Name: מולקולרית והדמיה ליעד בתאים שריר מושתלים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-27T08:54:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: למדו שיטה לא פולשנית להערכת הצלחת השתלת מיובלסטים באמצעות גנים מדווחים והדמיית ביולומינסנציה בעכברי MDX דיסטרופיים. טכניקה זו מאפשרת מעקב אחר תאים מושתלים בחי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לסנג&#39;יב Gambhir על המתנה של גן כתב fluc/mrfp/sr39tk. עבודה זו מומנה על ידי רשת לתאי הגזע (SCN) של קנדה, וקרן מסעו של ג&#39;סי.

1. תחזוקה והתקדמות של C2C12 Myoblasts <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת C2C12 myoblasts בבקבוק 2 סנטימטר 75 ולשמור על תאים בסרום של גלוקוז הגבוה Dulbecco השינוי של הנשר (HG-DMEM) בתוספת סרום שור עוברי (FBS) לריכוז סופי של 10%. אל תאפשרו לתאים להפוך לconfluent בכל עת כמו זה יהיה לרוקן את אוכלוסיית myoblastic. בינוני צריכים להיות שונה בכל יום אחרת הערה:. בינונית תמיד חם עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים לפני שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר myoblasts הפך כ 80% מחובר, תאי מעבר לבקבוק חדש. לשאוב מדיום התרבות. שטוף תאים עם פתרון 4-5 מ&quot;ל הנקס מאוזן מלח (HBSS) כדי להסיר את כל העקבות של תרבות בינונית, המכיל סרום טריפסין-עיכוב. בקצרה לשטוף את שכבת התא עם 0.25 (w / v) פתרון טריפסין-EDTA לנתק את myoblasts החסיד מבקבוק% 2-3 מ&quot;ל. לשאוב טריפסין ובקבוקון המקום באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך incuba זהtion, להכין בקבוק חדש עם 9 מ&quot;ל של מדיום FBS HG-DMEM/10%. לאחר trypsinization, להוסיף 10 מ&quot;ל של מדיום מוחלט לתאים וזמני פיפטה 4-5 להבטיח אוסף של כל התאים בטווח הבינוני. הוסף 1 מ&quot;ל של השעית תא לבקבוק החדש ומדגיר CO 5% 2 ב 37 ° C. </li></ol> 2. Transfection התא C2C12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתאים הגיעו 50% confluency, transfect פי הוראות היצרן מInvitrogen. בקצרה, לשלב 90 ריאגנט 2000 μl Lipofectamine עם 4.5 מ&quot;ל בינוני OPTI-ממ. בצינור אחר, לשלב 36 דנ&quot;א גן כתב CMV-trifusion מיקרוגרם עם 4.5 המ&quot;ל OPTI-ממ. פליק כל צינור לשלב ולחכות 5 דקות. שלב את התוכן של שני הצינורות, מערבב בעדינות והדגירה בטמפרטורת חדר למשך שלושים דקות בדיוק. הערה: בקבוק השני צריך גם להגדיר לתאי untransfected שיקבלו Lipofectamine וOPTI-ממ רק כדי לשמש שליטה שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני מC2C12 תאים ולהוסיף 15.5מ&quot;ל של מדיום FBS טרי HG-DMEM/10%. הוסף בינוני transfection להביא נפח כולל עד 20 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התר לתאי transfect לילה עבור לפחות 20 שעות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשאוב בינוני transfection ולהוסיף 10 המ&quot;ל HG-DMEM/10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפו בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. ללכוד הוא שדה מואר ותמונות פלואורסצנציה אדומות (באמצעות קוביית מסנן TRITC; mrfp לשעבר /: 584/607 ננומטר). לספור את מספר התאים המבטאים-RFP שנצפו תחת פלואורסצנטי מחולק במספר הכולל של תאים שנצפו בשדה בהיר עבור שדות מרובים של נוף לייצר יעילות transfection. </li></ol> 3. הערכת Assay הנייד שרידות / MTT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני transfection, 1x10 5 תאים C2C12 צלחת לכל אחד גם בצלחת 24 גם אחד. תאים צריכים להיות מצופים ב500 כרכי μl בHG-DMEM/10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, myoblasts transfect הלילה כפי שתואר לעיל. פעל לפי הצעות יצרן לtransfection reagenכרכי t לצלחת 24 היטב. דגירת קבוצה של בארות עם Lipofectamine בלבד (ללא DNA) כביקורת. צפו בתאים תחת פלואורסצנטי כדי להבטיח שtransfection התקין התרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני transfection וmyoblasts אינקובטורים עם 5 מ&quot;ג / המ&quot;ל thiazolyl הכחול tetrazolium רומיד (MTT) בHG-DMEM/10% FBS. הוסף