Name: Immunofluorescence שילוב ודגי DNA על 3D-השתמרו גרעיני Interphase לחקר שינויים בארגון גרעיני 3D (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: למד לזהות שינויים במודיפיקציות היסטון ורצפי DNA בו-זמנית באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקלית תלת-ממדית. השיטה משלבת אימונופלואורסצנציה ו-DNA FISH לחקר דינמיקת כרומטין בגרעיני תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לחברי Skok המעבדה, במיוחד סוזנה יואיט, לדיונים והערות. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקי R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS הוא לוקמיה ולימפומה חוקר חברה. JC הוא עמית אירווינגטון מכון לחקר הסרטן. MM נתמך על ידי קרן לאומי למדע חינוך גרנט אינטגרטיבית בוגר והמחקר Traineeship (NSF IGERT 0333389).

1. תיוג DNA Probe עם fluorophores: ניק תרגום (~ 6 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקי BAC-DNA (שהוכן על ידי מקסי הכנה) או פלסמידים או מוצרי PCR, כל resuspended בH 2 O, יכול לשמש לתיוג. שים לב שעבור אות דג חזקה, בדיקות צריכות לכלול לפחות 10 ק&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת DNA בRNase למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (כל ריאגנטים מופיעים בטבלת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תגובת תרגום הכינוי ל2 שעות ב 16 ° C (ראה לוחות 2 ו 3). שיטות חלופיות של תיוג ישיר ניתן להשתמש (לדוגמה: לדג, Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את התגובה לשעה אחת ב-80 ° C או הלילה ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את גודל חללית על 2% agarose ג&#39;ל. המריחה צריכה להיות בין 100 ל 1000 נקודתי בסיס, עם הרוב בכ 300-500 נקודתי בסיס (שים לב שכתם Cy5-בדיקות אינו גלוי). אם ה-DNA אינה מתעכל מספיק, יותר DNA פול ואניDNase אני יכול להוסיף לתגובה וטופחתי לשעות ועוד שתיים על 16 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את בדיקות על 0.025 מסנני מ&quot;מ בשתי כוסות ליטר מלא עם H 2 0 לשתיים שעות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לגורמים החוסמים את הבדיקות כדלקמן: 10 מיקרוגרם של ה-DNA Cot-1, 10 מיקרוגרם של ה-DNA וHybloc 100 מיקרוגרם של זרע סלמון ל10 מיקרוגרם של בדיקות DNA. בדיקות DNA חנות ב -20 ° C. </li></ol> 2. בדיקת רטיבות / denaturation / חישול קדם (שעתי 3-4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין 0.3 מיקרוגרם ומיקרוגרם 1 מתוך הבדיקה DNA משמש לcoverslip. בדיקות לערבב עם 0.1 נפח של 3M NaAc (pH 5.2) ו -2.5 כרכים של 100% אתנול, דגירה במשך שעה אחת ב-80 ° C או הלילה ב -20 ° C וספין למטה ב13000 סל&quot;ד ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שים לב שהסכום של הבדיקה DNA עשוי להיות מותאם בהתאם לאיכות של ה-DNA ובאזור הגרעיני של הכלאה. שיטות חלופיות של תיוג ישיר עשויות לאפשר שימוש בכמויות מופחתות שלחללית. לצורך זיהוי של אותות דגי DNA מרובים על שקופית אחת, הבדיקות השונות ניתן זרזה יחד (למעט בדיקות שלא צריך להיות מראש annealed, כמו רצפים חוזרים). בדיקות עבור מספר ניסויים שבוצעו באותו הזמן ניתן גם זרזה יחד. פלטות צריכות להיות צבעוניות בקלילות על פי fluorophores משמש (אם כמויות קטנות של בדיקות הם זרזו, הגלולה לא יכולה להיות גלויה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורים יבשים וresuspend אותם בחיץ הכלאה 15 μl (ראה טבלה 4) לcoverslip עם רועד (באמצעות אפנדורף thermomixer) בחושך ב37-45 מעלות צלזיוס (כ 20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקות לפגל ל5 דקות ב75-95 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום anneal בדיקות על 37 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות. אורכו של חישול מראש עשוי להיות מותאם בהתאם למורכבות והאיכות של הבדיקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בדיקות לcoverslips להכלאה בין הלילה (ראה סעיף 3). </li></ol> 3. 3דגים ממדיים DNA - היום הראשון (~ 3 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים שאינם חסידים מרוכזים בנפח קטן של 1x PBS (~ 2x10 5 תאים ב1x PBS μl 5-10 לcoverslip) והפילו במרכז coverslip מצופה פולי-L-ליזין. תאי חסיד צריכים להיות מתורבתים בcoverslips לפחות 24 שעות (~ מפגש 70%) (coverslips יכול להיות מצופה עם 0.1% ג&#39;לטין). 18x18 ל24-24 coverslips מ&quot;מ המרובע מונחים בצלחות 6-כן, ובכל רחבי הפרוטוקול, 2 מ&quot;ל של כל פתרון משמש גם ל( 1.5 המ&quot;מ coverslips לחלופין עגול יכולה להיות ממוקם בצלחות 12/24-well). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים בparaformaldehyde 2% / 1x PBS, 7-7.4 pH, למשך 10 דקות בRT (מניות PFA 4% ניתן aliquoted, מאוחסן ב -20 ° C). Paraformaldehyde ניתן לרכוש בתמיסה (16%), או פתרוני מניות 4% יכולים להיות מוכן מאבקה / prills. אבקת Paraformaldehyde מומסת ב1x PBS ב&gt; 60 ° C (pH ניתן להעלות 8-9 כדי להקל על פירוק), מקורר על קרח, להתאיםאד החומציות 7-7.4, מסונן aliquoted בבזים ואוחסנו במשך שבועות ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלוש שטיפות ב1x PBS, permeabilize תאים בקרח קר 0.4% Triton-X-100 / 1x PBS למשך 5 דקות על קרח. אורך permeabilization יכול להיות מותאם בהתאם לתא מסוג NB:. אם דגי DNA הוא בשילוב עם immunofluorescence, immunostaining יש לבצע בשלב זה (ראה סעיף 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלוש שטיפות ב1x PBS, תאי אינקובטורים עם 0.1 מיקרוגרם / μl RNase ב1x PBS לשעה 1 ב 37 ° C. Coverslips ממוקם תא בצד למטה על ירידה של 100 μl של פתרון בparafilm או שקופית בתא לח. Coverslips מכן הוציא בזהירות עם מלקחיים. אם כל התנגדות הוא נתקל, coverslips צריך להיות מוצף ב1x PBS כדי למנוע ניזק לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלוש שטיפות ב1x PBS, permeabilize תאים בקרח קר 0.7% Triton-X-100 / 0.1 מ &#39;HCl למשך 10 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלוש שטיפותייn 1x PBS, תאים לפגל ב1.9 מ &#39;HCl למשך 30 דקות ב RT. לחלופין, תאים ניתן מפוגלים ב50% פוראמיד / 2x SSC ב75-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות. שימו לב שאורך הכלאה (וטמפרטורה) יכול להיות מותאם בהתאם לתא מהסוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלוש שטיפות ב1x PBS קר כקרח, להכליא תאים עם בדיקות במהלך לילה על 37 מעלות צלזיוס בתא חשוך ולח. Coverslips ממוקם תא בצד למטה על ירידה של 15 μl של חללית בשקופית, ונחתם במלט גומי. </li></ol> 4. 