Name: הכנת כרומוזום מתאים בתרבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: למדו הכנת כרומוזומים מתאים חי לצורך בדיקות ציטוגנטיות מולקולריות ו-G-banding. השיטה כוללת שימוש בתמיסה היפוטונית ופיקסטיב, ומתאימה לתאי לימפוציטים ופיברובלסטים עור אנושיים ומכרסמים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה המתוארת בכתב היד הזה התאפשרה על ידי מימון מקרן פטריק פ טיילור.

1. קציר כרומוזום של תאים חסידים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול סטנדרטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים בהתאם לתנאי culturing התא ספציפיים. כאשר התאים הגיעו שלב לוגריתמים (confluency 80%), להוסיף 10 μl / מיליליטר של Colcemid לבקבוק תרבית תאים. מינימום של 2 x 10 6 תאים מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור במשך 45 דקות. באמצעות פיפטה סטרילית, להעביר מדיה מהתאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. מניח בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את התאים על ידי הוספת 2 מיליליטר של HBSS הצפת לתוך הבקבוק. מערבולת חיץ ולאחר מכן להסיר בעזרת פיפטה. בטל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של טריפסין, מה שמבטיח שהוא מכסה את כל פני השטח של הבקבוק. להשאיר רק את התאים בטריפסין למשך כ -2 דקות. לאחר שרוב התאים יש מנותקים, פיפטה התקשורת בצינור חרוטי חזרה אל התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את ההשעיה התא ב10 aliquots מיליליטר לתוך צינורות חרוטי 15 מיליליטר.צנטריפוגה ב XG 200 10 דקות. הסר supernatant ו resuspend את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של 0.075 M KCl אשר כבר prewarmed ל37 ° C עד גלולה שנותרה בצינור חרוטי. צינור וורטקס במהירות בינונית לערבב KCl ותאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות ב25 ° C. הסר supernatant (עד כ 0.5 מיליליטר שרידים) וגלול resuspend. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף 5 מיליליטר של המקבע של Carnoy הטרי (3:1 יחס של מתנול: חומצה אצטית קרחונית) לתאים תוך vortexing. לאחר מכן להוסיף 5 מיליליטר יותר מקבע בלי vortexing עבור סכום כולל של 10 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 200 למשך 5 דקות. הסרת תאי supernatant ו resuspend. הוסף 5 מיליליטר של מקבע לצינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 200 למשך 5 דקות. הסרת תאי supernatant ו resuspend. הוסף 5 מיליליטר של מקבע לצינור אחד. כעת ניתן לאחסן את התאים ב4 מעלות צלזיוס למשך עד שנה אחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי לפרוטוקול: harvesti כרומוזוםננוגרם של שורות תאי lymphoblastoid <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים בהתאם לתנאי culturing התא ספציפיים. (שימוש בבקבוקון מתאים לכמות של תאים בתרבית). כאשר התאים הגיעו שלב לוגריתמים (כ 2 ימים לאחר התאים מפוצלים), להוסיף 10 μl / מיליליטר של Colcemid לבקבוק תרבית תאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי לפרוטוקול: קצירת כרומוזום מכל דם Phytohemagglutinin (PHA), לקטינים הנגזרים משעועית הכליה האדומה, הוא mitogen עוצמה לתאי T אנושיים 16. 72 שעות לאחר התוספת של PHA לתרבות, על 45% מתאים נמצאים בשלב S. זה מייצג את הפעילות המיטוטי שיא, והוא הנקודה האופטימלית שבו למסוק ללימודי כרומוזום. mitogens אחרת כגון פיטולקה (1-10 מיקרוגרם / מיליליטר) ניתן להשתמש בו בעת ניתוח תאי B 17,18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף לפחות 1 מיליליטר של דם מלא בצינור הפרין סודיום העליון ירוק. השתמש בתוך 3 ימים לאחר גבייה. דם חנות ב RT בלתיtil מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 0.25 מיליליטר של דם מלא ב10 מיליליטר של מדיה מלאה RPMI המכילה L-גלוטמין (20% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, fungizone 1%, וPHA 1%). תרבות על 37 ° C עם 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי לפרוטוקול: קצירת כרומוזום ממח העצם ניתוח ציטוגנטית במח עצם הוא מועיל בפרעות המטולוגיות ממאירות רבות כתצפית של שיבוט chromosomally חריג עשויה להיות אבחון לסוג מסוים של סרטן דם. מחקרי כרומוזום