Immunofluorescence שילוב ודגי DNA על 3D-השתמרו גרעיני Interphase לחקר שינויים בארגון גרעיני 3D

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות שינויים בכרומטין ורצפי DNA בו זמנית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית תלת מימדית, נוצרות בדיקות DNA ספציפיות ראשונות. בינתיים, תאי הניסוי קבועים וצבועים במערכת החיסון. לסמני ההיסטון המעניינים.

לאחר מכן התאים עוברים דנטורציה ופלואורסצנטיות לילה בתוכך. הכלאה או דגים מתבצעת באמצעות בדיקת DNA אחת או יותר. לבסוף, התאים נשטפים ומורכבים לפלואורסצנטיות תלת מימדית.

ניתוח מיקרוסקופיה של התמונות המתקבלות חושף לוקליזציה גרעינית של מיקומים מעניינים ואסוציאציה לשינויים ספציפיים באבן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת הדמיה של חלבון גרעיני, כולל אבנים עם מיקומים גנומיים בגרעיני שימור תלת מימדיים, ויכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום הארגון הגרעיני האפיגנטי של כרומטין או ויסות גנים. לצורך הליך זה, ניתן להשתמש בפלסמידים אחוריים או במוצרי PCR לתיוג.

יש להכין אותם כמתואר בטקסט הנלווה. שימו לב שעבור אות דג חזק, הגשושיות צריכות להוציא לפחות 10 קילו-בסיס זוג. התחל הליך זה על ידי שילוב של מיקרוגרם אחד של DNA ו-0.17 מיקרוגרם של RNAs A בצינור מיקרו צנטריפוגה.

דגירה למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, השביתו לזמן קצר את ה-RNAs A על הקרח והוסיפו את הכמות המתאימה של תרגום ניק. מערבבים את הדגירה במשך שעתיים בחום של 16 מעלות צלזיוס באמבט מים מקורר או בבלוק קריר כדי לנטרל את התגובה.

הנח את הצינורות על שלילי 80 מעלות צלזיוס למשך שעה או שלילי 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, קבע את גודל הגשושית על ג'ל אגרוס של 2%. המריחה צריכה להיות בין 101,000 זוג בסיסים כאשר הרוב בכ-300 עד 500 זוג בסיסים.

שימו לב שהמריחה של בדיקות מדע בדיוני אינה נראית לעין. לאחר קביעת הגודל, יש לטהר את הבדיקות באמצעות דיאליזה ב-0.02. פילטרים של חמישה מילימטר בכוסות של שני ליטר מלאות במים.

פיפטה בעדינות 200 מיקרוגרם של בדיקה על מרכז כל מסנן צף, ולאחר מכן דגירה במשך שעתיים בחושך. לאחר הדגירה, השתמש בפיפטה כדי להעביר בעדינות את הגשושית מהפילטרים לצינור מיקרו צנטריפוגה טרי. לאחר מכן, הוסף גורמים חוסמים לבדיקות כדלקמן.

מיקרוגרם אחד של CO 1D NA. מיקרוגרם אחד של DNA בלוק גבוה ו-10 מיקרוגרם של זרע סלמון עבור מיקרוגרם אחד של בדיקת DNA ותערובת מאחסנים את בדיקות ה-DNA ב-20 מעלות צלזיוס שליליות. ביום הליך הדגים, הבדיקות משקעות ומוכנות לשימוש. שים לב שיש לבצע את השלבים המתוארים בסעיף זה של סרטון הווידאו במקביל לשלבים בסעיף הבא.

כדי לזרז את הבדיקות, עקוב אחריהן ושלב אותן עם נפח 0.1 של שלוש נתרן אצטט מולארי ב-pH 5.2 ו-2.5 נפחים של 100% אתנול מודגר למשך שעה אחת ב-80 מעלות צלזיוס שליליות. לאחר הדגירה, סובב את הגשושיות כלפי מטה ב-16,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הסיבוב, השליכו את הסופרנטנט וייבשו את הכדורים באוויר בחושך.