3-ממדי חיסוני-FISH - היום הראשון (~ 6-7 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגים בשילוב immunofluorescence / DNA, אימונו-מכתים צריכות להתבצע לאחר permeabilization ב0.4% Triton-X-100 (שלב 3.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים בחסימת פתרון למשך 30 דקות ב RT (2.5% שור אלבומין (BSA), 10% סרום עיזים רגיל, 0.1% Tween-20). פתרון החסימה מסונן, aliquoted ב1.5 Eppendorfs מ&quot;ל ומאוחסן למ &#39;onths ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים עם הנוגדן הראשוני שהועלה נגד החלבון או שינוי היסטון עניין דילול בפתרון חסימה, לשעה אחת בRT בתא לח. כאן אנו מראים דוגמה של נוגדנים נגד-139 סרין phosphorylated של H2AX (γ-H2AX, Millipore; ראה טבלה 5 לפרטים נוספים). Coverslips ממוקם תא בצד למטה על ירידה של 100 μl של פתרון בparafilm או שקופית בתא לח. Coverslips מכן הוציא בזהירות עם מלקחיים (מוצף 1x PBS במידת צורך). שים לב שהדילול ואורך דגירה יכולים להיות מותאם בהתאם לאיכות של הנוגדנים ותאים של סוגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים ב0.2% BSA / 0.1% Tween-20 / 1x PBS, שלוש פעמים 5 דקות בRT עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים עם הנוגדן המשני fluorophore מצומדות המתאים דילול בחסימת פתרון לשעה אחת בRT בחדר חשוך ולח. כאן אנו מראים דוגמה לזיהוי עםנוגדן עז משני אנטי עכבר (אלקסה פלואוריד 488 או 555, Invitrogen; ראה טבלה 5 לפרטים נוספים). נוגדנים משניים Hapten-מצומדות (ביוטין, digoxigenin, וכו &#39;) יכולים לשמש גם. במקרה זה, צעד נוסף לגילוי נאות (streptavidin, נגד חפירות, וכו &#39;) יכול להתבצע לפני או אחרי על לילה הכלאת DNA-FISH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאים ב0.1% Tween-20 / 1x PBS, שלוש פעמים 5 דקות בRT עם רועד בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים שלאחר התיקון בparaformaldehyde 2% / 1x PBS עבור 10 דקות ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך דגי DNA כאמור לעיל מהדגירה בRNase (שלב 3.4). </li></ol> 5. דנ&quot;א 3-ממדי דגים / חיסוני-FISH - היום השני (~ 2 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות בטון גומי, coverslips מבול עם 2x SSC, להסיר בזהירות עם מלקחיים ולמקם אותם בבארות המכילות תמיסת שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים ב2x SSC למשך 30 דקות ב 37 ° C בחושך עם רעד.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים ב2x SSC למשך 30 דקות ב RT בחושך עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים ב1x SSC למשך 30 דקות ב RT בחושך עם רועד שימו לב כי במקרה של denaturation עם פוראמיד, מתרחצת צריך להיות מוחלף על ידי הבא:. כביסות 3 ב 50% פוראמיד / 2x SSC ו 3 כביסות ב2x SSC, 5 דקות כל אחת, ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר בתאים להאריך בינוני גוברים זהב מכיל 1.5 מיקרוגרם / המ&quot;ל DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) לcounterstaining של DNA המוחלט. Coverslips ממוקם תא בצד למטה על ירידה של 10-15 μl של הרכבה בינונית בשקופית וחתומה בציפורניים. שקופיות נשמרות לחודשים ב -20 ° C. </li></ol> 6. מיקרוסקופיה וניתוח 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות 3D ניתן לרכוש עם מיקרוסקופ מערכות שונות. בניסויים שלנו, חלקים אופטיים מופרדים 0.3 מיקרומטר נאספים על מערכת Leica SP5 confocal AOBS (Beam ספליטר Acousto-אופטי). שימו לב שההפרדה בין opticaמטוסי הליטר יכולים להיות מותאמים בהתאם לסוג הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערימות של תמונות 3D ניתן לנתח באמצעות תוכנות וכלים שונים. אנו משתמשים בתוכנת J תמונה כדי להעריך מדידות מרחק בין לוקוסים של ריבית ולנתח סוגים שונים של עמותה של הלוקוסים של ריבית עם תאים תת גרעיניים או חלבונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הניתוחים הסטטיסטיים מבוצעים כדי להשוות בין שניים (או יותר) תנאים ביולוגיים שונים עם pairwise הערכה (הים) משמעות: השוואה בין סוגי תאים שונים או בשלבים, השוואה בין מוקדי עניין שונים. בכל המבחנים הסטטיסטיים, P-ערכי ≤ 5.00E-2 (= 0.05) נלקחים להיות משמעותי (1.00E-2 ≤ P ≤ 5.00E-2 * משמעותיים; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1.00E-2 * * משמעותי מאוד, P &lt;1.00E-3 *** מאוד משמעותי). </li></ol> ניתוח סטטיסטי של ההתפלגות השלמה של מרחקים בין שני אללים. אנחנו ג 1onstruct עקומות תדר הפצה מצטברות על פני כל טווח המרחקים שנמדדו בין 2 alleles.To להעריך את החשיבות של הבדלים בהפצות של מרחקים אמפיריים בין allelic אנו משתמשים פרמטרית שתי מדגם קולמוגורוב סמירנוב-המבחן (KS) 13,14. ניתוח סטטיסטי של קשר הדוק (כלומר זיווג) של שני האללים באמצעות מרחק אופטימלי חתוך. כדי לזהות המגוון של רוב ההבדלים חזקים במרחקים בין שני אללים או לוקוסים, אנו משתמשים בסדרה של שני זנב מבחן פישר מדויק 15 שניות. כלומר, בכל מרחק שנמדדנו לבדוק אם תנאי אחד הוא ייצוג יתר משמעותי במרחקים קצרים יותר בין שתי דגימות. המינימום בהפצה של P-ערכים מציין את הטווח של מרחקים שאמורים להיחשב כחתוכים לעמותה קרובה (כלומר זיווג) של שני אללים. בהמשך הבדיקה המדוקדקת של שני זנבות הפישר משמשת to להעריך את המשמעות של זיווג של שני אללים בערך זיהה החתך 15. תיקוני בדיקות מרובים שיחולו בחשבון למספר הכולל של בדיקות שבוצעו פישר 16. ניתוח סטטיסטי של עמותה של מוקד העניין עם תאים תת גרעיניים או חלבונים. מבחן דו זנב פישר המדויק משמש ללנתח את המשמעות של קשר בין מוקד העניין עם תאים או חלבונים 15 שונים.

