Name: Cryosectioning קהילות שמרים לבחינת דפוסי פלואורסצנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: למד את שיטת קריוסקשן לקהילות שמרים לבחינת דפוסי פלואורסצנטי באמצעות תיקון מתנול וחיתוך קריוגני. השיטה מאפשרת שימור התפלגות מרחבית של אוכלוסיות תאים פלואורסצנטיים עמוק בתוך הקהילה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו רוצים להודות ליונתן קופר מעבדה בפרד האצ&#39;ינסון לחקר הסרטן לרשות להשתמש cryostat. עבודה זו נתמכה על ידי NIH וקק WM קרן. BM הוא עמית גורדון ובטי מור של קרן לחקר מדעי חיים. אנו מודים לדניאל Gottschling הפרוטוקול לשיתוף קיבועו איתנו.

1. תיקון קהילות שמרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול קהילות שמרים על קרום מסנן (למשל, Millipore MF קרום מסנן; 2A איור). פרוטוקול זה מתאים לקהילה טיפוסית של פחות מ 2x10 8 תאים במסנן 6 מ&quot;מ בקוטר הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפיסת נייר סינון Whatman 541 כדי לכסות את תחתית סנטימטר בקוטר 1 היטב (איור 2 ב &#39;). נייר Whatman זה ישמש כנישא להעברת הקהילה בשלבים מאוחר יותר. הוסף 1 המ&quot;ל מתנול 100% לטובים, ולהשאיר גם ב-20 ° C לטמפרטורה לאזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים נוזל N 2 בדיואר. הקפא קהילה בחנקן נוזלי על ידי טבילת הקהילה במשך לפחות 15 שניות בנוזל N 2 באמצעות פינצטה (האיור 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הקהילה קפוא לטוב של מתנול -20 מעלות צלזיוס (האיור 2D). להבטיח שהקהילה נשמרת אופקי כאשר השקיע אותה במתנול.חכה 20 דקות. MF קרום המסנן מתחיל להתפורר במתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הקהילה באמצעות מוביל נייר סינון Whatman 541 ממתנול גם לצלחת פטרי קרה כל זמן ב -20 ° C לאידוי מתנול (2E איור). בעת ההעברה, לשמור על הקהילה על גבי מנשא Whatman מסנן ולהתרחק טיפין נוספות של מתנול באמצעות פיסת נייר אחר Whatman עבה לפני לשים בצלחת פטרי הקרה. זה יבטיח כי זמן האידוי הוא עקבי ממדגם למדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 4-6 שעות עד לאידוי מנשא Whatman המסנן נראה יבש. האידוי משאיר מספיק מתנול שיורים אשר מפריע לחתך. במהלך ייבוש סדקים ועיוות גורמת בקהילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח דוגמה מ-20 ° C במקפיא. לחתוך נייר סינון Whatman 541 אינן מכוסה על ידי קהילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך מכל מעוקב מלבני אלומיניום רדיד שהוא גדול מספיק כך שהמדגם יש לפחות ~ שולי מ&quot;מ 2 מכל צד (האיור 2F). הנח את הקהילה על המשטח התחתון של מכל אלומיניום הרדיד; לכסות את המדגם עם אוקטובר עד 3 ~ 4 מ&quot;מ מעל גובה הקהילה באופן מיידי. אם חשוב, הנטייה של המדגם יכולה להיות מותאמת בשלב זה בכל הנוגע לצדדים של המכל. חכה 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את דוגמא אוקטובר-מוטבע על צלחת מתכתית בקרח יבש להקפאה. אחסן את הקהילות קפואות ב -20 ° C או C ° מקפיא -80. </li></ol> 2. קטגוריות קיימים קהילות קפואות לדימות פלואורסצנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הטמפרטורה של חדר cryosection ל-25 ° C ולהשאיר את הדגימות בחדר עד שהטמפרטורה שלו מגיעה לטמפרטורה של החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר המדגם על cryo-Mount לאחר החלת ירידה של אוקטובר בהר. מורח אוקטובר אחיד בצד של מדגם בנייר נחשף Whatman מסנן (חלק תחתון של המכל) כך שעובי אוקטובר הוא 2-3 מ&quot;מ. בואו הקפאת אוקטובר בתוך חדר cryostat לפני sectioning. הבטחת רווחיות אוקטובר של 2-3 מ&quot;מ על כל הצדדים של המדגם עוזרת לשמור על שלמות חלקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדפנות של בלוק מדגם אוקטובר ניתן להשתמש כדי ליישר את המדגם. אם המדגם אינו מיושר ביחס ללהב, חתך יתחיל מפינה או בצד של המדגם. התאם את ההר כדי להבטיח שהלהב חותך להפליא את פנים אנכיות (או אופקי) של גוש המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקים אופייניים עבור קהילות שמרים הם ~ 14 מיקרומטר בעובי. לאחר חיתוך מקטע, להשתמש שקופית מיקרוסקופ נשמר בטמפרטורת חדר כדי לאסוף את הסעיף, על ידי התקרבות לשקופית לאט לסעיף הקיצוץ. הסעיף יתמוסס ולהעביר לשקופית מיקרוסקופ. עד 18 סעיפים ניתן להעביר על גבי שקופית אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את השקופיות בטמפרטורות קרות, רצוי -20 ° C, לפני ההדמיה. אובדן האות הוא מינימאלי כאשר שמרו במשך שבוע אחד ב 4 ° C. לאות פלואורסצנציה מרבית, הדמיה נעשתה רצוי מייד לאחר החתך. </li></ol>