בהתאם לכמות ולצבע של הבדיקות, הגלולה עשויה להיות גלויה או לא. Resus השעו את הגלולה ב-15 מיקרוליטר של מאגר הכלאה לכל מצב בדיקה ונערו באמצעות מערבל תרמו של einor בחושך בטמפרטורה של 37 עד 45 מעלות צלזיוס למשך כ-20 דקות. לאחר הדנטורציה, הגשושיות דוגרות עליהן במשך חמש דקות בטמפרטורה של 75 עד 95 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן כדי לבצע בדיקות מוקדמות, דגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות על מערבל התרמו. מיד לאחר הדגירה, הבדיקות יוחלו על תאים על פתקי כיסוי כמתואר בחלק הבא של הסרטון. שימו לב כי עבור השלבים הבאים, יש לשנות את זמני הדגירה לפי הצורך עבור הנוגדנים והתאים בהם נעשה שימוש.

יש לבצע את השלבים המתוארים בחלק זה של הסרטון במקביל לשלבים בסעיף הקודם כמתואר בטקסט הנלווה. זרוק תאים שאינם נדבקים על גבי כיסוי מצופה פולי ליזין מחליק בבארות של שש צלחות באר ותן להם להיצמד למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסיפו בעדינות שני מיליליטר של 2% אלדהיד פרפורם בדגירה PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה.

שטפו כל באר עם PB S3 פעמים ואז כדי לחדור לתאים, הוסיפו שני מיליליטר קר כקרח, 0.4% טריטון X 100 ב-PBS ודגרו במשך חמש דקות על קרח. לאחר שאיבת התמיסה החדירה אם דגי DNA ישולבו עם אימונופלואורסצנטיות, המשך באופן הבא. פיפטה ראשונה 100 מיקרוליטר של תמיסת חסימה על פרם בתא לח.

הנח את צד תא ההחלקה של המכסה כלפי מטה על התמיסה החוסמת ודגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבר. הכיסוי מחליק ל-100 טיפות מיקרוליטר של הנוגדן העיקרי המדולל בתמיסת חסימה.

כאן הנוגדן המשמש מזהה סורי זרחני 1 39 של H שתיים A x או גמא H שתיים A x. דגרו את המגלשות בתא לח למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, השתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את החלקות הכיסוי.

אם קשה להרים את החלקות הכיסוי, הציפו ב-PBS ונסו שוב. מעבירים כל שקופית לבאר של שש. צלחת באר המכילה שני מיליליטר של 0.2% BSA 0.1% בין 20 ב-PBS לשטוף את הכיסוי מחליק בתמיסה זו שלוש פעמים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם טלטול, ואז לדגור תאים עם הנוגדן המשני המצומד פלואורופור המתאים מדולל בתמיסה חוסמת למשך שעה בטמפרטורת החדר בתא חשוך ולח על הפרם.

כמו לפני לאחר הדגירה, שטפו את התאים ב-0.1% בין 20 ב-PB S3 פעמים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בחושך כדי לתקן את התאים, טבלו אותם בשני מיליליטר של 2%para פורמלדהיד ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר שהתאים הוכתמו או אם הם לא מוכתמים, המשיכו את דגי ה-DNA על ידי שטיפת החלקות הכיסוי שלוש פעמים ב-PBS. לאחר מכן הנח את המכסה מחליק את צד התא כלפי מטה על טיפה של 100 מיקרוליטר של 0.1 מיליגרם למיליליטר.

RNA על פרם בתא לח ודוגר במשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, יש לשטוף את הכיסוי שלוש פעמים ב-PBS ואז לחלחל את התאים בקור קרח 0.7% טריקס 100 בחומצה הידרוכלורית מולרית 0.1 למשך 10 דקות על קרח בחושך. לאחר שלוש שטיפות ב-PBS מנטרלים את התאים בחומצה הידרוכלורית 1.9 מולרית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך ונשטפים שלוש פעמים נוספות ב-PBS קר כקרח, לצד הכלאה של תאים עם הבדיקות.