<ol><li>Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome+inactivation+in+mouse+embryonic+stem+cells%3A+analysis+of+histone+modifications+and+transcriptional+activity+using+immunofluorescence+and+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH.</a> Methods in enzymology. , 376-405 (2004).</li>
<li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).</li>
<li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunofluorescence%2C+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization%2C+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes%2C+transcriptional+activity%2C+nuclear+organization%2C+and+X-chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).</li>
<li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).</li>
<li>Markaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+3D-FISH+and+super-resolution+structured+illumination+microscopy+for+studies+of+3D+nuclear+architecture%3A+3D+structured+illumination+microscopy+of+defined+chromosomal+structures+visualized+by+3D+%28immuno%29-FISH+opens+new+perspectives+for+studies+of+nuclear+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays+%3A+news+and+reviews+in+molecular%2C+cellular+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture.</a> BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).</li>
<li>Heard, E., Bickmore, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+gene+regulation+and+chromosome+territory+organisation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation.</a> Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).</li>
<li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+sequence%3A+cellular+organization+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (1016).</li>
<li>Fraser, P., Bickmore, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+organization+of+the+genome+and+the+potential+for+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation.</a> Nature. 447, 413-417 (2007).</li>
<li>Cremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+territories--a+functional+nuclear+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Chromosome territories--a functional nuclear landscape.</a> Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).</li>
<li>Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+function+of+nuclear+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics+%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and function of nuclear bodies.</a> Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).</li>
<li>Dostie, J., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+organization+in+the+nucleus+-+charting+new+territory+across+the+Hi-Cs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs.</a> Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).</li>
<li>van Steensel, B., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+tools+for+unraveling+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomics tools for unraveling chromosome architecture.</a> Nature. 28, 1089-1095 (2010).</li>
<li>Massey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kolmogorov-Smirnov+Test+for+Goodness+of+Fit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Statistical+Association%22%5BJournal%5D)">The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit.</a> Journal of the American Statistical Association. 253, 1951(1951).</li>
<li>Collins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RUNX+transcription+factor-mediated+association+of+Cd4+and+Cd8+enables+coordinate+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation.</a> Immunity. 34, 303-314 (2011).</li>
<li>Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+interpretation+of+%CF%872+from+contingency+tables%2C+and+the+calculation+of+P%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society%22%5BJournal%5D)">On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).</li>
<li>Benjamini, Y. H., Yosef, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+false+discovery+rate%3A+a+practical+and+powerful+approach+to+multiple+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society%2C+Series+B+%28Methodological%29%22%5BJournal%5D)">Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).</li>
<li>Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+accessibility%2C+nuclear+positioning%2C+recombination%2C+and+transcription+at+the+Igkappa+locus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus.</a> J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).</li>
<li>Fuxa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax5+induces+V-to-DJ+rearrangements+and+locus+contraction+of+the+immunoglobulin+heavy-chain+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene.</a> Genes Dev. 18, 411-422 (2004).</li>
<li>Goldmit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+ontogeny+of+the+Igk+locus+during+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development.</a> Nature. 6, 198-203 (2005).</li>
<li>Hewitt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+the+Igk+and+Igh+immunoglobulin+loci+mediated+by+the+3%27+Igk+enhancer+induces+%27decontraction%27+of+the+Igh+locus+in+pre-B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells.</a> Nature. 9, 396-404 (2008).</li>
<li>Johnson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+Functionally+Segregates+the+Pro-B+Cell+Stage+by+Regulating+Transcription+of+Recombination+Mediators+across+Cell+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle.</a> Journal of Immunology. , (2012).</li>
<li>Karnowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+and+nuclear+repositioning+of+the+lambda5+gene+locus+at+the+pre-b+cell+stage+requires+Aiolos+and+OBF-1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1.</a> PLoS ONE. 3, e3568(2008).</li>
<li>Kosak, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnuclear+compartmentalization+of+immunoglobulin+loci+during+lymphocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development.</a> Science. 296, 158-162 (2002).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+is+a+critical+regulator+of+B-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development.</a> Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).</li>
<li>Parker, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pre-B-cell+receptor+induces+silencing+of+VpreB+and+lambda5+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription.</a> Embo J. 24, 3895-3905 (2005).</li>
<li>Roldan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus+%27decontraction%27+and+centromeric+recruitment+contribute+to+allelic+exclusion+of+the+immunoglobulin+heavy-chain+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene.</a> Nature immunology. 6, 31-41 (2005).</li>
<li>Skok, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonequivalent+nuclear+location+of+immunoglobulin+alleles+in+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes.</a> Nature. 2, 848-854 (2001).</li>
<li>Skok, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+contraction+by+looping+of+the+Tcra+and+Tcrb+loci+in+rearranging+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes.</a> Nature immunology. 8, 378-387 (2007).</li>
<li>Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+element+in+the+mouse+Igkappa+locus+that+specifies+repertoire+and+Ig+loci+subnuclear+location%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location.</a> Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).</li>
<li>Hewitt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nature immunology. 10, 655-664 (2009).</li>
<li>Deriano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAG2+C+terminus+suppresses+genomic+instability+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis.</a> Nature. 471, 119-123 (2011).</li>
<li>Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+repositioning+of+genes+in+the+nucleus+of+lymphocytes+preparing+for+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division.</a> Molecular cell. 3, 207-217 (1999).</li>
<li>Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+the+histone+guardian+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">H2AX: the histone guardian of the genome.</a> DNA repair. 3, 959-967 (2004).</li>
<li>Croft, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+localization+and+morphology+of+chromosomes+in+the+human+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus.</a> The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).</li>
<li>Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li>
<li>Walter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+many+colors+in+FISH+on+3D-preserved+interphase+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+genome+research%22%5BJournal%5D)">Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei.</a> Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).</li>
<li>Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMX%3A+a+new+platform+for+multimodal%2C+multichannel+wide-field+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).</li>
<li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+research+%3A+an+international+journal+on+the+molecular%2C+supramolecular+and+evolutionary+aspects+of+chromosome+biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הטכניקות המפורטות לעיל שמשו במעבדה שלנו לנתח את הרגולציה של רקומבינציה V (D) J של אימונוגלובולין ולוקוסי TCRA / ד בפיתוח לימפוציטים 30,31. אנו בטוחים כי טכניקה זו יכולה להיות מותאמת לזיהוי של חלבונים שונים גרעיניים, תאים גרעיניים ולוקוסים, בסוגי תאים שונים. שינויים של הפרוטוקול עשויים להיות נחוצים, ובמקרה הזה את השלבים העיקריים שיש להתמקד בם הבאים. ראשית, אורך permeabilization יכול להיות מותאם בהתאם לתא מהסוג. שנית משך דגירת הנוגדן הראשונית יכול גם להי...