D-luciferin לשמונה מבארות transfected, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני מבארות. Solubilize גבישי formazan כחולים על ידי הוספת 180 μl isopropanol לכל באר. נער על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנעות מכל משקע, פתרון פיפטה בצלחת 96 היטב ולקרוא בספיגה 575 ננומטר. </li></ol> 4. הכנת Myoblasts להשתלות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני, לשטוף myoblasts עם HBSS, וtrypsinize תאים כפי שמתואר ב1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות תאים ב4 מ&quot;ל של מדיום שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש hemocytometer, ספירת תאים לייצר כרכים המכילים 10 6 myoblasts. פיפטה כרךUme לתוך 1.5 המ&quot;ל microtubes סטריליים. עם יעילות transfection של ~ 10%, ערכים אלה מצביעים על כך שהתאים 100.000 לוציפראז מבטא-ניתנים לאיתור בסורק GE ExploreOptix לאחר השתלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג נפח הזרקה סופית של 15 μl, המכיל 10 6 C2C12 תאים. במידת צורך, סרכזת microtubes ב2000 סל&quot;ד במשך דקה אחת. בזהירות לשאוב supernatant עם פיפטה. Re-להשעות תאים ב15 μl של HG-DMEM FBS החסר. </li></ol> 5. השתלת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם עכבר עם 2%% isoflurane / 2 O 2. למרוט שיער מאזור האיבר האחורי הגבה. לשמור על הרדמה בשיעור של 1.5%% isoflurane / 2 O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תבטיח C2C12 myoblasts מושעה היטב. עם העכבר בתנוחת שכיבה, להאריך את האיבר האחורי ולהשתמש במזרק אינסולין להזריק תאים ישירות לתוך הראש לרוחב של שריר הגסטרוקנמיוס בזווית ° 30. הזרק myoblasts transfected לגפה הימנית האחורית וint myoblasts untransfectedo איבר הנגדי (משמאל) האחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע סריקת פליטת אור בסיסית: מהירות העברת עכבר לבמה בסורק האופטי, נחת העכבר בתנוחת שכיבה. לחבר את קו ההרדמה. כדי להבטיח את העכבר נשאר מורדם, אדם שני צריך להיות נוכח כדי לחבר את קו ההרדמה ואילו במקומות האחרים בחיים של הסורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדינות להאריך את האיבר האחורי כך אזור ההזרקה גלוי. גפיים אחוריים במקום קלטת עם דבק עדין כגון קלטת רפואית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את החדר ולוודא שאין אור יכול לגשת לחלק פנימי של הסורק, שכן דבר יגדיל את אות הרקע זוהתה. הסורק צריך להיות מוגדר לפרמטרים שנכללו בהוראות היצרן שלך עבור הדמית פליטת אור. באופן ספציפי, להבטיח &quot;לא ליזר&quot; נבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר אזור של עניין (ROI) באזור המרוט וסריקת התחלה. </li></ol> 6. הזרקה של תשתית Fluc, D-luciferin, לעכבר MDX &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד העכבר הוא מורדם intraperitoneally להזריק 150 מ&quot;ג / ק&quot;ג של מצע הגחלילית לוציפראז, D-luciferin (מפתרון מניית מ&quot;ל 40 מ&quot;ג /, מורכב על פי הוראות יצרן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזר עכבר ולאפשר תקופת ספיגה 15 דקות לפני הכנת עכבר לסריקה הבאה. </li></ol> 7. BLI ליעד MPCs לוק מבטא-בעקבות שתל לתוך מודלי עכבר של DMD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הקליטה, להרדים עכבר שוב, כפי שתואר ב 5.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העכבר חזרה לסורק האופטי ולבצע סריקת פליטת אור אחר, באותו אופן כמו סריקה ברקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרות תקופת ספיגת דקות 20 אמורה לספק עוצמת אות מקסימלי, סריקה לאחר מכן ניתן לבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השלמת רכישה של תמונה, להקריב את העכבר בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי בעלי החיים המוסדיים ועדת האתיקה שלך והמועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים (CCAC). מבודד את שרירי גפיים אחוריים ואת המקום מיידn 10% פורמלין כדי לתקן לembedment פרפין. בצע צביעת אימונוהיסטוכימיה ללוציפראז לאשר הזרקה לשריר של myoblasts. </li></ol>