<ol><li>Tolker-Nielsen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+of+Microbial+Biofilm+Communities%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities.</a> Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).</li>
<li>Moller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+In+Situ+Gene+Expression+in+Mixed-Culture+Biofilms%3A+Evidence+of+Metabolic+Interactions+between+Community+Members%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)"> In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).</li>
<li>Lepp, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanogenic+Archaea+and+human+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Methanogenic Archaea and human periodontal disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).</li>
<li>Váchová, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony%3A+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).</li>
<li>Mináriková, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Gene+Expression+in+Cells+within+Yeast+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies.</a> Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).</li>
<li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+cooperation+in+engineered+yeast+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthetic cooperation in engineered yeast populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).</li>
<li>Momeni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+generates+a+unique+spatial+signature+in+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities.</a> , Submitted (2012).</li>
<li>Kiernan, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKiernan%2C+J+%22Histological+and+Histochemical+Methods%3A+Theory+and+Practice%22">Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice</a>. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4(2008).</li>
<li>Piccirillo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rim101p%2FPacC+Pathway+and+Alkaline+pH+Regulate+Pattern+Formation+in+Yeast+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies.</a> Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

ההליך שהוצג כאן מציע דרך כדי להתבונן במבנה הפנימי של קהילות שמרים. צעד קיבוע מתנול הופך את מושבת השמרים נוקשה 8 ושומר על שלמותה של המושבה, ואולם, הוא גם גורם להתכווצות 8 שצריכים להילקח בחשבון בלפרש את התוצאות. אנחנו בדרך כלל רואים סביב 30% התכווצות בגובה של מושבות שמרים, בהשוואה למושבות משובצות ישירות באוקטובר ללא תיקון 9. כדי למנוע התכווצות, גישה חלופית לcryosectioning היא ישירות...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> 100% מתנול </td><td> JT בייקר </td><td> 9070-01 </td><td></td></tr><tr><td> מתחם רקמות-Tek אוקטובר </td><td> Andwin מדעי </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Whatman כיתת מספר 541 נייר סינון כמותית </td><td> Whatman </td><td> 1541-047 </td><td></td></tr><tr><td> Millipore-MF ממברנה סינון </td><td> Millipore </td><td> HAWP04700 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> ליקה </td><td> CM 1510 S </td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning קהילות שמרים לבחינת דפוסי פלואורסצנטי