מנגנוני ממסד epigenetic הדק וירושה של פרופילי תעתיק ספציפיים התפתחותיים ותא מסוג. ברמה אחת זה כרוך אפנון של אריזת הכרומטין שמגדירה אזורים גנטיים פעילים או שקטים. בקנה מידה גדול יותר, ארגון 3D הגלובלי של הגנום גרעיני והאדריכלות גם לשחק תפקיד בשליטה על דפוסי תעתיק. לפיכך, נתיחה של תכונות epigenomic אלה חיוני להבנה מלאה של איך גנים מוסדרים 6-11. שילוב דגי DNA immunofluorescence ו3D מספקים הזדמנות ייחודית כדי להשלים ניתוחים מולקולריים והביוכימי ידי הערכת אינטראקציות / עמותות של רצפי DNA ו / או חלבונים בתוך הגרעין ספציפיות. יתר על כן, אילו טכניקות תפוקה גבוהה הגנום כגון הכרומטין immunoprecipitation (שבב ואילך) או קונפורמציה לכידת כרומוזום בשילוב עם רצף עמוק (4C-seq, 5C, Hi-C) מספקות dat הגלובליעל אוכלוסיות תאים 12, טכניקות דגי immunofluorescence / דנ&quot;א לאפשר ניתוחים ברמת התא הבודדה. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי בו זמני של שינויי היסטון ידי רצפי DNA וimmunofluorescence ידי דגי DNA אחרי מיקרוסקופיה וניתוחי 3D (חיסוני דגי 3D). היתרון של פרוטוקול זה הוא ההדמיה המשולבת של דנ&quot;א ושימור של מבנים חלבוניים. הניסיון שלנו בתחום זה אפשר לנו לשפר ולפשט את פרוטוקולים קיימים. למרות שיש לנו להשתמש בפרוטוקול זה כדי לזהות הפסקות גדילי הדנ&quot;א כפולים בהלימפוציטים עוברים רקומבינציה, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על חלבונים אחרים וסוגי תאים אחרים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> דיג </td><td> # BP2470 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> סיגמא </td><td> # R4642 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td> סיגמא </td><td> # DNTP100 </td><td></td></tr><tr><td> אלקסה dUTP </td><td> Invitrogen </td><td> # C11397 ל-C-11401 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 או Cy5 dUTP </td><td> דיג </td><td> # 45-001-xxx </td><td></td></tr><tr><td> אני DNase </td><td> רוש </td><td> # 04536282001 </td><td></td></tr><tr><td> DNA פול אני </td><td> Biolabs </td><td> # M0209 </td><td></td></tr><tr><td> 0.025 מסנני מיקרומטר </td><td> Milliporדואר </td><td> # VSWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> Cot-1-DNA 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> Invitrogen </td><td> # 18440 </td><td></td></tr><tr><td> Hybloc DNA 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> אפלייד גנטיקה </td><td> # MHB </td><td></td></tr><tr><td> זרע סלמון </td><td> סיגמא </td><td> # D1626 </td><td> האבקה לresuspended ב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל בH 2 O </td></tr><tr><td> NaAc (נתרן יצטט, pH 5.2, פתרון חיץ) </td><td> סיגמא </td><td> # S7899 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 400 (מול כיתת Biol) </td><td> דיג </td><td> # 525 </td><td></td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidone (מול כיתת Biol) </td><td> דיג </td><td> # BP431 </td><td></td></tr><tr><td> אבקת סולפט dextran </td><td> סיגמא </td><td> # D8906 </td><td></td></tr><tr><td> (מלוח סודיום פוספט-EDTA) 20x פתרון SSPE </td&gt; <td> דיג </td><td> # BP1328 </td><td></td></tr><tr><td> פוראמיד </td><td> דיג </td><td> # BP227 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> דיג </td><td> # 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> שקופיות </td><td> דיג </td><td> # 12-550 </td><td></td></tr><tr><td> צלחות 6-כן </td><td> דיג </td><td> # 0720080 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 10x </td><td> דיג </td><td> # MT-46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> פתרון פולי-L-ליזין </td><td> סיגמא </td><td> # P8920 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde, prills, 95% </td><td> סיגמא </td><td> # 441244 </td><td></td></tr><tr><td> טריטון-X-100, מול Biol כיתה </td><td> סיגמא </td><td> # T8787 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (אלבומין סרום שור) Fraction V </td><td> דיג </td><td> # BP 1600 </td><td></td></tr><tr><td> סרום עיזים רגיל </td><td> מעבדות וקטור </td><td> # S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20, מול Biol כיתה </td><td> סיגמא </td><td> # P9416 </td><td></td></tr><tr><td> SSC (ציטראט נתרן המלוח) 20x פתרון </td><td> דיג </td><td> # BP1325 </td><td></td></tr><tr><td> להאריך מגיב antifade זהב </td><td> Invitrogen </td><td> # P36930 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole) </td><td> סיגמא </td><td> # D9542 </td><td></td></tr><tr><td> המלט הטוב ביותר מבחן אחד מעייל גומי </td><td> חנויות לציוד אומנות או במשרד </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טבלת 1. ריאגנטים ספציפיים וציוד קטן. </td></tr></tbody></table>

