סימון מטבולי של רנ"א חדש עיבד לביטוי פרופיל גנטי רזולוציה גבוהה של הסינתזה רנ"א, עיבוד וריקבון בתרבית תאים

סה"כ הסלולרי RNA מספק תבנית עניים לחקר שינויים קצרי טווח בסינתזה וריקבון RNA, כמו גם את הקינטיקה של רנ"א עיבוד. כאן, אנו מתארים תיוג חילוף חומרים של RNA החדש שעבד עם 4-thiouridine אחרי biotinylation תיאול ספציפי ולטיהור של RNA החדש שעבד ומאפשר להתגבר על המגבלות האלה.

שיטה זו נועדה למדוד באופן ישיר ומדויק את הקינטיקה של עיבוד סינתזת RNA ודעיכה בתרבית תאים אוקריוטיים. התאים בנוכחות ארבעה תיאו אורידין כדי לתייג מטבולית את ה-RNA החדש שהועתק, ואז לשמן את התאים המסומנים ולטהר את ה-RNA התאי הכולל, מבצעים תרומת ביוטין ספציפית לתיול כדי לתרום באופן סלקטיבי ביו-אט, מולקולות ה-RNA החדשות שהועתקו. לאחר מכן, השתמש בחרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין כדי ללכוד את ארבעת התעתיקים המתויגים החדשים הרחק מה-RNA הקיים, שברי ה-RNA המכילים סך הכל, מתומלל חדש וללא תווית. קיים.

לאחר מכן ניתן לעבור ניתוח RNA במורד הזרם, כולל Q-R-T-P-C-R, מיקרו-מערכים או ריצוף מהדור הבא בהשוואה למחקרים על ניתוח RNA תאים כולל של תמלול חדש, RNA מספק עלייה של פי עשרה ברגישות לאיתור שינויים קצרי טווח בביטוי גנים. בשלב מסוים, הוא מאפשר מדידות מדויקות של מחצית חיים של R, ולראשונה למעשה חושף את הקינטיקה של עיבוד RND. ניתן ליישם בהצלחה תיוג מטבולי של תעתיקים מסונתזים חדשים לניתוח מנגנונים מולקולריים רגולטוריים של ביטוי גנים.

ניתן ליישם אותו גם על אורגניזמים מודלים אחרים כמו ops, oph ושמרים. התחל עם תוכנית מפורטת של הניסוי, המאפשר לפחות חמש דקות בין כל מצב. הפשירו את תווית ארבעת התיאו אורידין ממש לפני השימוש והעבירו את הכמות הנדרשת לכל מצב לתוך שפופרות בז סטריליות.

עבור כל מצב טיפול, העבירו חמישה מיליליטר של מדיום תרבית התאים מכל צלחת תרבית של 10 סנטימטר לצינור המכיל ארבעה תיופורין וערבבו היטב את המדיום הנותר מהתרביות. לאחר מכן הוסף את התווית המכילה מדיום בחזרה לתאים ודגירה למשך הזמן שהוגדר בניסוי. לאחר הסרת מדיום תרבית התאים, הוסף חמישה מיליליטר טריול לכל צלחת.

דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לליזה מלאה של תאים. שוטפים את הצלחת בזהירות עם הטריול הנוסף ומעבירים את הדגימות לצינורות פוליפרופילן, המסוגלים לעמוד בצנטריפוגה ב-13,000 גרם.לאחר מכן ניתן לאחסן את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס או להשתמש בהן מיד להכנת RNA סלולרי כולל בהתאם לפרוטוקול הטריול. התחל עם דגימות של 60 עד 80 מיקרוגרם של RNA תאי כולל לתגובת התיוג, הוסף מיקרוליטר אחד של 10 x מאגר ביוטין למיקרוגרם RNA אחד מדולל בשבעה מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז.

לאחר מכן מוסיפים שני מיקרוליטר ביוטין HPDP במיליגרם אחד למיליליטר, DMF למיקרוגרם אחד של RNA ומערבבים מיד על ידי פיפטינג. אם ביוטין משקע ניתן להגדיל את תכולת ה-DMF. הריכוז הסופי של 40% דגירה של התגובה בטמפרטורת החדר למשך 1.5 שעות בסיבוב.

לאחר מכן, הוסיפו נפח שווה של תערובת כלורופורם ודגרו במרץ במשך שתיים-שלוש דקות עד שהשלבים מתחילים להיפרד והבועות מתחילות להיעלם. צנטריפוגה את הדגימות, ואז העבירו בזהירות את השלב המימי העליון לצינור חדש. לאחר מיצוי כלורופורם שני, הוסף עשירית מנפח של חמישה נתרן כלורי מולארי ונפח שווה של איזופרופנול.

כדי לזרז את ה-RNA מכדור הפאזה המימית יש לזרז את ה-RNA על ידי צנטריפוגה. השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הגלולה פעם אחת בנפח שווה של 75% אתנול לאחר צנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט. סובב קצרות והסר שאריות אתנול בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר.

סובב שוב והסר שאריות אתנול עם השעיית פיפטה של 20 מיקרוליטר, ה-RNA ב-50 עד 100. מיקרוליטר מים מתערבבים היטב על ידי פיפטינג. הערך את איכות ה-RNA על ידי אלקטרופורזה כדי לא לכלול פירוק RNA.