הנח את הכיסוי עם צד התא כלפי מטה על טיפת בדיקה של 15 מיקרוליטר שהוכנה בחלק הקודם של סרטון זה על שקופית מיקרוסקופ, אטום את השקופית במלט גומי ודגר למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס בתא לח חשוך. למחרת, השתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את מלט הגומי מהמגלשות. לאחר מכן שפעת את החלקות הכיסוי עם שני Acts SSC והשתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את החלקות הכיסוי עם התאים.

ואז הניחו אותם בבארות המכילות תמיסת כביסה. לאחר מכן, בצע את השטיפות הבאות עם טלטול בחושך שני XSSC למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, שני XSSC למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ו-XSSC אחד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להרכיב את השקופיות, הנח את הכיסוי מחליק את צד התא כלפי מטה על טיפה של 10 עד 15 מיקרוליטר של מדיום הרכבה זהב ממושך המכיל 1.5 מיליגרם לחותם DPI מיליליטר עם לק. ניתן לאחסן את השקופיות במשך חודשים בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס.

לאחר שהשקופיות מוכנות, אספו תמונות תלת מימד עם חתכים אופטיים המופרדים ב-0.3 מיקרון ונתחו כמתואר במסמך הנלווה כדי לקבוע אם שינויים באסוציאציה של שני האללים של מיקומי קולטני האנטיגן קשורים לוויסות תהליך הרקומבינציה של VDJ במהלך התפתחות הלימפוציטים, תאים מסוג פרא ותאים מוטנטיים חסרים בסמרטוט החלבון הרקומבינאז אחד שימש לבחינת מוקד עניין באמצעות DNA בדיקת דגים שנוצרה מגב המשתרע על פני כ-200 קילו-בסיס המקיף את האזור הגנומי. המרחקים בין האללים נמדדו בין מרכז המסה של כל אות אחורי בערימות תמונות תלת מימדיות, עיגולים מקווקווים, צורות גרעין מתאר. פסי קנה המידה המוצגים הם מיקרון אחד, עקומות התפלגות תדרים מצטברות נוצרו לאחר מכן כדי להראות את כל טווח המרחקים בין שני האללים שנמדדו בתאים מסוג הבר ובתאים המוטנטיים.

לאחר מכן נעשה שימוש במבחן KS הלא פרמטרי של שני מדגמים כדי להעריך את משמעות ההבדלים בין שתי ההתפלגויות. טווח ההבדלים החזקים ביותר במרחקים בין-אלליים הוערך באמצעות סדרה של שתי בדיקות מדויקות של דייג זנב שצוינו על ידי הנקודות הכחולות. ערכי ה-P החזקים ביותר שצוינו על ידי הנקודות הגבוהות נמצאו עבור המרחקים סביב מיקרון אחד.

לפיכך, החתך לקשר הדוק או זיווג של שני האללים נקבע במיקרון אחד. עקומות התדר המצטברות המוצגות כאן מצביעות על טווח המרחקים לקשר הדוק של שני האללים מאפס עד 1.5 מיקרון בשני התנאים הביולוגיים השונים. המשמעות של זיווג שני האללים הוערכה באמצעות מבחן דייג שני זנב מדויק לניתוק במיקרון אחד.

גרף זה מראה כי במצב המוטנטי, שני האללים אינם קשורים לתדר גבוה כמו בסוג הפראי. לפיכך, סמרטוט החלבון החסר מעורב בזיווג איני. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לשלב אימונופלואורסצנציה ודגי DNA.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים על ידי מתן תובנות לגבי השינויים הגלובליים בארכיטקטורה הגרעינית, ההתנהגות של מיקומים ואזורים גנומיים ספציפיים בתוך המרחב הגרעיני והקשר של חלבונים גרעיניים ספציפיים באזורים אלה. וזה עוזר להבין את המנגנונים העומדים בבסיס מחלות שונות בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו טכניקות תפוקת קרח רחבות גנום כגון כרומטין, משקעים חיסוניים, או אישור חיפוש או לכידת כרומוזומים יחד עם ריצוף עמוק כמו קדמת חמש C או IC, כדי לספק נתונים גלובליים על אוכלוסיות תאים.