immunofluorescence שילוב ודגי dna על 3d-השתמרו גרעיני interphase לחקר שינויים בארגון גרעיני 3d

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

פלורסנט כלאה באתר באמצעות בדיקות DNA על 3-ממדי גרעינים נשמרו אחרי מיקרוסקופיה confocal 3D (דגי DNA 3D) מייצג את הדרך הישירה ביותר כדי לחזות את המיקום של לוקוסים גנטיים, כרומוזומלית תתי אזורים או שטחים שלמים בתאים בודדים. סוג זה של ניתוח מספק תובנה הארכיטקטורה העולמית של הגרעין, כמו גם את ההתנהגות של לוקוסים הגנומי ספציפיים ואזורים בתוך השטח הגרעיני. Immunofluorescence, לעומת זאת, מאפשר זיהוי של חלבונים גרעיניים (ההיסטונים שונים, משתנה ומכפילי היסטון, מכונות וגורמי שעתוק, תת תאים גרעיניים, וכו &#39;). האתגר הגדול בשילוב דגי DNA immunofluorescence ו3D הוא, מצד אחד לשמר epitope זוהה על ידי הנוגדן כמו גם ארכיטקטורת 3D של הגרעין, ומצד שני, על מנת לאפשר את החדירה של הבדיקה DNA כדי לזהות לוקוסים גנטיים או טריטוריות כרומוזום 1-5. כאן אנו מספקים פרוטוקול שמשלב הדמיה של שינויי הכרומטין עם לוקוסים הגנומי גרעינים נשמרו 3D.