<ol><li>Emery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">The muscular dystrophies.</a> Lancet. 359, 687-695 (2002).</li>
<li>Blake, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+genetics+of+dystrophin+and+dystrophin-related+proteins+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle.</a> Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).</li>
<li>Goldring, K., Partridge, T., Watt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells.</a> J. Pathol. 197, 457-467 (2002).</li>
<li>Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+that+participate+in+regeneration+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Cells that participate in regeneration of skeletal muscle.</a> Gene Ther. 9, 752-753 (2002).</li>
<li>Moss, F. P., Leblond, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+as+the+source+of+nuclei+in+muscles+of+growing+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats.</a> Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).</li>
<li>Snow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autoradiographic+study+of+satellite+cell+differentiation+into+regenerating+myotubes+following+transplantation+of+muscles+in+young+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats.</a> Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).</li>
<li>Kuang, S., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+biology+of+satellite+cells+and+their+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential.</a> Trends Mol. Med. 14 (2), 82(2008).</li>
<li>Hoffman, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dystrophin+in+muscle-biopsy+specimens+from+patients+with+Duchenne%27s+or+Becker%27s+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy.</a> N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).</li>
<li>Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+validation+of+improved+triple+fusion+reporter+gene+vectors+for+molecular+imaging+of+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects.</a> Cancer Res. 67 (7), 3085(2007).</li>
<li>Ray, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tri-fusion+multimodality+reporter+gene+expression+in+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects.</a> Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).</li>
<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+living+subjects%3A+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+lights%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li>
<li>Sicinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+muscular+dystrophy+in+the+mdx+mouse%3A+a+point+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation.</a> Science. 244, 1578-1580 (1989).</li>
<li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMattson%2C+MP+%22Pathogenesis+of+neurodegenerative+disorders.+In%3A+Contemporary+neuroscience%22">Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience</a>. X, Humana. Totowa, NJ. 294(2001).</li>
<li>Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regeneration+in+hind+limb+skeletal+muscle+of+the+mdx+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).</li>
</ol>

סופרים אין לי מה לחשוף.

במחקר זה, שתארנו הדמיה, גישה מולקולרית מהירה ואמינה לגן כתב הלא פולשני myoblasts היעד / MPCs לאחר השתלה. בעוד מחקר זה מדגים את הלוקליזציה לטווח קצר של MPCs המושתל באמצעות bioluminescense הדמיה (BLI), אופן שבו תאים ממוקדים יכול, למעשה, להיות מיושם בקלות להערכת אורך של engraftment תא, באמצעות השתלה של תאים שמבטאים יציבות גן הכתב. לשם כך, הקבוצה שלנו נוצרה קווי עכבר מהונדסים כי נמל גן הכתב האחיד. רק תאים המבטאים את גן הכתב להתחמצן D-luciferin לייצר פוטונים להדמיה בא...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> C2C12 myoblasts </td><td> ATCC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> הבינוני של Dulbecco השינוי של הנשר </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 12800-017 </td><td></td></tr><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 12483020 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25% טריפסין-EDTA </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 25200-72 </td><td></td></tr><tr><td> תמיסת מלח מאוזנת הנקס </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> H6648 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> ניקון אקליפס TE2000-5 </td><td> ניקון מכשירים בע&quot;מ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xenolight D-luciferin </td><td> PerkinElmer </td><td> 122796 </td><td> 40 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב PBS </td></tr></tbody></table>