משמשים גם כדי להעריך את התקדמות מחלה, כגון תחילת משבר פיצוץ ותגובה לטיפול. מכיוון שתאי מח העצם באופן פעיל בחלוקה, לא גירוי mitogen הוא 9,19 צורך. לוקמיה חריפה 24 ו48 תרבויות שעה גם להגדיר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף לפחות 1 מיליליטר של מח עצם בצינור הפרין סודיום העליון ירוק. Aliquot 0.25 מיליליטר של מח עצם ב10 מיליליטר של מדיה מלאה RPMI המכילה L-גלוטמין (20% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, fungizone 1%). תרבות על 37 ° C עם 5% CO 2. </li></ol></li></ol> 2. שקופיות הכנה ומכתים מוצק הערכה מהירה של שקופית אחת נציג תספק מידע על איכות היבול לפני שתמשיך להליכים נוספים כגון G-banding, FISH, CGH, או SKY. מעבדות שמעדיפות כתם מוצק התאים לקציר מהיר והערכת כרומוזום. לחלופין, מיקרוסקופ לעומת שלב ניתן להשתמש בניתוח זה. שקופיות מוכנות הטובים ביותר כאשר הלחות היא כ 50% וסביבת הטמפרטורה (20-25 ° C). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות ב25 ° C. הסר את supernatant עד שרק 0.3-0.5 מיליליטר שרידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בעדינות resuspending גלולה, שלוש טיפות פיפטה של ​​ההשעיה התא ממרחק של כ 2 בשקופית אשר נטויה בזווית של כ 45 ° ולאפשר ההשעיהלגלגל על ​​פני השקופית. הוסף טיפה אחת גדולה של המקבע של Carnoy הטרי לשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את הגב של השקופית על מגבת נייר ולאחר מכן לשבת השקופיות לייבוש לפחות 10 דקות. השקופית צריכה להיות יבשה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טרי Giemsa מכתים פתרון (3:1 יחס Gurr הצפת וGiemsa הכתם). מניחים את השקופיות על מדף מכתים. לכסות את השקופית כולה בפתרון מכתים Giemsa. בואו השקופיות יישארו בפתרון מכתים למשך 5 דקות. יש לשטוף את השקופיות עם מים מזוקקים, לטמיון, ולאפשר לאוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 טיפות של Permount ולהחליק את מכסה לשקופית. ודא שאין בועות מתחת coverslip. Permount העודף ניתן להסיר עם מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את התאים עם מיקרוסקופ אור בהגדלה 10X ו100X. אם תאי metaphase נמצאים בשפע וגם התפשטות, השקופיות שנותרו יכולות לשמש לפרוצדורות אחרות. </li></ol> 3. G-Banding באמצעות טריפסין וGiemsa (GTG) &lt;p&gt; טריפסין הוא אנזים פרוטאוליטי הdenatures ההיסטונים euchromatic באזורי DNA עם פעילות תעתיק גבוהה יותר וכתוצאה מכך. בעקבות צביעת Giemsa, אזורים אלה יופיעו כלהקות אור. הכרומטין מרוכז מאוד עם פעילות מועטת או לא תעתיק (heterochromatin) יהיה חלק גדול של ההיסטונים המוגנים מפני טריפסין ולכן כתם כהה הבא מכתים Giemsa. זה חיוני כדי תחילה G-band שקופית אחת כדי לפקח על התנאים ולהתאים את עיתוי טריפסין במידת צורך לשקופיות שלאחר מכן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את הפתרונות הבאים ל4 צנצנות Coplin. # צנצנת 1 = 30 מיליליטר של 1x HBSS ו4 מיליליטר של 10x טריפסין (0.5%) # צנצנת 2 = 50 מיליליטר של 1x HBSS צנצנת # 3 = 45 מיליליטר של 1x HBSS ו5 מיליליטר של סרום שור עוברי # צנצנת 4 = 50 מיליליטר של 1x HBSS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול כל שקופית בצנצנת # 1 במשך 5 שניות, שטיפה מהירה בצנצנת # 2, תעזוב את כל שקופית בצנצנת # 3 לפחות 30 שניות, שטיפה מהירה בצנצנת # 4 לאחר מכן לאפשר שקופיות לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן fresשעות Giemsa מכתים הפתרון (3:1 יחס Gurr הצפת וGiemsa הכתם). מניחים את השקופיות על מדף מכתים. לכסות את השקופית כולה בפתרון מכתים Giemsa. בואו השקופיות יישארו בפתרון מכתים למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את השקופיות במים מזוקקים באותו סדר שהם היו מוכתמים. אפשר השקופיות לייבוש במשך 10 דקות בערך. השקופית צריכה להיות יבשה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 טיפות של Permount ולהחליק את מכסה לשקופית. ודא שאין בועות מתחת coverslip. Permount העודף ניתן להסיר עם מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את התאים עם מיקרוסקופ אור בהגדלה 10X ו100X. התאם עיתוי טריפסין של שאר השקופיות המבוססות על התוצאות של השקופית הראשונה. </li></ol>