ה-DNA וחיסוני דגים רגילים במעבדת Skok ללמוד את השינויים בארגון גרעיני הקשורים בתהליך של רקומבינציה V (D) J של לוקוסי קולט אנטיגן במהלך פיתוח הלימפוציטים B ו-T. הטכניקות המפורטות לעיל תאפשרנה לנו i) למדוד מרחקים בין שני הקצוות של לוקוס (התכווצות) ii) למדוד מרחקים בין האללים (לוקוסים או זיווג), III) לנתח את הניזק לדנ&quot;א מתרחש בתוך לוקוסים, ד) להעריך את מיקומו של אללים ולוקוסים ביחס לגרעיניים תת מדורים (heterochromatin pericentromeric המדכא במחקר שלנו), וV) להעריך את הקשר בין החל...

כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי בו זמני של שינויי היסטון ידי רצפי DNA וimmunofluorescence ידי דגי DNA אחרי מיקרוסקופיה וניתוחים (דגי 3D החיסוני DNA) 3D.

Immunofluorescence שילוב ודגי DNA על 3D-השתמרו גרעיני Interphase לחקר שינויים בארגון גרעיני 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות שינויים בכרומטין ורצפי DNA בו זמנית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית תלת מימדית, נוצרות בדיקות DNA ספציפיות ראשונות. בינתיים, תאי הניסוי קבועים וצבועים במערכת החיסון. לסמני ההיסטון המעניינים.לאחר מכן התאים עוברים דנטורציה ופלואורסצנטיות לילה בתוכך. הכלאה או דגים מתבצעת באמצעות בדיקת DNA אחת או יותר. לבסוף, התאים נשטפים ומורכבים לפלואורסצנטיות תלת מימדית.ניתוח מיקרוסקופיה של התמונות המתקבלות חושף לוקליזציה גרעינית של מיקומים מעניינים ואסוציאציה לשינויים ספציפיים באבן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת הדמיה של חלבון גרעיני, כולל אבנים עם מיקומים גנומיים בגרעיני שימור תלת מימדיים, ויכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום הארגון הגרעיני האפיגנטי של כרומטין או ויסות גנים. לצורך הליך זה, ניתן להשתמש בפלסמידים אחוריים או במוצרי PCR לתיוג.יש להכין אותם כמתואר בטקסט הנלווה. שימו לב שעבור אות דג חזק, הגשושיות צריכות להוציא לפחות 10 קילו-בסיס זוג. התחל הליך זה על ידי שילוב של מיקרוגרם אחד של DNA ו-0.17 מיקרוגרם של RNAs A בצינור מיקרו צנטריפוגה.דגירה למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, השביתו לזמן קצר את ה-RNAs A על הקרח והוסיפו את הכמות המתאימה של תרגום ניק. מערבבים את הדגירה במשך שעתיים בחום של 16 מעלות צלזיוס באמבט מים מקורר או בבלוק קריר כדי לנטרל את התגובה.הנח את הצינורות על שלילי 80 מעלות צלזיוס למשך שעה או שלילי 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, קבע את גודל הגשושית על ג'ל אגרוס של 2%. המריחה צריכה להיות בין 101,000 זוג בסיסים כאשר הרוב בכ-300 עד 500 זוג בסיסים.שימו לב שהמריחה של בדיקות מדע בדיוני אינה נראית לעין. לאחר קביעת הגודל, יש לטהר את הבדיקות באמצעות דיאליזה ב-0.02. פילטרים של חמישה מילימטר בכוסות של שני ליטר מלאות במים.פיפטה בעדינות 200 מיקרוגרם של בדיקה על מרכז כל מסנן צף, ולאחר מכן דגירה במשך שעתיים בחושך. לאחר הדגירה, השתמש בפיפטה כדי להעביר בעדינות את הגשושית מהפילטרים לצינור מיקרו צנטריפוגה טרי. לאחר מכן, הוסף גורמים חוסמים לבדיקות כדלקמן.מיקרוגרם אחד של CO 1D NA. מיקרוגרם אחד של DNA בלוק גבוה ו-10 מיקרוגרם של זרע סלמון עבור מיקרוגרם אחד של בדיקת DNA ותערובת מאחסנים את בדיקות ה-DNA ב-20 מעלות צלזיוס שליליות. ביום הליך הדגים, הבדיקות משקעות ומוכנות לשימוש. שים לב שיש לבצע את השלבים המתוארים בסעיף זה של סרטון הווידאו במקביל לשלבים בסעיף הבא.כדי לזרז את הבדיקות, עקוב אחריהן ושלב אותן עם נפח 0.1 של שלוש נתרן אצטט מולארי ב-pH 5.2 ו-2.5 נפחים של 100% אתנול מודגר למשך שעה אחת ב-80 מעלות צלזיוס שליליות. לאחר הדגירה, סובב את הגשושיות כלפי מטה ב-16,000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הסיבוב, השליכו את הסופרנטנט וייבשו את הכדורים באוויר בחושך.בהתאם לכמות ולצבע של הבדיקות, הגלולה עשויה להיות גלויה או לא. Resus השעו את הגלולה ב-15 מיקרוליטר של מאגר הכלאה לכל מצב בדיקה ונערו באמצעות מערבל תרמו של einor בחושך בטמפרטורה של 37 עד 45 מעלות צלזיוס למשך כ-20 דקות. לאחר הדנטורציה, הגשושיות דוגרות עליהן במשך חמש דקות בטמפרטורה של 75 עד 95 מעלות צלזיוס.לאחר מכן כדי לבצע בדיקות מוקדמות, דגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות על מערבל התרמו. מיד לאחר הדגירה, הבדיקות יוחלו על תאים על פתקי כיסוי כמתואר בחלק הבא של הסרטון. שימו לב כי עבור השלבים הבאים, יש לשנות את זמני הדגירה לפי הצורך עבור הנוגדנים והתאים בהם נעשה שימוש.יש לבצע את השלבים המתוארים בחלק זה של הסרטון במקביל לשלבים בסעיף הקודם כמתואר בטקסט הנלווה. זרוק תאים שאינם נדבקים על גבי כיסוי מצופה פולי ליזין מחליק בבארות של שש צלחות באר ותן להם להיצמד למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסיפו בעדינות שני מיליליטר של 2% אלדהיד פרפורם בדגירה PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה.שטפו כל באר עם PB S3 פעמים ואז כדי לחדור לתאים, הוסיפו שני מיליליטר קר כקרח, 0.4% טריטון X 100 ב-PBS ודגרו במשך חמש דקות על קרח. לאחר שאיבת התמיסה החדירה אם דגי DNA ישולבו עם אימונופלואורסצנטיות, המשך באופן הבא. פיפטה ראשונה 100 מיקרוליטר של תמיסת חסימה על פרם בתא לח.