proteolysis+by+a+ubiquitin-+and+proteasome-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A yeast Ubc9 mutant protein with temperature-sensitive in vivo function is subject to conditional proteolysis by a ubiquitin- and proteasome-dependent pathway.</a> The Journal of biological chemistry. 271, 25790(1996).</li>
<li>Tongaonkar, P., Beck, K., Shinde, U. P., Madura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+temperature-sensitive+mutant+of+a+ubiquitin-conjugating+enzyme+and+its+use+as+a+heat-inducible+degradation+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of a temperature-sensitive mutant of a ubiquitin-conjugating enzyme and its use as a heat-inducible degradation signal.</a> Analytical biochemistry. 272, 263(1999).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

האינטואיציות שלנו על תהליכים ביוכימיים נובעות מניסויים גבי ספסל שבו פתרון מעורב ושל מגיבים ומוצרים רשאי להגיע לשיווי משקל בכוס. בהגדרה כזו, הריכוז של תרכובות כימיות הניתנות עלול להתבטא במספר אחד, שהוא היחס בין כמות טוחנת של מולקולות לנפח מקרוסקופית. הרבה ממה שאנו יודעים על מבנה חלבון ותפקוד נובע משימוש בשיטות המשקפות את התמונה הקלסית, עיקר תגובה: כתמים מערביים, centrifugations ומידות spectrophotometric בוצעו על תמציות מhomogenates של אוכלוסיות שלמות של תאים. ככל שהטכנולוגיה שאנו משתמשים להסתכל על תאים בהגדלה משפר בקפיצות, הוא הופך להיות ברור יותר מתמיד כי תנאים שבתגובות ביוכימיות ביותר מתרחשות בגוף חי נושאים רק דמיון הקלוש לאלה של התרחיש גבי הספסל הקלסי. לא רק הפנים של celלה צפוף סביבה, שבו צפיפות השפעות משמעותיות לשנות את פעילותם של מגיבים שונים, זה גם די ההפך ממעורב ו. דבר זה מסביר את הפער התדיר בין במבחנה ביעילות vivo של מגוון רחב של תגובות macromolecular מורכבות. בשום מקום הן נובעות מאינטואיציות קלסיות בניסויי מבחנה ביוכימיים נוטים יותר להטעות כמו בשאלות הנוגעות לקיפול vivo, misfolding, וצבירה של חלבונים. בעוד שמחקרים של כימית חלבון בתגובות בתפזורת יכולים לטפל בנושא של קיפול לחלבון ניתן כפשוטים כן או לא שאלה, כל ניסיון לעקוב אחר הדינמיקה של אוכלוסיות שלמות של מקרומולקולות בתא חי חייב להיות רגיש לכל ההפצה אפשרית תוצאות קונפורמציה זמינות לשרשרת פוליפפטיד, ובפרט לסיכון של misfolding וצבירה. לדוגמה, אנו יכולים לבחון ly תא תפזורתלהשביע של חלבון על ידי