מולקולרית והדמיה ליעד בתאים שריר מושתלים

Molecular Imaging to Target Transplanted Muscle Progenitor Cells

ניוון שרירים דושנו (DMD) הוא מחל תוקפת גנטית חמורה המשפיעה על 1 ב 3500 בנים, ומתאפיין בניוון מתקדם שרירי 1, 2. בחולים, את היכולת של תאי שריר לווין תושבים (SCS) להתחדש myofibers הפגוע הופכת יותר ויותר יעילה 4. לכן, השתלה של תאי שריר (progenitor MPCs) / myoblasts מנבדקים בריאים היא גישה טיפולית מבטיחה לDMD. מגבלה עיקרית לשימוש בטיפול בתאי גזע, לעומת זאת, היא מחסור בטכנולוגיות הדמיה אמינות לניטור ארוך טווח של תאים מושתלים, ולהערכה האפקטיבית שלו. כאן, אנו מתארים גישה לא פולשנית, בזמן אמת כדי להעריך את ההצלחה של השתלה והיצמדות. שיטה זו מנצלת את גן כתב היתוך מאוחד המורכב של גנים (הגחלילית לוציפראז [fluc], חלבון פלואורסצנטי monomeric האדום [mrfp] וsr39 קינאז תימידין [sr39tk]) expression ניתן הדמיה בשיטות שונות הדמיה 9, 10. מגוון של שיטות הדמיה, כולל טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET), טומוגרפיה ממוחשבת פליטת פוטון יחיד (SPECT), דימות תהודה מגנטיות (MRI), דימות אופטי, ותדירות גבוהה 3D-אולטרסאונד זמין כעת, כל אחד עם יתרונותיו ומגבלות ייחודיים 11. פליטת אור הדמית מחקרים (BLI), למשל, יש את היתרון של להיות עלות נמוכה יחסית ותפוקה גבוהה. זה מסיבה זו, במחקר זה, אנו עושים שימוש ברצף גחלילית לוציפראז (fluc) כתב הגן הכלול בתוך גן ההיתוך והדמית פליטת אור (BLI) ללוקליזציה לטווח קצר של C2C12 myoblasts קיימא בעקבות השתלה לעכבר מודל של DMD (ניוון שרירים על כרומוזום X [MDX] עכבר) 12-14. חשוב לציין, BLI מספק לנו אמצעים לבחון את הקינטיקה של MPCs כותרת פוסט השתלה, ויהיה שימושי כדי לעקוב אחר תאים שוב ושוב על tIME וההגירה הבאה. גישת גן כתבנו נוסף מאפשרת לנו למזג שיטות הדמיה מרובות בחי נושא יחיד; קבל טומוגרפית הטבע, ברזולוציה מרחבית מצוינת ויכולת בהיקף של עד חיות ובני אדם 10,11 גדולות, PET יהווה את הבסיס למחקר עתידי שאנחנו מציע עשויה להקל תרגום מהיר של שיטות שפותחו בתאים למודלים פרה וליישומים קליניים.

על 50-60% confluency, C2C12 myoblasts היה transfected זמנית עם גן כתב ההיתוך הנ&quot;ל לבנות מורכב מגחלילית לוציפראז [fluc], monomeric אדום ניאון חלבון [mrfp] וsr39 תימידין קינאז [sr39tk] (איור 1 א). יעילות transfection חושבה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (האיורים 1B, C), תוך שימוש ברצף mrfp בכתב שלנו לבנות. שרידות תא לא הושפע על ידי תיוג עם מצע BLI, D-luciferin (1D איור). בעקבות transfection, כ...