הנח את צד תא ההחלקה של המכסה כלפי מטה על התמיסה החוסמת ודגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבר. הכיסוי מחליק ל-100 טיפות מיקרוליטר של הנוגדן העיקרי המדולל בתמיסת חסימה.כאן הנוגדן המשמש מזהה סורי זרחני 1 39 של H שתיים A x או גמא H שתיים A x. דגרו את המגלשות בתא לח למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, השתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את החלקות הכיסוי.אם קשה להרים את החלקות הכיסוי, הציפו ב-PBS ונסו שוב. מעבירים כל שקופית לבאר של שש. צלחת באר המכילה שני מיליליטר של 0.2% BSA 0.1% בין 20 ב-PBS לשטוף את הכיסוי מחליק בתמיסה זו שלוש פעמים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם טלטול, ואז לדגור תאים עם הנוגדן המשני המצומד פלואורופור המתאים מדולל בתמיסה חוסמת למשך שעה בטמפרטורת החדר בתא חשוך ולח על הפרם.כמו לפני לאחר הדגירה, שטפו את התאים ב-0.1% בין 20 ב-PB S3 פעמים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בחושך כדי לתקן את התאים, טבלו אותם בשני מיליליטר של 2%para פורמלדהיד ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר שהתאים הוכתמו או אם הם לא מוכתמים, המשיכו את דגי ה-DNA על ידי שטיפת החלקות הכיסוי שלוש פעמים ב-PBS. לאחר מכן הנח את המכסה מחליק את צד התא כלפי מטה על טיפה של 100 מיקרוליטר של 0.1 מיליגרם למיליליטר.RNA על פרם בתא לח ודוגר במשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, יש לשטוף את הכיסוי שלוש פעמים ב-PBS ואז לחלחל את התאים בקור קרח 0.7% טריקס 100 בחומצה הידרוכלורית מולרית 0.1 למשך 10 דקות על קרח בחושך. לאחר שלוש שטיפות ב-PBS מנטרלים את התאים בחומצה הידרוכלורית 1.9 מולרית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך ונשטפים שלוש פעמים נוספות ב-PBS קר כקרח, לצד הכלאה של תאים עם הבדיקות.הנח את הכיסוי עם צד התא כלפי מטה על טיפת בדיקה של 15 מיקרוליטר שהוכנה בחלק הקודם של סרטון זה על שקופית מיקרוסקופ, אטום את השקופית במלט גומי ודגר למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס בתא לח חשוך. למחרת, השתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את מלט הגומי מהמגלשות. לאחר מכן שפעת את החלקות הכיסוי עם שני Acts SSC והשתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את החלקות הכיסוי עם התאים.ואז הניחו אותם בבארות המכילות תמיסת כביסה. לאחר מכן, בצע את השטיפות הבאות עם טלטול בחושך שני XSSC למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, שני XSSC למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ו-XSSC אחד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להרכיב את השקופיות, הנח את הכיסוי מחליק את צד התא כלפי מטה על טיפה של 10 עד 15 מיקרוליטר של מדיום הרכבה זהב ממושך המכיל 1.5 מיליגרם לחותם DPI מיליליטר עם לק. ניתן לאחסן את השקופיות במשך חודשים בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס.לאחר שהשקופיות מוכנות, אספו תמונות תלת מימד עם חתכים אופטיים המופרדים ב-0.3 מיקרון ונתחו כמתואר במסמך הנלווה כדי לקבוע אם שינויים באסוציאציה של שני האללים של מיקומי קולטני האנטיגן קשורים לוויסות תהליך הרקומבינציה של VDJ במהלך התפתחות הלימפוציטים, תאים מסוג פרא ותאים מוטנטיים חסרים בסמרטוט החלבון הרקומבינאז אחד שימש לבחינת מוקד עניין באמצעות DNA בדיקת דגים שנוצרה מגב המשתרע על פני כ-200 קילו-בסיס המקיף את האזור הגנומי. המרחקים בין האללים נמדדו בין מרכז המסה של כל אות אחורי בערימות תמונות תלת מימדיות, עיגולים מקווקווים, צורות גרעין מתאר. פסי קנה המידה המוצגים הם מיקרון אחד, עקומות התפלגות תדרים מצטברות נוצרו לאחר מכן כדי להראות את כל טווח המרחקים בין שני האללים שנמדדו בתאים מסוג הבר ובתאים המוטנטיים.לאחר מכן נעשה שימוש במבחן KS הלא פרמטרי של שני מדגמים כדי להעריך את משמעות ההבדלים בין שתי ההתפלגויות. טווח ההבדלים החזקים ביותר במרחקים בין-אלליים הוערך באמצעות סדרה של שתי בדיקות מדויקות של דייג זנב שצוינו על ידי הנקודות הכחולות. ערכי ה-P החזקים ביותר שצוינו על ידי הנקודות הגבוהות נמצאו עבור המרחקים סביב מיקרון אחד.לפיכך, החתך לקשר הדוק או זיווג של שני האללים נקבע במיקרון אחד. עקומות התדר המצטברות המוצגות כאן מצביעות על טווח המרחקים לקשר הדוק של שני האללים מאפס עד 1.5 מיקרון בשני התנאים הביולוגיים השונים. המשמעות של זיווג שני האללים הוערכה באמצעות מבחן דייג שני זנב מדויק לניתוק במיקרון אחד.גרף זה מראה כי במצב המוטנטי, שני האללים אינם קשורים לתדר גבוה כמו בסוג הפראי. לפיכך, סמרטוט החלבון החסר מעורב בזיווג איני. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לשלב אימונופלואורסצנציה ודגי DNA.טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים על ידי מתן תובנות לגבי השינויים הגלובליים בארכיטקטורה הגרעינית, ההתנהגות של מיקומים ואזורים גנומיים ספציפיים בתוך המרחב הגרעיני והקשר של חלבונים גרעיניים ספציפיים באזורים אלה. וזה עוזר להבין את המנגנונים העומדים בבסיס מחלות שונות בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו טכניקות תפוקת קרח רחבות גנום כגון כרומטין, משקעים חיסוניים, או אישור חיפוש או לכידת כרומוזומים יחד עם ריצוף עמוק כמו קדמת חמש C או IC, כדי לספק נתונים גלובליים על אוכלוסיות תאים.