צבירה מערבית סופג, ולקבוע כי החלבון הוא בעיקר מסיס ולא ubiquitinated. עם זאת, בתא החי תת אוכלוסייה דיסקרטית של החלבון, קשה לזהות כאשר הממוצע מעל תאים רבים, עשוי להיות מסיס וubiquitinated בתא מסוים שבו הריכוז המקומי של המינים הוא גבוה ביותר. התרחיש זה האחרון עשוי להיות השלכות חשובות יותר לחיוניות של התא מתת אוכלוסיית התפזורת הגדולה יותר. יתרה מכך, בעוד מלווים להציג מגוון רחב של התנהגויות ותפקודים במבחנה pleiotropic, זה הופך ברור כי בתא הפונקציות הבדידות מוגבלות מרחב ובזמן. בפרדיגמה החדשה הלהבנת הביוכימיה, ריכוז הופך לרכושו של כל משתנה ננו סביבה מסוימת בתא, ואת האירועים המולקולריים שבבסיס תהליכים ביולוגיים יש assayed לא רק בזמן, אלא גם בSPACדואר. גישת הדמית 4D הוצגה כאן מאפשרת מודלים רגישים של misfolding חלבון בתאים חיים, אם כי ניתן להשתמש בו כדי ללמוד על כל מספר התהליכים ביולוגיים אחרים וכיצד הם מוסדרים במרחב, זמן, ובעקבות שינויים בתנאי הסביבה. במאמר זה אנו משתמשים בחיישן Ubc9 ts מתקפל, אשר למעשה מדגים את השלבים ואפשרויות להתמודדות עם ההתפרצות של צבירת חלבון בcytosol. בנוסף לממחיש את הביולוגיה של התא של בקרת איכות צבירה, גישה זו יכולה לשמש ככלי רב עצמה לפענוח ההשפעה של הפרעות ספציפיות או מוטציות גנטיות בproteostasis (לדוגמא Ubc9 ts יכול לשמש למדידת לחץ קיפול חלבונים בתגובה לחמצון, הביטוי לצבירה רעילה, או מוטציות במסלול בקרת האיכות). 4D הדמיה חיונית גם לקביעת לוקליזציה חלבון או החלבון colocalization בין שתי שונים במדויקs, ולאיתור תופעות שאולי להיות חולף אך חשוב. לדוגמה, במיוחד באורגניזם כדורי קטן כמו שמרים, זה עשוי להיראות במקרה שמבנה או המצרפי יש לוקליזציה juxtanuclear, בעוד 4D הדמיה יכולה לגלות שזה פשוט תוצר של הזווית של בדיקה. בניסוי לדוגמא אנו מציגים כאן, אנו מדגימים את השימוש במודל misfolded חלבון, Ubc9 TS, לעקוב בקרת איכות הצטברות לאורך זמן ובמרחב בcytosol. בטמפרטורה המתירנית, Ubc9 ts מקופל ומתפזר בגרעין וcytosol. על misfolding נגרם עקב החום, זה יוצר תחילה במהירות מוקדי diffusing קטנים מצטברים מתח שעוברים עיבוד לפירוק proteasomal. כאשר הפרוטאזום חלקית עכבות, מוקדי מתח אלה מומרים לJUNQ ותכלילים IPOD במשך כ 2 שעות. אם שפלת יוביקוויטין בתיווך אינה זמינה כאפשרות בקרת איכות, UBC9 ts מחדש מנותב מייד להכללת IPOD לצבירת מגן. כלים אלה מציעים הזדמנויות מדהימות לגלות גורמים גנטיים מעורבים ברומן בקרת איכות צבירה, ולחקור הסדרת המרחב ובזמנם בתא.