אמצעי לא פולשני להערכת ההצלחה של השתלה והיצמדות מתואר. השיטה מנצלת את גן כתב היתוך מאוחד המורכבים של גנים אשר ביטוי ניתן הדמיה בשיטות הדמיה שונות. הנה, אנחנו עושים שימוש ב<em&gt; Fluc</em&gt; רצף גן הכתב למקד את התאים באמצעות הדמית פליטת אור.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך באופן לא פולשני את הצלחת השתלת מיובלסט באמצעות גישת גן מדווח והדמיה ביולומינסנציה. זה מושג על ידי החדרת הגן המדווח על היתוך משולש המבטא f Luke, MRFP ו-SR 3 90 tk תחת שליטת מקדם ה-CMV לתוך קו התאים האלמותי C two C 12 myoblast. השלב השני הוא לכמת את מספר המיובלסטים המבטאים את גן הפורטר.במחקר זה, יעילות הטרנספקציה מחושבת על ידי ספירת תאים המבטאים MRFP במיקרוסקופ פלואורסצנטי. 10 עד חמשת התאים המהונדסים הבאים בנפח השווה או פחות מ-15 מיקרוליטר מושתלים תוך שרירית בגפה האחורית של עכברי MDX דיסטרופיים. תאים שעברו טרנספטציה של UNT מושתלים בגפה האחורית הנגדית כבקרה, ואז מבוצעת סריקה בסיסית.השלב האחרון הוא הזרקה תוך-צפקית, הזרקת מצע הגן לוציפר שדווח על ידי לוק לאחר תקופת קליטה של כ-20 דקות, ביצוע סריקה ביולוגית שנייה כדי לקבל תמונה של תאים מושתלים. בסופו של דבר, ספיגת לוציפר נצפית במיוחד בתאים המבטאים את לוק ללא ביולומינסנציה ניתנת לזיהוי בתאי ביקורת שאינם מבטאים את גן הדיווח. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום טכנולוגיית העברת אובדן קל כגון נדידת תאים לאחר ההשתלה, כמו גם הישרדות התאים לאחר ההשתלה.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות שרירים כגון ניוון שרירים דושן מכיוון שמדובר באמצעי מהיר ואמין להתמקדות לא פולשנית בתאים לאחר ההשתלה, אנו יכולים להעריך את האזור המושתל לאורך זמן ולהעריך את הצלחת או כישלון הטיפול. ידגימו את ההליך קלי בטן פה, סטודנטית לתואר שני, ורבקה מק"ג, טכנאית מחקר מהמעבדה שלנו, סליחה, תרבית C שני מיובלסטים C 12 במדיום נשרים שהשתנה עם 10% סרום בקר עוברי על פי נהלים סטנדרטיים לקו תאים זה. אל תאפשר לתאים להפוך ליותר מ-80% מתכנסים מכיוון שהדבר ידלדל את האוכלוסייה המיוטית.כדי להכין את התאים לטרנספקציה תחילה, קצרו את התאים מבקבוק המלאי על ידי כיסוי קצר של שכבת תאי השטיפה של HBSS בטריפסין. לאחר מכן שואבים במהירות את הטריפסין ומניחים את הבקבוק בחממת תרבית הרקמה למשך חמש דקות. במהלך הדגירה הכינו שתי צלוחיות T 75 שכל אחת מהן מכילה תשעה מיליליטר של מדיום תרבית.בסיום זמן הדגירה, הוסיפו 10 מיליליטר מדיה לבקבוק ושטפו את המדיה על תחתית הבקבוק ארבע עד חמש פעמים כדי להבטיח איסוף של כל התאים. לאחר מכן זרע כל אחת מצלוחיות ה-T 75 עם עשירית מתרחף התא מבקבוק ה-T 75. כאשר מנסים לראשונה הליך זה, ערכו בדיקת MTT כדי להעריך את ההשפעה של תיוג תאים על הישרדות התאים והתמיינות והכדאיות של מיובלסטים מהונדסים לפני ההשתלה.לאחר שהתאים הגיעו למפגש של 50%, יש להעביר בקבוק T 75 אחד עם 36 מיקרוגרם של הגן CMV Tri fusion reporter בנפח של 4.5 מיליליטר של אופטימום באמצעות ליפופקטמין 2000 בהתאם להוראות היצרן. בנוסף, בצע טרנספקציה מדומה של בקבוק ה-T 75 השני באמצעות ליפו 2000 בלבד ואופטימלי ללא DNA כבקרה שלילית. אפשר לתאים לעבור לפחות 20 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למחרת, שאב את מדיום הטרנספקציה והחלף בנפח המתאים של אמצעי תרבית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.