combined-immunofluorescence-dna-fish-on-3d-preserved-interphase

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים

מאמר זה מתאר את הבחירה של בדיקות מתאים FISH מתא בודד, טכניקות הפצת עבור גרעינים blastomere, וב הכלאה באתרו ניקוד האות, להחיל אבחון גנטי טרום השרשה (PGD) בסביבה קלינית.

FISH לאבחון גנטי טרום השרשה

בסרטון זה, אנו מתארים את שיטת האימונופלואורסנציה כדי לדמיין את הלוקליזציה של חלבוני תיקון הדנ"א γH2AX ו- 53BP1 באתרים של הפסקות DNA דו-גדילי בגרעין התא המוקרנ.

הדמיה מבוססת אימונופלואורסנציה של אינטראקציות חלבון תיקון DNA

אנו מתארים פרוטוקול חזק ותכליתי לניתוח ארכיטקטורה גרעינית ידי דגי DNA 3D באמצעות בדיקות ניאון שכותרתו ישירות.

דגי ה-DNA 3D חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות

החומר כאן מתאר שיטה שפותחה כדי לשמר את מבנה הכרומטין התלת מימדי של תאי נבט האשכים. שיטה זו נקראה שיטת השקופית התלת-ממדית (תלת-ממדית). שיטה זו משפרת את הרגישות לגילוי מבנים תת-גרעיניים והיא ישימה עבור פלואורסצנטיות חיסונית, דנ"א ופלואורסצנטיות RNA בהכלאה במקום (FISH).

שיטת הכנת שקופיות לשמירה על ארכיטקטורת כרומטין תלת מימדית של תאי נבט האשכים

הדמיה ארבעה ממדים (4D) מנוצל כדי ללמוד את ההתנהגות ואינטראקציות בין שני סוגים של endosomes בחיים מסוף עצב חוליות. תנועה של המבנים הקטנים האלה מתאפיינת בשלושה ממדים, המאפשרת אישור של אירועים כגון היתוך endosome וexocytosis.

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

פיתוח cilia חיוני organogenesis נכונה. פרוטוקול זה מתאר שיטת אופטימיזציה תווית, דמיינו תאים ciliated של דג זברה.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

פרוטוקול זה ממחיש החיסונית רציפים של האנטי ואימונוהיסטוכימיה על קריודורים מן השלב המוקדם של העוברים ומאפשרים לניתוחי לוקליזציה מדויקים באוכלוסיות תאים ספציפיות.

מרפאוולוגיה רציפה ואימונוהיסטוכימיה על קריוסינות עוברי דג

3d-DNA דגים ססגוניות מייצג כלי להמחיש המקום גנומית מרובים בתוך גרעיני תלת-ממד משומרים, חד משמעית הגדרת אינטראקציות הדדית שלהם לוקליזציה בתוך החלל הגרעיני ברמת תא בודד. כאן, פרוטוקול צעד אחר צעד מתואר עבור קשת רחבה של תאים ראשוניים אנושיים.

3D מרובת צבעים דג DNA כלי ללמוד אדריכלות גרעינית בתאים ראשוניים אנושיים

אנו מציגים כאן פרוטוקול משופר להכנה וחיסון של כל ההר של אשכי דרוזופילה, מתאים למיקרוסקופיה קונפוקלית וגם מאפשר תיוג ניתן לשחזור ואמין. אנו ממחישים פרוטוקול זה על ידי ייצוג תלת מימדי וכימות של ניסויי קולוקליזציה על זרעונים S4-S5 גדולים.

חיסון של אשכי דרוזופילה הר שלם לניתוח קונפוקלי תלת מימדי של זרעונים גדולים

למד לזהות שינויים במודיפיקציות היסטון ורצפי DNA בו-זמנית באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקלית תלת-ממדית. השיטה משלבת אימונופלואורסצנציה ו-DNA FISH לחקר דינמיקת כרומטין בגרעיני תאים.

Immunofluorescence שילוב ודגי DNA על 3D-השתמרו גרעיני Interphase לחקר שינויים בארגון גרעיני 3D

גלה סרטונים נוספים