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

חיידקים בדרך כלל לגור ביישובים. הארגון המרחבי של תאים בתוך קהילה הוא האמין כדי להשפיע על ההישרדות והתפקוד של הקהילה 1. שיטות אופטיות, כולל חתך מיקרוסקופיה confocal ושני פוטונים, הוכיחו שימושיות להתבוננות ארגון המרחבי של קהילות חיידקים וarchaeal 2,3. שילוב של הדמית confocal וחתך פיזי של מושבות שמרים חשף ארגון הפנימי של תאים 4. עם זאת, חתך אופטי ישיר באמצעות מיקרוסקופיה confocal או שני פוטונים הצליח רק להגיע לכמה שכבות תאים עמוקים לתוך מושבות שמרים. מגבלה זו עשויה בגלל פיזור אור חזק מתאי שמרים 4. כאן, אנו מציגים שיטה המבוססת על התיקון וcryosectioning להשיג פיזור המרחבי של תאי ניאון בתוך קהילות cerevisiae Saccharomyces. אנו משתמשים במתנול כסוכן מקבעכדי לשמר את הפריסה המרחבית של תאים. קהילות קבועות הם הסתננו עם מתחם אוקטובר, קפוא, וcryosectioned בcryostat. דימות פלואורסצנטי מהסעיפים חושפת את הארגון הפנימי של תאי ניאון בקהילה. דוגמאות לקהילות שמרים הכוללות זנים המבטאים חלבוני ניאון אדומים וירוקים מדגימות את הפוטנציאל של שיטת cryosectioning כדי לחשוף את הפיזור המרחבי של תאי ניאון כמו גם זה של ביטוי גנים במושבות שמרים 2,3. למרות ההתמקדות שלנו הייתה בקהילות cerevisiae Saccharomyces, באותה השיטה יכולה באופן פוטנציאלי להיות מיושמת לבחון קהילות חיידקים אחרות.

תמונות פלואורסצנציה של חתכים אנכיים של קהילות שמרים המכילות אוכלוסיות לאדומות וירוק מתויגות תחרותיות 6 מוצגות באיור 3. קהילות אלה מורכבות משני זני prototrophic של שמרים והתחרות שלהם למשאבים משותפים, כולל שטח, מובילות לעמודי 7 דפוסים, כפי שהיא מוצגות בחתכים האנכיים שלהם. החלטות עד לתא בודד ניתן לפתור בחתכים. איור 3 משווה חתכי רוחב של קהילות לשכפל הושגו עם (תחתון) וללא מתנול-קיבוע (למעלה), בעקבות הפרוטוקולים באיור 1.</s...

אנו מציגים פרוטוקול להקפאה וcryosectioning קהילות שמרים להתבונן דפוסים הפנימיים של תאי ניאון. השיטה מסתמכת על מתנול, תיקון ואוקטובר הטבעה-לשמר את הפיזור המרחבי של תאים ללא inactivating חלבוני ניאון בתוך קהילה.

Cryosectioning קהילות שמרים לבחינת דפוסי פלואורסצנטי

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לייצר חתכים רוחביים של קהילות שמרים כדי לבחון את ההתפלגות המרחבית של אוכלוסיות תאים פלואורסצנטיים שונות בתוך קהילה. זה מושג תחילה על ידי הקפאת הקהילה ולאחר מכן קיבוע באמצעות מתנול כדי לשמר את הפיזור המרחבי של התאים בקהילה. כשלב השני, המתנול מתאדה כדי לאפשר חדירה של תרכובת ה-OCT המוטמעת.לאחר מכן הקהילה המוטמעת מוקפאת כהכנה להקפאה. לאחר מכן, קטעי קריו. ניתן לדמות את הקהילה ואת חתכי הרוחב תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקבלות תוצאות המראות את ההתפלגות המרחבית של אוכלוסיות תאים פלואורסצנטיים בתוך קהילה.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו חתך אופטי, הוא שהיא חושפת את ההתפלגות המרחבית של אוכלוסיות עמוק בתוך קהילות אלה. כדי להתחיל בהליך זה, גדל קהילות שמרים על פילטר ממברנה. פרוטוקול זה מתאים לקהילה טיפוסית של פחות מפעמיים 10 לשמונת התאים במסנן ממברנה בקוטר שישה מילימטר הבא במקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס.כדי לשמור על רמה גבוהה יותר של פלואורסצנטיות, השתמש בפיסת נייר סינון ווטמן 5 4 1 כדי לכסות את החלק התחתון של קוטר סנטימטר אחד. ובכן, נייר סינון זה משמש כמנשא להעברת הקהילה בשלבים מאוחרים יותר, הוסיפו לבאר מיליליטר אחד של מינוס 20 מעלות צלזיוס, 100% מתנול, והשאירו את הבאר במינוס 20 מעלות צלזיוס כדי שהטמפרטורה תתאזן. כעת, הקפיאו את קהילת השמרים על ידי