<table><tbody><tr><td>MG132</td><td>Mercury</td><td>mbs474790</td><td></td></tr><tr><td>con A</td><td>Sigma</td><td>C2010</td><td></td></tr><tr><td>לוחות תחתונים מזכוכית</td><td>ibidi</td><td>ibd81158</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation סרטי תלת מימד קונפוקליים נרכשו באמצעות מיקרוסקופ Nikon A1R-si המצויד בבמת PInano Piezo (MCL), תוך שימוש בפרוסות 60x מים NA 1.27, 0.3 מיקרון0.5% הספק לייזר (מלייזר 65 mW 488 ולייזר 50 mW 561)., ערימות z נרכשו כל 5 דקות למשך 90 דקות. כל סדרת z נרכשה עם גודל צעד של 0.5 מיקרון ו-30 צעדים בסך הכל. עיבוד התמונה בוצע באמצעות תוכנת NIS-Elements.</td></tr></tbody></table>

4d הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

אחת המשימות המרכזיות של כל תא חי היא שמירה על קיפול תקין של חלבונים מסונתזים חדשים לנוכח תנאי סביבה משתנים ללא הרף וסביבה תוך-תאית ארוזה היטב, דביקה ומסוכנת ליציבות החלבון1. היכולת לאזן באופן דינמי בין ייצור, קיפול ופירוק חלבונים דורשת מכונות בקרת איכות מיוחדות ביותר, שנחיצותן המוחלטת נצפית בצורה הטובה ביותר כאשר היא מתקלקלת. למחלות כמו ALS, אלצהיימר, פרקינסון וצורות מסוימות של סיסטיק פיברוזיס יש קשר ישיר למרכיבי בקרת איכות של קיפול חלבונים2, ולכן פיתוח טיפולי עתידי דורש הבנה בסיסית של התהליכים הבסיסיים. האתגר הניסויי שלנו הוא להבין כיצד תאים משלבים אותות נזק ומרכיבים תגובות המותאמות לנסיבות מגוונות.
הסיבה העיקרית לכך שקיפול שגוי של חלבון מהווה איום קיומי על התא היא הנטייה של חלבונים מקופלים בצורה לא נכונה להצטבר, ובכך לגרום להפרעה גלובלית של סביבת הקיפול התוך-תאית הצפופה והעדינה1. בריאות הקיפול, או "פרוטאוסטזיס", של הפרוטאום התאי נשמרת, אפילו תחת לחץ של הזדקנות, מתח ונזק חמצוני, על ידי פעולה מתואמת של יחידות מכניסטיות שונות במערכת בקרת איכות משוכללת3,4. מנגנון מיוחד של מלווים מולקולריים יכול לקשור פוליפפטידים לא ילידיים ולקדם את קיפולם למצב המקורי1, למקד אותם לפירוק על ידי מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום5, או לכוון אותם לתכלילים מצטברים מגנים6-9.
באיקריוטים, עומס בקרת איכות הצבירה הציטוזולית מחולק בין שני תאים8-10: תא בקרת האיכות הצמוד (JUNQ) ומרבץ החלבון הבלתי מסיס (IPOD) (איור 1 - מודל). חלבונים שנמצאים בכל מקום על ידי מנגנון בקרת האיכות של קיפול החלבונים מועברים ל-JUNQ, שם הם מעובדים לפירוק על ידי הפרוטאזום. חלבונים לא מקופלים שאינם נמצאים בכל מקום מופנים ל-IPOD, שם הם מצטברים באופן פעיל בתא מגן.
עד לנקודה זו, הפרדיגמה המתודולוגית של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים הייתה בעיקר לתייג חלבונים ולעקוב אחר מיקומם בתא בנקודות זמן ספציפיות ובדרך כלל בשני ממדים. ככל שטכנולוגיות חדשות החלו להעניק לנסיינים גישה חסרת תקדים לקנה המידה התת-מיקרוני בתאים חיים, הארכיטקטורה הדינמית של הציטוזול נתפסה כחזית חדשה ומאתגרת לאפיון ניסיוני. אנו מציגים שיטה לניטור מהיר של ההתפלגות המרחבית התלת-ממדית של חלבונים מרובים המסומנים באופן פלואורסצנטי בציטוזול השמרים לאורך זמן. 3D Timelapse (הדמיה 4D) אינו רק אתגר טכני; במקום זאת, הוא גם מאפשר שינוי דרמטי במסגרת המושגית המשמשת לניתוח מבנה התא.
אנו משתמשים בחלבון חיישן מתקפל ציטוזולי בשמרים חיים כדי לדמיין גורלות מובהקים לחלבונים לא מקופלים בבקרת איכות צבירה תאית, באמצעות הדמיה פלואורסצנטית מהירה 4D. המוטציה הרגישה לטמפרטורה של חלבון Ubc910-12 (Ubc9ts) יעילה ביותר הן כחיישן של פרוטאוסטזיס תאי, והן כמודל פיזיולוגי למעקב אחר בקרת איכות הצבירה. כמו ברוב חלבוני ה-ts, Ubc9ts מקופל לחלוטין ומתפקד בטמפרטורות מתירניות עקב מלווים תאיים פעילים. מעל 30 מעלות צלזיוס, או כאשר התא מתמודד עם מתח קיפול שגוי, Ubc9ts מתקפל בצורה שגויה ועוקב אחר גורלו של חלבון כדורי מקומי שקופל בצורה לא נכונה עקב מוטציה, דנטורציה בחום או נזק חמצוני. על ידי היתוך שלו ל-GFP או פלואורופורים אחרים, ניתן לעקוב אחריו בתלת-ממד כשהוא יוצר מוקדי מתח, או מופנה ל-JUNQ או IPOD.