<ol><li>Driscoll, D., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+screening+for+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Prenatal screening for aneuploidy.</a> New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).</li>
<li>Nussbuam, R., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNussbuam%2C+R+%22Genetics+in+Medicine%3A+7th+Edition%22">Genetics in Medicine: 7th Edition</a>. , Saunders/Elsevier. Philadelphia. 76 (2007).</li>
<li>Ljunger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+abnormalities+in+first-trimester+miscarriages%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Obstet.+Gynecol.+Scand%22%5BJournal%5D)">Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages.</a> Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).</li>
<li>Kwinecka-Dmitri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+chromosomal+aberrations+in+material+from+abortions%5BTitle%5D)+AND+%22Ginecol.+Pol%22%5BJournal%5D)">Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions.</a> Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).</li>
<li>Reddy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stillbirth+classification%E2%80%94Developing+an+international+consensus+for+research%3A+Executive+summary+of+a+national+institute+of+child+health+and+human+development+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Stillbirth classification—Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop.</a> Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).</li>
<li>Pierpoint, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+congenital+heart+defects%3A+Current+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge.</a> Circulation. 115 (23), 3015 (2007).</li>
<li>Kaneshiro, N., Zieve, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down+Syndrome%3A+Trisomy+21.%5BTitle%5D)+AND+%22PubMed+Health%22%5BJournal%5D)">Down Syndrome: Trisomy 21.</a> PubMed Health. , (2010).</li>
<li>Cin, P. D. Current Protocols in Human Genetics. , (2003).</li>
<li>Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+in+cancer+cytogenetics+and+molecular+cytogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics.</a> Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).</li>
<li>Miura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulated+Chromosomal+Instability+in+Murine+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+Leads+to+Malignant+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation.</a> Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).</li>
<li>Izadpanah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+In+vitro+Expansion+Alters+the+Biology+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells.</a> Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).</li>
<li>Dekel-Naftali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+human+pluripotent+stem+cells+using+CGH+and+FISH+reveals+low-grade+mosaic+aneuploidy+and+a+recurrent+amplification+of+chromosome+1q%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q.</a> Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).</li>
<li>Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Improved+Technique+for+Chromosomal+Analysis+of+Human+ES+and+iPS+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev.+Rep%22%5BJournal%5D)">An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells.</a> Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).</li>
<li>Bayani, J., Squire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+banding+of+chromosomes+for+cytogenetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).</li>
<li>Speicher, M. R., Carter, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+cytogenetics%3A+blurring+the+boundaries+with+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).</li>
<li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Lymphocyte+Culture+and+Chromosome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li>
<li>Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).</li>
<li>Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarch%2C+MJ+%22The+Association+of+Genetic+Technologists+Cytogenetics+Laboratory+Manual.+San+Francisco%3A+3rd+edition%22">The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition</a>. , ACT. Houston, TX. (1997).</li>
<li>Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+studies+in+neoplastic+hematologic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22In+Clinical+Laboratory+Medicine%2C+2nd+edition%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders.</a> In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. McClatchey, K. D. , Williams & Wilkens. Baltimore. 658-685 (2002).</li>
<li>Kibe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7R%CE%B1+deficiency+in+p53%28null%29+mice+exacerbates+thymocyte+telomere+erosion+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Different%22%5BJournal%5D)">IL-7Rα deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis.</a> Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).</li>
<li>Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+features+of+a+boy+with+trisomy+of+16q22--%3Eqter+due+to+paternal+Y%3B+16+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Dysmorphol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22-->qter due to paternal Y; 16 translocation.</a> Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).</li>
<li>Tsien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+culture+of+normal+chorionic+villus+cells+yields+ICF+syndrome-like+chromatin+decondensation+and+rearrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet.+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements.</a> Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).</li>
<li>McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+conventional+cytogenetics+%28G-banding%29%2C+comparative+genomic+hybridization+%28CGH%29+and+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+%28i-FISH%29+for+the+detection+of+genomic+rearrangements+in+acute+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia.</a> J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).</li>
</ol>

יש לנו מנוצלים בהליך הנוכחי לבידוד כרומוזום מהתאים של אורגניזמים שונים, לרבות סוגים שונים של תאים המתקבלים מאדם, קופי רזוס, חולדות, עכברים ו11,20-22. הפרוטוקול הסטנדרטי מסופק, אבל צעדי מפתח מסוימים ומשתנים ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים לסוגים השונים של תאים אלה. כמה צעדים ספציפיים הם קריטיים בשני ההכנה כרומוזומליות ו-G-banding כדי להבטיח את האיכות הטובה ביותר האפשרית של התוצאות. אחד מהמשתנים אשר יכול להשפיע על assay הוא זמן הדגירה Colcemid. פחות מידי הזמן בColcemid תשואות...