צלם תמונות פלואורסצנטיות בעלות שדה בהיר ואדום כדי לחשב את יעילות הטרנספקציה. לאחר קצירת המיובלסט שעבר טרנספטציה על ידי טריפסין ו-resus תוך השעיית התאים בארבעה מיליליטר של מדיום שלם, השתמש בציטומטר המו כדי לבצע ספירת תאים. פיפטה 10 לששת התאים לתוך צינור מיקרו סטרילי של 1.5 מיליליטר עם יעילות טרנספקציה של כ-10%מספר תאים זה אמור להוליד 100,000 מערכי לוציפר הניתנים לזיהוי המבטאים תאים לאחר ההשתלה, נפח ההזרקה הסופי צריך להיות 15 מיקרוליטר.אם הנפח בצינור גדול מזה, אז צנטריפוגה את צינורות המיקרו ב -2000 סל"ד למשך דקה אחת, אסאט את הסופינט ואז ראוס מתכופף בנפח מרבי של 15 מיקרוליטר צמיחה. בינוני חסר FBS לאחר השראת הרדמה בעכבר באמצעות מתג פלואור של 2% ל-1.5% פלואור לתחזוקת הרדמה. במהלך ההליך, הנח את העכבר במצב שכיבה ומרוט את השיער מאזור הגפה האחורית הגבית.ודא שהמיובלסטים C שני C 12 תלויים היטב, ולאחר מכן טען את תרחיף התא למזרק אינסולין. הזרקו את התאים ישירות לראש הצדדי של שריר הגסטרו בזווית של 30 מעלות. לאחר הזרקת מיובלסטים שעברו טרנספטציה לגפה האחורית הימנית, חזור על ההליך עם מיובלסטים שעברו טרנספטציה של UNT בגפה האחורית הנגדית.בצע סריקת ביולומינסנציה בסיסית. אדם אחד צריך להעביר במהירות את העכבר לבמה בסורק האופטי ולהניח את העכבר במצב נוטה. אדם שני מחבר בו זמנית את קו ההרדמה כדי להבטיח שהעכבר יישאר מורדם.האריכו בעדינות את הגפיים האחוריות והשתמשו בסרט רפואי כדי להחזיק את הגפה במקומה כך ששני אזורי ההזרקה יהיו גלויים. סגור את התא וודא שאף אור לא יכול לגשת לחלק הפנימי של הסורק מכיוון שהדבר יגדיל את אות הרקע שזוהה. יש לכוון את הסורק לפרמטרים הכלולים בהוראות היצרן להדמיית ביולומינסנציה.צייר אזור עניין סביב האזור המוזרק שנקטף והתחל את הסריקה כדי לקבל את תמונת הבסיס בזמן שהעכבר מורדם. תוך-צפק. הזרקו 150 מיליגרם לק"ג של מצע לוציפראז גחלילית לוציפר. הכניסו את העכבר לכלוב נקי ואפשרו לו להתאושש מההרדמה.אפשר תקופת קליטה של 15 דקות לפני הכנת העכבר לסריקה הבאה. לאחר תקופת הקליטה של 15 דקות. הרדמו את העכבר והעבירו לסורק כמו קודם.בצע סריקת זוהר שנייה באותו אופן כמו סריקת הרקע. תקופת הקליטה הכוללת של 20 דקות אמורה לספק עוצמת אות מקסימלית, אך ניתן לבצע סריקה לאחר מכן במידת הצורך. סכימה זו מציגה את מבנה הכתב CMV Tri Fusion.הפאנל השמאלי מציג את תמונת השדה הבהיר של C שני מיובלסטים C 12 שהועברו עם פלסמיד מדווח ההיתוך, והפאנל הימני מציג את אותו אזור כמו תמונת פלואורסצנטיות כפי שניתן לראות כאן. אזור עניין נמשך כדי לסגור את אזור הגפה האחורית המרוט שבו הוזרקו מיובלסטים. ביולומינסנציה אינה מזוהה במהלך סריקת רקע.23 דקות לאחר הזרקת לוציפריאן, מזוהה אות ברור מהגפה האחורית הימנית שבה הוזרקו לוציפראז המבטא מיובלסטים. לא זוהה ביולומינסנציה בגפה האחורית הנגדית שהוזרקה עם מיובלסטים לא כרותים כפי שנראה. כאן אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדן לוציפראז גחלילית מאשרת השתלה תוך שרירית של שני תאי C 12 שעברו טרנספטציה.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בטכניקות תרבית רקמה אספטיות ובשיטות טיפול מתאימות בבעלי חיים לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחלות השרירים לחקור את היעילות של טיפול תאי לעת עתה במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים קטנים של מחלה. ואז מאוחר יותר במסגרת הקלינית בחולים, לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להשתיל תאים וכיצד למקם באופן לא פולשני מיובלסטים מושתלים מהונדסים באמצעות הדמיית ביו לומינסנציה.