אזנו שלושה מיליליטר של מאגר כביסה לדגימה ל 65 מעלות צלזיוס באמבט מים. כמו כן, דנטורציה של דגימות ה-RNA הביוטיניליות ב-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ואז מניחים מיד על קרח.

מקם את עמודות המיקרום מקסימום במעמד המגנטי. יש לאזן מראש את עמודי Milton e עם מאגר כביסה בטמפרטורת החדר של מיליליטר. בינתיים, הוסיפו 100 מיקרוליטר של חרוזי סטרפטווידין ל-RNA הביוטיני ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות בסיבוב.

אם אחד מהעמודים לא התחיל להתנקז, לחץ בעדינות על החלק העליון של העמוד באצבע עטויה כפפה. ברגע שהזרימה מתחילה, העמודים מתנקזים בקלות, מרחו את תערובות חרוזי ה-RNA על העמודים. אם יש לנתח את ה- RNA ללא התווית, אסוף את הזרימה דרך שבר RNA ללא תווית, ואז שטוף שלוש פעמים עם 0.9 מיליליטר של מאגר כביסה של 65 מעלות צלזיוס, ואחריו שלוש פעמים עם מאגר כביסה סביבתי של 0.9 מיליליטר.

לאחר מכן, פיפטה 700 מיקרוליטר חוצצת RLT לתוך שני צינורות מיליליטר חדשים ומניחה אותם מתחת לעמודים. הוסף 100 מיקרוליטר של DTT טרי של 100 מילימולר לעמודות כדי לחסל את ה-RNA המתועתק החדש למאגר ה-RLT. לאחר שלוש דקות, הוסף עוד 100 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי DTT לעמודה ואסוף את ה-EENT לאותו צינור.

המשך עם פרוטוקול ניקוי השלל המיני הקל של RN כמתואר על ידי היצרנים בהוראות, הוסף 25 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז לעמוד והכניס את העמודים בצינורות לצנטריפוגה. לאחר סיבוב של דקה אחת, הסר את העמודות מהצינורות וקבע את ריכוזי ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר ננו טיפות. שים לב שמדידות פוטומטריות ספקטרום של RNA מתומלל לאחרונה אינן אמינות במיוחד ונוטות להעריך יתר על המידה את תכולת ה-RNA בפועל.

כדי למנוע את הצורך להפשיר ולהקפיא מחדש RNA לפני הגשתו לבדיקת תפוקה גבוהה, אנו ממליצים להכין CDNA מיד לאחר טיהור ה-RNA החדש שתועתק. השתמש ב-2.5 מיקרוליטר של תבנית ה-RNA המתומללת החדשה בתגובת סינתזה של CDNA של 20 מיקרוליטר בהתאם להוראות היצרן. לדלל דגימות CD NA 1 עד 10 ולנתח חמישה מיקרוליטרים של דילול CD NA על ידי Q-R-T-P-C-R.

אחסן את דגימות ה-CD NA במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי לקבוע את ריכוז ה-SU המינימלי הנדרש לשחזור יעיל של RNA מתומלל חדש לטהר את ה-RNA המתומלל החדש לאחר תיוג ארבעה SU עם ריכוזים הולכים וגדלים של ארבעה SU ומנותח על ידי אלקטרופורזה. הנה. ההתאוששות של RNA משועתק חדש שסומן במשך שעה אחת בפיברובלסטים אנושיים ראשוניים גדל באופן משמעותי מ-50 ל-200 מיקרו-מולרי ארבע סו, אך לאחר מכן החל להתייצב. לחלופין, מדוד את שילוב ארבעת ה-SU על ידי ניתוח כתמי נקודות על ה-RNA הביוטיני באמצעות מצומד פרוקסידאז חזרת סטרפטווידין.

יעילות הביוטין של ביוטין. HPDP נמוך בערך פי שלושה מזה של אוטו אצטיל ביוטין. לפיכך, אחת מכל שלוש ארבע שאריות סו תומלל לאחרונה.

RNA הוא למעשה ביוטינילציה על ידי ביוטין HPDP. ניתן לכמת את עוצמות האות גם על ידי השוואה לבקרה הביוטינילית. שחזור אוליגוס DNA של RNA משועתק לאחרונה הוא כמותי ביותר.

נתונים אלה שמקורם ב-Agilent Bioanalyzer מראים כי ה-RNA המתועתק החדש מכיל כמויות גדולות משמעותית של תעתיקים גדולים לא משועבדים. לבסוף, ניתן אפילו לכמת ישירות את שיעורי השילוב של ארבעה su ב-RNA משועתק לאחרונה על ידי ניתוח פוטומטרי ספקטרה. זה דורש זירוז ה-RNA החדש עם גליקוגן ואיזופרופנול ואתנול.

השיא הנוסף ב-330 ננומטר משקף את קצב השילוב של ארבעה SU ב-RNA המתועתק החדש. אל תשכח שעבודה עם טריל יכולה להיות מסוכנת ביותר. אז תרופת נגד לעצמות פנול המורכבת מפוליאתילן גליקול 300 מעורבב עם משקאות חריפים מתיליים תעשייתיים, 70 עד 30 צריכה להיות זמינה.

אז לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתייג ולטהר RNA מתומלל חדש, שבסך הכל ייקח לך כשמונה שעות עבור שש עד 12 דגימות.