Cryosectioning קהילות שמרים לבחינת דפוסי פלואורסצנטי
26 בדצמבר 2012
אנו מציגים פרוטוקול להקפאה וcryosectioning קהילות שמרים להתבונן דפוסים הפנימיים של תאי ניאון. השיטה מסתמכת על מתנול, תיקון ואוקטובר הטבעה-לשמר את הפיזור המרחבי של תאים ללא inactivating חלבוני ניאון בתוך קהילה.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לייצר חתכים רוחביים של קהילות שמרים כדי לבחון את ההתפלגות המרחבית של אוכלוסיות תאים פלואורסצנטיים שונות בתוך קהילה. זה מושג תחילה על ידי הקפאת הקהילה ולאחר מכן קיבוע באמצעות מתנול כדי לשמר את הפיזור המרחבי של התאים בקהילה. כשלב השני, המתנול מתאדה כדי לאפשר חדירה של תרכובת ה-OCT המוטמעת.
לאחר מכן הקהילה המוטמעת מוקפאת כהכנה להקפאה. לאחר מכן, קטעי קריו. ניתן לדמות את הקהילה ואת חתכי הרוחב תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקבלות תוצאות המראות את ההתפלגות המרחבית של אוכלוסיות תאים פלואורסצנטיים בתוך קהילה.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו חתך אופטי, הוא שהיא חושפת את ההתפלגות המרחבית של אוכלוסיות עמוק בתוך קהילות אלה. כדי להתחיל בהליך זה, גדל קהילות שמרים על פילטר ממברנה. פרוטוקול זה מתאים לקהילה טיפוסית של פחות מפעמיים 10 לשמונת התאים במסנן ממברנה בקוטר שישה מילימטר הבא במקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס.
כדי לשמור על רמה גבוהה יותר של פלואורסצנטיות, השתמש בפיסת נייר סינון ווטמן 5 4 1 כדי לכסות את החלק התחתון של קוטר סנטימטר אחד. ובכן, נייר סינון זה משמש כמנשא להעברת הקהילה בשלבים מאוחרים יותר, הוסיפו לבאר מיליליטר אחד של מינוס 20 מעלות צלזיוס, 100% מתנול, והשאירו את הבאר במינוס 20 מעלות צלזיוס כדי שהטמפרטורה תתאזן. כעת, הקפיאו את קהילת השמרים על ידי שימוש בפינצטה כדי לטבול את מסנן הממברנה עם הקהילה בחנקן נוזלי למשך 15 שניות לפחות.
לאחר מכן, העבירו את הקהילה הקפואה לבאר עם מינוס 20 מעלות צלזיוס. מתנול במקפיא מבטיח שהקהילה נשמרת אופקית. כאשר טובלים אותו במתנול ממתינים 20 דקות, מסנן הממברנה יתחיל להתפרק במתנול.
לאחר 20 דקות, העבירו את הקהילה באמצעות נייר הסינון וואטמן הנשא מבאר המתנול לצלחת פטרי קרה שנשמרה במינוס 20 מעלות צלזיוס. בעת ההעברה, שמור את הקהילה על גבי מסנן Watman של הספק. משוך טיפות מתנול נוספות בעזרת פיסת נייר ווטמן עבה נוספת לפני שמכניסים אותו לצלחת הפטרי הקרה.
זה יבטיח שזמן אידוי המתנול יהיה עקבי מדגימה לדגימה. המתן ארבע עד שש שעות עד שהמתנול יתאדה. הפסקת האידוי בזמן הנכון היא קריטית להצלחת הליך זה.
כדי למנוע ייבוש יתר של הדגימה, בדוק את מצב קהילת השמרים מעת לעת במהלך האידוי, בזמן שהמתנול מתאדה. הכינו מיכל רדיד אלומיניום מעוקב מלבני גדול מספיק כך שלדגימה יש לפחות כשני מילימטר שוליים מכל צד. הוסף טיפה של OCT לתחתית מיכל זה כדי להבטיח שהדגימה מוקפת ב-OCT מכל הצדדים.
בסיום האידוי, הוציאו את הדגימה מהמקפיא של מינוס 20 מעלות צלזיוס. חותכים את חלקי נייר הסינון שאינם מכוסים על ידי קהילת השמרים. חשוב לבצע שלב זה במהירות.