<html><img alt="איור 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1.jpg" /> איור 1. דגם:. מידור תת תאי של חלבוני misfolded מכונה בקרת האיכות מכוון את החלבונים לתאי misfolded שונים עם פונקציות שונות: חלבונים מסיסים, המיועדים לפירוק, לעבור-ubiquitination פולי, ונשלחים לתא Ju XTA-N uclear ש uality השליטה (JUNQ ). חלבונים מסיסים שלא ניתן ubiquitinated נשלחים לתפיסה הגנתית כדי שPr otein D eposit nsoluble (IPOD), בסמוך לvacuole, שם הם עוברים צבירה פעילה. es.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. misfolding חלבון דוגמנות עם GFP-Ubc9 ts. בתנאים נורמלים, GFP-Ubc9 TS (ירוק) מקופל באופן מקורי, ומותאם diffusely בגרעין וcytosol. הגרעין מתויג על ידי NLS-TFP (אדום). הביטוי של Ubc9 ts היה סגור בתוספת של 2% גלוקוז לפני הדמיה בכל הניסויים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50083/50083fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם שינוי הטמפרטורה עד 37 המעלות צלזיוס, GFP-Ubc9 TS (ירוק) misfolded ויוצר מוקדי מתח cytosolic. הגרעין מתויג על ידי NLS-TFP (אדום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההתאוששות מהלם חום בשעת 23 ° C, GFP-Ubc9 denaturated תרמית TS הוא מושפל, כפי שצוין על ידי רמת פלואורסצנטי ירד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם שינוי הטמפרטורה ל ° C 37 עכבות והפרוטאזום עם 80 מ&quot;מ MG132, GFP-U<html> bc9 TS הוא misfolded ומעובד לJUNQ ותכלילים IPOD. הגרעין מתויג על ידי NLS-TFP (אדום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם שינוי הטמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס ועיכוב ubiquitination, GFP-Ubc9 TS הוא misfolded ומעובד להכללת IPOD. הגרעין מתויג על ידי NLS-TFP (אדום). פרוטאז יוביקוויטין 4 (Ubp4) הוא overexpressed לחסום ubiquitination ts Ubc9. </li></ol><img alt="איור 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3.jpg" /> איור 3. זמן פקיעה של JUNQ והיווצרות IPOD. עם שינוי הטמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס ועיכוב הפרוטאזום עם 80 מ&quot;מ MG132, GFP-Ubc9 מוקדי מתח ts מעובדים לJUNQ ותכלילים IPOD. הגרעין מתויג על ידי NLS-TFP (אדום). תמונות 3D נרכשו במרווחי 4 דקות. (ראה גם בסרט 1).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

כדאיות ניידת תלויה בניהול הזמן והיעיל של misfolding חלבון. כאן אנו מתארים שיטה להמחשת הגורל הפוטנציאלי השונה של חלבון misfolded: קפל שוב, שפלה, או תפיסה בתכלילים. אנו מדגימים את השימוש בחיישן מתקפל, Ubc9<sup&gt; Ts</sup&gt;, לproteostasis ניטור ובקרת איכות צבירה בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ 4D.