molecular-imaging-to-target-transplanted-muscle-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מעקב דינמיקה של engraftment שריר בבעלי חיים קטנים על ידי In vivo פלורסנט הדמיה

מאמר זה מתאר רצף של אירועים אופטימיזציה עבור דימות multimodal של שתלי הסלולר מכרסם במוח באמצעות: (i) ביולומינציה vivo ו הדמיה באמצעות תהודה מגנטית, ו (ב) הודעה מורטם ניתוח היסטולוגית. השילוב בין שיטות הדמיה על חיה אחת מאפשר הערכה שתל נייד עם רגישות גבוהה רזולוציה, וספציפיות.

Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

המוני רקמות מורכבים, מאיברים לגידולים, מורכבים מאלמנטים הסלולר שונים. אנו הובהר התרומה של פנוטיפים הסלולר בתוך רקמת ניצול עכברים הטרנסגניים ניאון רב שכותרתו בשילוב עם מכתים immunofluorescent multiparameter אחרי unmixing רפאים לפענח מוצא תא, כמו גם מאפייני תא המבוססים על ביטוי חלבון.

כמותיים Multispectral ניתוח בעקבות השתלת רקמות פלורסנט וליזואליזציה של מקורות ניידים, סוגים, ואינטראקציות

תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים (iPSC) שמקורם באבות מיוגניים מבטיחים מועמדים לאסטרטגיות טיפול בתאים לטיפול בדיסטרופיות שרירים. פרוטוקול זה מתאר השתלות ומדידות תפקודיות הנדרשות כדי להעריך את החריטה והבידול של מזואנגיובלסטים שמקורם ב- iPSC (סוג של אבות שרירים) במודלים של עכברים של התחדשות שרירים חריפה וכרונית.

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

אנו מתארים את השיטה של ​​תאי גזע תכנות לביטוי יתר גורמים טיפוליים לאנגיוגנזה באמצעות חלקיקים פולימריים מתכלים. תהליכים שתוארו כוללים סינתזת פולימר, transfecting בתאי גזע שמקורם בשומן במבחנה, ומאמת את היעילות של תאי גזע מתוכנתים לקדם אנגיוגנזה במודל איסכמיה hindlimb עכברי.