כדי למנוע ייבוש יתר של הדגימה. הנח את הקהילה על המשטח התחתון של מיכל נייר האלומיניום וכסה מיד את הדגימה ב-OCT עד שלושה עד ארבעה מילימטרים מעל גובה הקהילה. המתן 10 דקות.
לבסוף, הנח את דגימת ה-OCT המוטמעת על צלחת מתכתית על קרח יבש כדי להקפיא את הקהילות הקפואות במינוס 20 מעלות צלזיוס או מינוס 80 מעלות צלזיוס. כהכנה לחיתוך קהילות קפואות, הגדר את הטמפרטורה של תא חתך הקריו למינוס 25 מעלות צלזיוס. השאירו את הדגימות בתא עד שהטמפרטורה שלה תגיע לטמפרטורת החדר.
לאחר מכן הסר את נייר הכסף מהדגימה וחתך את עודפי ה-OCT. מרחו טיפת OCT על תושבת קריו והרכיבו את הדגימה על תושבת הקריו. מורחים את ה-OCT באופן אחיד על צד הדגימה עם נייר סינון ווטמן חשוף כך שעובי ה-OCT יהיה שניים עד שלושה מילימטרים.
הקפדה על מרווח OCT של שניים עד שלושה מילימטרים מכל צידי הדגימה מסייעת בשמירה על שלמות החלקים. הניחו ל-OCT לקפוא בתוך תא הקריוסטט לפני החיתוך. השתמש בצדדים של OCTAMPבלוק כדי ליישר את הדגימה ביחס ללהב.
אם הדגימה אינה מיושרת ביחס ללהב, החיתוך יתחיל מפינה או צד של הדגימה. כוונן את התושבת כדי להבטיח שהלהב חותך פנים אנכיות לחלוטין של בלוק הדגימה. קטעים אופייניים לקהילות שמרים הם בעובי של כ-14 מיקרומטר.
לאחר חיתוך קטע, השתמש בשקופית מיקרוסקופ שנשמרה בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את הקטע. על ידי הזזה איטית של השקופית לחלק החתוך, החלק יימס ויעבור למיקרוסקופ. ניתן להעביר עד 18 חלקים לשקופית אחת.
אחסן את השקופיות בטמפרטורות קרות, רצוי מינוס 20 מעלות צלזיוס לפני ההדמיה. אובדן האות הוא מינימלי כאשר נשמר במשך שבוע בארבע מעלות צלזיוס לאות פלואורסצנטי מקסימלי. הדמיה צריכה להיעשות מיד לאחר החיתוך.
תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של חתכים אנכיים של קהילות שמרים שגדלו בתנאים זהים מוצגות כאן. הקהילה מורכבת משני זנים פוטוטרופיים של visier המתויגים עם החלבונים הפלואורסצנטיים. דובדבן M מוצג כאדום ו-Y-E-G-F-P מוצג כתחרות ירוקה על משאבים משותפים, כולל מובילי שטח לדפוסי עמודים כפי שהם מוצגים בחתכים האנכיים שלהם.
ניתן לפתור רזולוציות עד לתא בודד בחתכים רוחביים. נתון זה משווה חתכים המתקבלים עם קיבוע מתנול המוצג בפאנל התחתון וללא קיבוע מתנול המוצג בפאנל העליון. האות הפלואורסצנטי נשמר בחלקים הקהילתיים ללא תיקון, אך שלמות הקהילה נפגעת.
כתוצאה מכך, חלק מהתאים צפים סביב קצה החתך והתשואה הכוללת נמוכה יותר בהשוואה לקהילות קבועות. קיבוע מתנול שומר על תאי הקהילה יחד, אך גורם להתכווצות כפי שנצפה בירידה בגובה הקהילה. איור זה מציג חתכים אנכיים מייצגים של שדה בהיר ופלואורסצנטי של קהילת שמרים המורכבת משני זנים פרוטופיים של visier teed עם חלבונים פלואורסצנטיים DS RED ו-YFP.