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

מערכת ניסויית זו רוכשת תמונות פלואורסצנטיות תלת מימדיות ברזולוציה גבוהה בתאים חיים כדי לנטר ולבחון את הדינמיקה המרחבית-זמנית של בקרת איכות קיפול חלבונים. ראשית, הכינו את התאים לחקור את קומפלקסי החלבון הנעים במהירות. רכוש ערימת Z של תמונות ברזולוציית Z גבוהה.לאחר מכן רכשו סדרת זמן המורכבת מזקס לאחר מכן, עבדו את התמונות המתקבלות בסרט תלת מימד ונתחו את התמונות המתקבלות. בסופו של דבר, הדמיה ארבע-ממדית מאפשרת לעקוב אחר התופעות הדינמיות והחולפות בתאים בתנאים שונים. היתרון העיקרי של הדמיה ארבע מימדית על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופ שדה רחב ו-time-lapse הוא שהיא מאפשרת לנו לדמיין בו זמנית את הדינמיקה ואת ההתפלגות הזמנית המרחבית של כל אוכלוסיית החלבונים בתא ברזולוציה גבוהה.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא של צבירת חלבונים, בקרת איכות וקיפול חלבונים. מדובר בתהליכים דינמיים וחולפים ביותר. לפיכך, ללא רזולוציה גבוהה בזמן ובמרחב, רבים מהם לא היו ניתנים לצפייה.שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי בקרת איכות צבירה. זה יכול גם לחולל מהפכה בחקר האינטראקציה והדינמיקה של חלבונים. בדרך כלל, אנשים חדשים לשיטה זו יתקשו מכיוון שצילום סרטי תלת מימד של חלבונים מתויגים אנדוגניים או בעלי ביטוי נמוך דורש את יציבות המערכת.רגישות גבוהה והלבנת אור נמוכה הפוך את זני השמרים עם פלסמיד ביטוי לחלבון היתוך של פלואור המקושר לחלבון חיישן מתקפל ציטוזולי, כמו המוטציה הרגישה לטמפרטורה של UBC nine. יש לגדל את השמרים בחומר סינתטי המכיל 2% רפינוז למשך 24 שעות, ולאחר מכן לדלל בחזרה ל-2% חומר המכיל גלקטוז למשך הלילה יש לדלל את זן השאילתה ל-OD 600 של כ-0.2 ולתרבית במשך ארבע עד שש שעות עד שהתרבית מגיעה ל-OD 600 בין 0.8 ל-1.0 30 דקות לפני ההדמיה. מדכאים את הביטוי עם מדיה סינתטית בתוספת 2% גלוקוז.שלב זה מאפשר ניטור רק של המאגר שכבר תורגם ומקופל של חלבון האקספרס. כעת מחשמלים את התאים למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כדי לגרום לקיפול שגוי, בחר צלחת מתאימה כדי לשמור על המיקוד במהלך ארבע רכישות D.Imaging.מכסים את תחתית הצלחת ב -0.25 מיליגרם למיליליטר קון A למשך 10 דקות. Con A משמש להדבקת תאים לשקופית, מה שמאפשר לעקוב אחר תא בודד לאורך זמן. שאפו את ה-con A והחץ, יבשו את הצלחת במכסה המנוע הכימי.לאחר מכן מוסיפים 200 מיקרוליטר דגימת שמרים. דגירה למשך 15 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד לצלחת. בצע שלוש שטיפות עם מדיה כדי לקבל שכבה אחת של תאים להדמיית שמרים.השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם כמה שינויים לא סטנדרטיים כמפורט בטקסט הנלווה. מערכת הדמיית שמרים זו משתמשת בעד ארבעה לייזרים ועד ארבעה צינורות מכפיל צילום המצוידים במסננים. רוב ההדמיה שלנו נעשית עם סט המסננים הירוק עבור EGFP וסט מסננים אדום עבור m דובדבן ועגבניות TD.ציידו גם את הקונפוקלי במערכת מיקוד מושלמת של שלב pi nano pizo וגם סורקי הגלוון O וגם סורקי התהודה מאזנים את מערכת המיקרוסקופ עד להגעה לטמפרטורה הרצויה. לפני הדמיה על סמך מקדם השבירה של מדיום ההדמיה לעומת המדיום של הדגימה, בחר את המים, השמן או האוויר האובייקטיביים המתאימים. התאם את צווארון התיקון בהתאם לעובי הצלחת.