תאי גזע תכנות טיפולי אנגיוגנזה שימוש אורגניים פולימריים חלקיקים

הבידוד והתרבות של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין שקטים, אוכלוסיית תאי גזע שריר, הוא חיוני להבנה של ביולוגיה שרירים תאי גזע והתחדשות, כמו גם בתאי גזע להשתלה עבור טיפולים בניוון שרירים ומחלות ניווניות אחרות.

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

פרוטוקול זה מתאר תיוג רדיו של תאי גזע מזנכימליים של סוסים והשתלתם בפגיעות גידים בסוס על מנת לקבוע את הישרדות התאים ואת התפלגות הרקמות באמצעות סינטיגרפיה גמא.

In vivo ההדמיה ומעקב של טכנציום-99m תווית תאי גזע מח העצם mesenchymal בסוסי Tendinopathy

כאן נשתמש זוהרים, רנטגן, והדמיה פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה/שחושב טומוגרפיה ללמוד איך מעכבים פעילות mTOR משפיעה על engrafted-מח עצם מיאלומה גידולים במודל xenograft. דבר זה מאפשר ניתוחים פיזיולוגית הרלוונטיים, לא פולשנית, והן עם מודאלים מרובים של מיאלומה נגד ההשפעה של טיפולים מיקוד engrafted מח עצם מיאלומה גידולים ויוו.

הדמיה עם מודאלים מרובים זוהרים, פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה/חישובית טומוגרפיה של מיאלומה נפוצה מח עצם Xenografts בעכברים ליקר ביצים

אנו מתארים את ההשתלה התוך-פרנכימלית של תאי אב עצביים אנושיים שעברו התמרות עם וקטור מדווח כפול המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק-לוציפראז (GFP) במוח העכבר. לאחר ההשתלה, אות הלוציפראז נמדד שוב ושוב באמצעות תאים מושתלים in vivo bioluminescence ותאים מושתלים המבטאים GFP שזוהו בחתכי מוח באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

השתלה תוך-מוחית ומעקב ביולומינסנציה In Vivo של תאי אב עצביים אנושיים במוח העכבר

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר זיהוי וניתוח ממדי גבוה של תאי גזע שריר ותאי אב על ידי ציטומטריית מסה של תא בודד וטיהורם על ידי FACS לצורך מחקרים מעמיקים של תפקודם. גישה זו יכולה להיות מיושמת כדי לחקור דינמיקה התחדשות במודלים של מחלות ולבדוק את היעילות של התערבויות פרמקולוגיות.

זיהוי וניתוח של אבות מיוגניים in vivo במהלך פגיעה חריפה בשרירי השלד על ידי ציטומטריית מסה חד-תאית חד-ממדית גבוהה

טיפול תאי מציע התערבות מבטיחה לפיברוזיס ריאתי על ידי שימוש בתאי אב לתיקון רקמות פגועות ושיפור תפקוד הריאות. מכיוון שהדמיה ממלאת תפקיד מרכזי במעקב אחר אינטגרציה של תאים, כאן, אנו מתארים הדמיה מונחית חלקיקים מגנטיים מעקב in vivo של טיפול תאי בפיברוזיס ריאתי במודל עכבר.

מעקב In Vivo מונחה תמונה של תאי אב אפיתל ריאה דיסטליים מושתלים לפיברוזיס ריאתי באמצעות הדמיית חלקיקים מגנטית

למדו שיטה לא פולשנית להערכת הצלחת השתלת מיובלסטים באמצעות גנים מדווחים והדמיית ביולומינסנציה בעכברי MDX דיסטרופיים. טכניקה זו מאפשרת מעקב אחר תאים מושתלים בחי.

מולקולרית והדמיה ליעד בתאים שריר מושתלים

גלה סרטונים נוספים