תאים על גבי הקהילה יוצרים כתר שנראה שונה מתאי אם, המאופיין בפיזור חזק יותר בשדה בהיר ובפלואורסצנטיות בהירה יותר. דפוסים אלה עולים בקנה אחד עם דפוסי התמיינות מדווחים במושבות שמרים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בהקפאה לבחינת דפוסי המרחב הקרינה בתוך קהילות שמרים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להקפאה וקריו-סקציה של קהילות שמרים כדי לצפות בדפוסים הפנימיים של תאים פלואורסצנטיים. השיטה משתמשת בקיבוע מתנול והטמעה ב-OCT כדי לשמר את ההתפלגות המרחבית של התאים תוך שמירה על חלבונים פלואורסצנטיים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביולוגיה של תאים
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
- קהילות שמרים
רקע
- הבנת ההתפלגות המרחבית של תאים בקהילות היא חיונית למחקרים ביולוגיים שונים.
- חלבונים פלואורסצנטיים נפוצים לסימון אוכלוסיות תאים ספציפיות.
- שיטות מסורתיות עשויות לשבש את הסידור המרחבי של התאים.
- מחקר זה שואף לספק שיטה אמינה לשימור התפלגות התאים.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול לצפייה באוכלוסיות תאים פלואורסצנטיים בקהילות שמרים.
- לוודא את שימור ההתפלגות המרחבית במהלך תהליך ההקפאה.
- לאפשר הדמיה של חתכים רוחביים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
שיטות ששימשו
- הקפאה של קהילות שמרים להכנה לקריו-סקציה.
- שימוש בקיבוע מתנול לשימור התפלגות התאים.
- אדפוורציה של מתנול כדי לאפשר הטמעה ב-OCT.
- ביצוע קריו-סקציה והדמיה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
תוצאות עיקריות
- שימור מוצלח של אוכלוסיות תאים פלואורסצנטיים בחתכים רוחביים.
- ויזואליזציה ברורה של ההתפלגות המרחבית בתוך קהילת השמרים.
- הוכחת האפקטיביות של השיטה המוצעת.
- התוצאות תומכות במחקרים נוספים על דינמיקה של קהילות שמרים.
מסקנות
- הפרוטוקול משמר ביעילות את הסידור המרחבי של תאים פלואורסצנטיים.
- שיטה זו יכולה להיישם במחקרים שונים הכוללים שמרים וקהילות מיקרוביאליות אחרות.
- מחקר עתידי יכול לבנות על ממצאים אלו כדי לחקור אינטראקציות תאים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Understanding spatial organization in microbial communities is critical for de-risking target validation in antimicrobial and microbiome therapeutics. Cryosectioning yeast communities enables high-resolution fluorescence mapping of gene expression and cell distribution, supporting mechanistic insights into community function and stability. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by preserving native spatial architecture without disrupting fluorescent reporters.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of spatial hypotheses in microbial communities by preserving fluorescent reporter patterns for target validation studies.
- Operational Value: Provides a reproducible method to assess gene expression localization without disrupting community integrity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively imageable sections for screening fluorescent reporters in spatially resolved microbial assays.
- Operational Value: Supports assay standardization through consistent cryosection thickness and fluorescence preservation across replicates.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational biomarker analysis by linking spatial gene expression patterns to community-level phenotypes in yeast models.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical evaluation by preserving spatial context in frozen, sectioned samples.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by enabling spatially resolved fluorescence readouts that inform target engagement and pathway modulation in microbial systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of spatial organization in microbial communities through preserved fluorescence imaging.
- Screening: Delivers assay-ready sections with quantitative fluorescence outputs for evaluating modulator effects on community structure.
- Analytics: Provides spatial fluorescence measurements that allow comparison of conditions based on internal organization patterns.
- Translational Research: Connects spatial gene expression to community function, supporting biomarker alignment in preclinical yeast models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for spatial profiling applicable across microbial strain panels and culture conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by revealing true spatial distribution of fluorescent populations, reducing artifacts from optical scattering.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, embedding, and sectioning parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing spatially resolved data on target engagement in community contexts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated spatial mechanisms in microbial systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and cryostat operation for sectioning and imaging.
- Depends on cryostat, microtome, and fluorescence microscope infrastructure for section preparation and visualization.
- Necessitates standardization of fixation duration, OCT infiltration, and section thickness across teams.
- Involves adaptation considerations for different microbial community sizes and extracellular matrix compositions.
- Limited by tissue integrity during methanol evaporation and OCT embedding, requiring precise timing to avoid over-drying or poor infiltration.
