Electroporation האזור Subventricular ילודים

מטרת הליך זה היא לתייג ולתפעל גנטית את המרכיבים המולקולריים של תאי גזע עצביים באזור תת-חדרי. זה מושג על ידי החדרת פיפטת זכוכית עמוסה ב- DNA לחדר הצדדי של P zero P.השלב השני הוא הוצאת DNA לנוזל עמוד השדרה המוחי של החדר הרוחבי. הזרם הבא מוחל על ה-P.זה מאפשר העברת DNA לתאי גזע עצביים המצפים את החדרים הצדדיים.

בסופו של דבר, שילוב של טכניקות מולקולריות, כולל אימונוהיסטוכימיה, ביולוגיה מולקולרית, מיקרוסקופיה ואלקטרופיזיולוגיה, משמשים להמחשת שינויים בגורל, התפשטות, נדידה והתבגרות של תאי גזע עצביים באזור תת-חדרי. אלקטרופורציה של אזור תת-חדרי בילודים יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוגנזה, כגון אילו מסלולים מולקולריים אחראים לוויסות ההתפשטות, ההתמיינות, הנדידה וההתבגרות של תאי גזע עצביים וצאצאיהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון עכברים טרנסגניים, הוא שהיא מאפשרת תיוג מהיר וחזק של תאי גזע נוירונים של SVZ בצורה חסכונית בזמן וחסכונית.

ראשית, ודא שה-DNA ל-electro purate הוא בעל טוהר וריכוז גבוהים ונטול אנדוטוקסין. משוך צינורות נימי זכוכית סיליקה BO מלוטשים באש של 10 סנטימטר לתוך פיפטות. כאן משתמשים בחולץ פיפטות PP 8 30 ghhi PC 10 המוגדר למשיכת משיכה משוקללת בצעד אחד ב-70.5 מעלות צלזיוס לאחר משיכת הפיפטה, השתמש במלקחיים עגולים כדי לשבור את הקצה.

לאחר מכן בדוק את הפיפטה תחת מיקרוסקופ מנתח כדי לוודא שאין קצוות משוננים. במידת הצורך ניתן לשיפוע את הקצה באמצעות אבן שחיקה. לאחר מכן, הניחו את הפיפטות שנשפכו מתחת למנורת UV למשך 15 דקות.

לאחר שחלפו 15 הדקות, סמן את הפיפטה שני מילימטרים מקצה הקצה בטוש קצה עדין. לבסוף, הכינו תמיסה ירוקה מהירה של 0.1 משקל לנפח על ידי ערבוב מי מלח סטריליים מסוננים 0.9% עם הרדמה ירוקה יבשה ומהירה. גור בן אפס עד יום אחד, צלחת פטרי מזכוכית צוננה מראש לארבע מעלות צלזיוס והונחה על קרח מערבי לאחר כחמש דקות, קבע את מצב ההרדמה על ידי שימוש בתגובת צביטת כף הרגל.

אם לא מתרחשת תנועה, התחל בהזרקה תוך חדרית. שלבו את התמיסה הירוקה המהירה עם תמיסת ה-DNA והעבירו 1-2 מיקרוליטר לביופילם. חשוב שזה ייעשה ממש לפני ההזרקה שכן השילוב של תמיסה ירוקה מהירה עם DNA יכול לגרום לאידוי והתגבשות מהירים עם חסימה לאחר מכן של פיפטות זכוכית, לשאוב את כל נפח האליקוט עם מזרק מיקרופילם ולהעמיס את פיפטת הזכוכית על מזרק בלחץ אוויר.

כעת, אחזו בעדינות והחזיקו את ראש הגור בין האגודל לאצבע המורה של היד הדומיננטית האחרונה. לאחר מכן הדליקו את המנורה והחזיקו את ראש הגור ממש מחוץ לאלומת האור. אם החדרים אינם נראים בבירור, הרטיבו את הראש במי מלח סטריליים כדי לסייע בהפחתת כמות האור המוחזרת מהקרקפת.

לאחר מכן, בעזרת היד הדומיננטית, הכנס את המחט לחדר הצדדי הסמוך. מקום ההזרקה צריך להיות במרחק שווה בערך מתפר ה-OID והעין, ושני מילימטרים לרוחב לתפר הסגיטלי. הכנס את הפיפטה הנמשכת לסימון שני המילימטר לקבלת פופ P אפס, מה שאמור להבטיח חדירה לחדר הרוחבי.

מילוי חוזר של CSF לתוך הפיפטה עלול להתרחש עקב שחרור לחץ תוך גולגולתי. אם זה קורה, שחרר את האחיזה בראש ה-POP כדי להפחית את הלחץ ולסייע בהזרקת הפלסמיד. לאחר החדרת הפיפטה בצורה אופטימלית, הזרקו כ- 0.5 מיקרוליטר פלסמיד לחדר הרוחבי.

הגדר את המתח של מחולל הפעולה החשמלית לחמישה פולסים מרובעים, 50 אלפיות השנייה לכל דופק ו-100 וולט במרווחים של 50 אלפיות השנייה. הספציפיות המרחבית של פעולת אלקטרו פלזמה ניתנת על ידי כיוון העברת המטען, ולכן יש לתת שיקול מרחבי למיקום האלקטרודות בהתחשב במידת המגוונים של התאים של ה-SVZ. אנשים דיווחו על שינויים במונחים של גורל התאים והתפשטות בגב הגחון למיקומי CAU.

לאחר הזרקת טבילת הפלסמיד, אלקטרודות הפינצטה לתוך PBS כדי למקסם את העברת המטען ולסייע במניעת כוויות הנגרמות על ידי התנגדות. לאחר מכן, הנח את האלקטרודה החיובית על הדופן הצדדית הגבית של הגולגולת ליד האוזן וטבל את הרוחב להזרקת הציטופלזמה. לאחר מכן הנח את האלקטרודה השלילית על הגחון של חצי הכדור הנגדי לרוחב חוטם הפוץ.

איור זה מציג את הכיוון הנכון של אלקטרודות שליליות וחיוביות ביחס לציר x, y, Z על הגור המוזרק. התחל העברת זרם על ידי לחיצה על דוושת מתג רגל הדופק וטאטא את האלקטרודות מהגב לרוחב באמצעות מרווחי זווית של כ-25 מעלות. לאחר השלמת האלקטרופורציה, הניחו את כל הגורים האלקטרופורטים על כרית חימום למשך חמש דקות.

סובב בעדינות את הגורים כל 30 שניות עם גירוי עדין. תמונה זו מציגה את החדר הצדדי של עכבר יילוד 24 שעות לאחר אלקטרופורציה של וקטור קידוד EGFP. התאים המדורגים אלקטרו זוהרים בירוק.

כאן אנו רואים את החדר הצדדי המסומן LV 28 יום לאחר אלקטרופורציה של Cree Recombinase ו- GFP המקודד פלסמידים לעכברים הנושאים קוד עצירה במעלה הזרם של רקומבינציה של עגבניות TD גורמת לביטוי של עגבניות TD הנראות באדום, דילול עוקב של פלסמיד וכתוצאה מכך מעט תאי SVZ חיוביים ל- EGFP או עגבנייה TD באה לידי ביטוי גנומי מתבטאת לצמיתות. דילול הפלסמיד, ה-DNA המוצג בירוק ניכר בהתחשב בכך שתאים נוספים בשכבת תאי הגרגיר של נורת הריח המסומנת OB, ביטאו את הסמן הגנומי TD עגבנייה המוצגת באדום. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתייג ולתפעל תאי גזע מה-SVZ.