נקה את המטרה באמצעות מגבוני עדשות ואתנול. נקה גם את השקופית הנושאת את הדגימה. הנח את הצלחת על ה-tagמחזיק בצורה מאובטחת וודא את יציבות מחזיק המדגם כדי להבטיח הגדרות נכונות עבור כל דגימה.כוונן את צווארון התיקון תוך שימוש בחרוזים פלואורסצנטיים כדי להמחיש את פונקציית התפשטות הנקודה עם יציאת העין. קבע את המיקום והכיוון של השמרים. לאחר מכן, הפעל את האור הפלואורסצנטי הנדרש והתמקד בתאים המציגים את הפנוטיפ הרלוונטי.לאחר מכן באמצעות שדה בהיר, העריכו את בריאות התא ואת כדאיות התא בהתאם לצורה ולמרקם להערכות כדאיות התא. דמיין את הגרעין עם פלורת עגבניות TD Fluor התמזגה לאות SV 40 ו-LS. TFP הוא כפול מגודל GFP.מכיוון שהוא נמצא מעל גבול הדיפוזיה של הגרעין, הוא עובד טוב מאוד כסמן גרעיני. עורר את ה-TFP עם לייזר ירוק 4 88 ננומטר בו-זמנית כ-GFP, אך אסוף את הפליטות הירוקות והאדומות לשני PMTs נפרדים לרזולוציה ספקטרלית. כדי למזער רעש ורוויה, התאם את עוצמת הלייזר וקוטר חור הסיכה כמפורט בכתב היד המצורף.אם כוח פלורה שונה פולט אורך גל תואם, השתמש בתכונת הגלאי הספקטרלי, המאפשרת לבחור מסננים וירטואליים להמשיך לרכוש תמונות זמן-lapse בהתאם לתכנון הניסיוני, החלבון המקופל לא נכון U BBC תשע Ts מספק מערכת מודל למעקב אחר בקרת איכות הצבירה על פני זמן ומרחב. בציטוזול בטמפרטורה המתירנית, UBC nine Ts מקופל ומפוזר בגרעין ובציטוזול עם קיפול שגוי המושרה על ידי חום. בתחילה הוא יוצר פונקטה מצטברת ציטוזולית קטנה המפזרת במהירות המעובדת לפירוק פרוטאזומלי.כאשר הפרוטאזום מעוכב חלקית, הפונקטה הללו הופכת לג'אנק ולתכלילי אייפוד במהלך כשעתיים. בתנאים רגילים, GFP UBC nine Ts מקופל באופן טבעי וממוקם באופן מפוזר בגרעין הציטוזול כפי שניתן לראות כאן בירוק. עם שינוי הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס, חלבון ההיתוך מקופל בצורה לא נכונה ויוצר אגרגטים פונקטה ציטוזוליים עם התאוששות מהלם חום ב-23 מעלות צלזיוס.תשעת ה-Ts של G-F-P-U-B-C שעברו דנטורציה תרמית מתפרקים כפי שמצוין על ידי ירידה ברמת הקרינה. הגרעין מסומן באדום על ידי N-L-S-T-F-P. כאשר שינוי הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס משולב עם עיכוב פרוטאזום, ה-G-F-P-U-B-C תשע T מקופל בצורה שגויה ומעובד לתכלילים של זבל ואייפוד.כאן, פרוטאז היוביקוויטין ארבע מתבטא יתר על המידה כדי לחסום עיכוב ubiquitination של ubiquitination יחד עם שינוי הטמפרטורה מביא לעיבוד G-F-P-U-B-C תשע Ts לתוך ה-iPod Inclusion. תמונות דולג זמן אלה שנרכשו במרווחי זמן של ארבע דקות מתארות בבירור את הדינמיקה של היווצרות זבל ואייפוד. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לנטר פרוטאוסטזיס סלולרי לאורך זמן על ידי שימוש ב-UBC nine Ts כחיישן מתקפל.הדמיה ארבע מימדית יכולה להיעשות גם במערכות מודלים אחרות כגון תאי יונקים ואלגנטיות C. הדמיה ארבע מימדית מאפשרת גם תובנה לגבי אירועים עדינים אחרים בבקרת איכות הצבירה, כגון היווצרות ודינמיקה של מוקדי לחץ מצטברים מסיסים, ומסירת אגרגטים לתאי הזבל והאייפוד.