cryosectioning-yeast-communities-for-examining-fluorescence-patterns

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

גישה חזקים כדי לפקח על משלוח של האברונים את לומן חומצי של vacuole את השמרים במשך השפלה ומיחזור מתואר. השיטה מסתמכת על תיוג הספציפי של האברונים היעד עם פלואורסצנטי כפול פליטת מקודדים גנטית pH-biosensor, ויזואליזציה של תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

פרוטוקול זה מתאר הליך ניסיוני לביצוע...

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

כתב יד זה מתאר שיטה קלה לשימוש בעלות הנמוכה cryofixation המאפשרת הדמית תאי השעיה ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים.

מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

כאן, אנו מציגים הדמיה תא חי שהיא שיטת מיקרוסקופ לא רעיל המאפשר לחוקרים ללמוד התנהגות החלבון הדינמיקה הגרעינית בתוך חי ביקוע תאים שמרים במהלך מיטוזיס ו meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

אנו מציגים פרוטוקול להכנת lamella של דגימות ביולוגיות קפואות לצלול על ידי מיקרו-מכונות קרן יונים ממוקדות קריו למחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולולים במקום עם טומוגרפיה קריו-אלקטרונית. הפרוטוקול המוצג מספק קווים מנחים להכנת lamellae באיכות גבוהה עם רבייה גבוהה לאפיון מבני של macromolecules בתוך cerevisiae Saccharomyces.

הכנה ומיקרו-מכונות קריו-FIB של סרביסיה Saccharomyces עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרון

פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה ומהירה של culturing שמרים ואת התבנית Aspergillus fumigatus מקבוצות גדולות של דגימות קרקע תוך 7 ימים בלבד. ניתן לשנות את השיטות בקלות כך שיתאימו למגוון של מדיות דגירה וטמפרטורות לפי הצורך לניסויים.

בידוד של שמרים ועובשים הניתנים לעיבוד מאדמות כדי לחקור את מבנה האוכלוסייה הפטרייתית

שמרי ביקוע משמשים כאן כפונדקאי הטרולוגי לביטוי חלבוני שלד ציטו-שלד חיידקיים כגון FtsZ ו-MreB כחלבוני היתוך תרגומיים עם GFP כדי להמחיש את הפילמור שלהם. כמו כן, תרכובות המשפיעות על פילמור מזוהות על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

שמרי ביקוע כפלטפורמה למסכי תרופות אנטיבקטריאליים המכוונים לחלבוני שלד ציטו-בקטריאלי

פרוטוקול זה מספק הנחיה מקיפה להגדרה ולניטור כמותי של תרביות משותפות, כולל ציאנובקטריה מפרישת סוכר פוטו-אוטוטרופיים ושמרים הטרוטרופיים.

הרכבה וכימות של תרביות משותפות המשלבות שמרים הטרוטרופיים עם ציאנובקטריה מפרישת סוכר פוטוטרופית

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות לעצירת מחזור תאי שמרים ושחרור אופציונלי, ומרחיב על השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית לחקר תהליכים תלויי מחזור תא ב-S. cerevisiae.

מניפולציה וניתוח של תהליכים תלויי מחזור התא בשמרים ניצנים

למד את שיטת קריוסקשן לקהילות שמרים לבחינת דפוסי פלואורסצנטי באמצעות תיקון מתנול וחיתוך קריוגני. השיטה מאפשרת שימור התפלגות מרחבית של אוכלוסיות תאים פלואורסצנטיים עמוק בתוך הקהילה.

Cryosectioning קהילות שמרים לבחינת דפוסי פלואורסצנטי

גלה סרטונים נוספים