4d-imaging-of-protein-aggregation-in-live-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת צבירת חלבונים מבוססת תאים באמצעות מעכבי פרוטאזום, אשר חוסמים את פעילות הפרוטאזום, ומונעים מחלבונים מוטנטיים שאינם מקופלים כהלכה, מאוחים לתווית פלואורסצנטית, לעבור פירוק פרוטאזומלי תלוי יוביקוויטין, המוביל להצטברותם בתוך הציטופלסמה של התא. לאחר מכן מדמיינים את צברי החלבונים ומכמתים אותם במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Protein Aggregate Formation Assay: שיטה לזיהוי וכימות צבירת חלבונים בתאים בתרבית עם אינדוקציה על ידי מעכב פרוטאזום

סרטון זה מדגים הדמיה וכימות של צברי חלבונים במוחות דרוזופילה מהונדסים גנטית. המוח מקובע, נשטף, ומטופל עם סוכן antifading לפני הרכבה. התמונות מצולמות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ומכומתות כדי לצפות בהעברת צברי חלבונים מוטנטיים.

הדמיה וכימות של צברי חלבונים במוחות דרוזופילה מהונדסים גנטית

מידע מרחבי-זמני על חלבונים דינמיים בתוך תאים חיים הוא חיוני להבנת הביולוגיה. סוג של מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה הנקראת מיקרוסקופ תאורה תלת-ממדי מהיר (f3D-SIM) חושף מידע ייחודי על טבעת Z הציטוקינטית בחיידקים: הן המראה דמוי החרוז והן הדינמיקה המהירה של FtsZ בתוך הטבעת.

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

הדמיה ארבעה ממדים (4D) מנוצל כדי ללמוד את ההתנהגות ואינטראקציות בין שני סוגים של endosomes בחיים מסוף עצב חוליות. תנועה של המבנים הקטנים האלה מתאפיינת בשלושה ממדים, המאפשרת אישור של אירועים כגון היתוך endosome וexocytosis.

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

אנו מתארים שיטה לכמת את המצבור של חלבונים misfolded. פרטי פרוטוקול שלנו lentiviral המושרה תא יציב קו הדור הדמיה קונאפוקלית אוטומטיות, ניתוח תמונות של אגרגטים חלבון. כיישום המחשה, למדנו את ההשפעה של מולקולות קטנות בקידום SOD1 צבירת באופן זמן ותלוי במינון.

פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים

לצבירת ראיות תומך ברעיון כי אגרגטים חלבון פתוגניים המשויך מחלות ניווניות להפיץ בין תאים עם תכונות כמו פריון. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת ויזואליזציה בהפצת לתא של פריון כמו אגרגטים באורגניזם מודל, melanogaster דרוזופילה.

ניטור-לתא שידור של אגרגטים חלבון פריאון-כמו בדרוזופילה Melanogaster

פיתחנו זרימת עבודה פשוטה וישימה לחלץ נתונים כמותיים במחקרים ביולוגיים תא המבוססות על ידי קרינה פלואורסצנטית-הדמיה של צבירת חלבון, שטף autophagic במערכת העצבים המרכזית דגמי דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים.

ביולוגיה של התא כמותית של הקשורים ניוון מוחיים ב דרוזופילה דרך ניתוח לא משוחדת של חלבונים מתויגות Fluorescently באמצעות ImageJ

פרוטוקול זה מתאר את הניתוח של מסומן בתוך התאים התאיים בתוך שמרים באמצעות מרובת צבעים 4d (זמן הפקיעה 3d) קונפוקלית מיקרוסקופ. הפרמטרים הדמיה נבחרים כדי ללכוד אותות הולמים תוך הגבלת photodamage. תוספים מותאמים אישית של ImageJ מאפשרים מבנים עם תוויות למעקב וניתוח כימות.

4D מיקרוסקופ של שמרים

אנו מציגים כאן הליך למדידת אוליגומרים של חלבונים וצבירה בתאים ליזלתיים ותאים חיים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטיות.

איתור צבירת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי

כאן, שיטה מוצגת לניתוח של קינטיקה הצטברות חלבון נמטודה Caenorhabditis elegans. בעלי חיים מאוכלוסייה מסונכרנת גיל הם בתמונה בנקודות זמן שונות, ואחריו ספירת הכללה חצי אוטומטית CellProfiler והתאמה למודל מתמטי באמילופיט.

ניטור הצטברות חלבונים קינטיקה ב Vivo באמצעות ספירת הכללה אוטומטית ב Elegans Caenorhabditis

פרוטוקול זה מתאר תיוג פלואורסצנטי מותאם אישית מבוסס נוגדנים והזרקה לעוברים מוקדמים של דרוזופילה כדי לאפשר הדמיה חיה של חלבונים בשפע נמוך או שינויים לאחר תרגום שמאתגרים לזיהוי באמצעות גישות GFP/mCherry-tag מסורתיות.

הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים

למדו הדמיית 4D של דינמיקת חלבונים בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי מסלולי חלבונים מקופפים, פירוק ושקיעה בזמן אמת לחקר בריאות תאית.

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

גלה סרטונים נוספים