ניתוח כרומוזום הוא טכניקה קונבנציונלית מנוצל ברחבי העולם כדי לאבחן חוסר יציבות כרומוזום ושחלופים שמובילות להפרעות גנטיות ו1,2,8,9 ממאירות. בנוסף, ברזולוציה גבוהה יותר לאבחון והמחקר של מומים גנטיים חוקתיים והסרטן רכשה ניתן להשיג עם השילוב של הנהלים הקלאסיים ציטוגנטית ומתודולוגיות ציטוגנטית מולקולריות כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה גנומית השוואתית (CGH) , וkaryotyping ספקטרלי (SKY) 14,15. לאחרונה, טכניקות אלה כבר נוצלו להערכה של חוסר יציבות כרומוזום קשור עם מחקר בתאי גזע. מומים Karyotypic כגון aneuploidy של תאים לטווח ארוך בתרבית עוברית (ES) ותאי גזע בוגרים של אורגניזמים שונים שדווחו על ידי מעבדות מרובות. הראיות אחרונות תומכת שבכמה שורות תאי מטבעם נוטים יותר instabi כרומוזוםlity ללא קשר לתנאי תרבות. מסיבה זו, בעת הקמת ו / או שמירה על אדם, עכבר, או שורות תאי גזע רזוס, ניתוח כרומוזום מומלץ כחלק מתהליך בקרת איכות. דיווחים רבים לתאר את העניין הגובר בשימוש בציטוגנטיקה השגרתית והמולקולרית כדי לפקח על היציבות בכרומוזומים של תאי גזע ותאים ממאירים או אורגניזמים שונים בתרבות 10-13. פרוטוקולים אלה הם יותר ויותר בשימוש על ידי מעבדות לא גנטיות להערכה כרומוזומלית מהירה של התאים בתרבית שלהם 13. אנו מציגים הנהלים הבסיסיים שלנו להכנת כרומוזום מסוגי תאים שונים, אשר יכול להיות מיושמים למטרות מחקריות וקליניות ובתאים שמקורם אורגניזמים שונים.

<table><tbody><tr><td>KaryoMAX Colcemid</td><td>Gibco</td><td>15212-012</td><td></td></tr><tr><td>HBSS Buffer</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin EDTA 10x</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>טבליות חיץ "GURR"</td><td>Gibco</td><td>10580-013</td><td></td></tr><tr><td>Geimsa Stain</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3250-16</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5810</td><td>אפנדורף</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>קלדון מעבדה כימיקלים</td><td>6700130</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>Krackeler Scientific Inc.</td><td>11-9508-05</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת כרומוזום מתאים בתרבית

Chromosome Preparation From Cultured Cells

ניתוח כרומוזום (ציטוגנטית) נמצא בשימוש נרחב לגילוי של חוסר יציבות כרומוזום. כאשר אחריו ה-G-פסים וטכניקות מולקולריות כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), יש assay זה את היכולת רבת עוצמה לניתוח תאים בודדים לסטיות שכוללות רווחים או הפסדים מחלקים של הגנום ושחלופים מעורבים כרומוזומים אחד או יותר. בבני אדם, מומים כרומוזום מתרחשים בכ 1 לכל 160 לידה חי 1,2, 60-80% מכלל הפלות 3,4, 10% מלידה מתות 2,5, 13% מאנשים עם מחלת לב מולדת 6, 3-6% מהמקרים בעיות פוריות 2, ואצל חולים רבים עם עיכוב התפתחותי ומומים מולדים 7. ניתוח ציטוגנטית של ממאירות משמש באופן שגרתי על ידי חוקרים וקלינאים, כמו תצפיות של פגמים בכרומוזומים משובטים הוכחו יש גם משמעות דיאגנוסטית ופרוגנוסטית 8,9.60; בידוד כרומוזום לא יסולא בפז עבור ריפוי גנטי ומחקר בתאי גזע של יצורים כוללים פרימטים ומכרסמים 10-13 לא אנושיים. יכולים להיות מבודדים הכרומוזומים מהתאים של רקמות חיות, ובכלל זה לימפוציטים בדם, fibroblasts עור, amniocytes, שליה, מח עצם, ודגימות גידול. כרומוזומים מנותחים בשלב metaphase של מיטוזה, כאשר הם מרוכזים ביותר, ולכן בצורה ברורה יותר לעין. הצעד הראשון של טכניקת בידוד כרומוזום כרוך השיבוש של סיבי הכישור ידי דגירה עם Colcemid, כדי למנוע את התאים מפני שתמשיך לשלב anaphase שלאחר מכן. לאחר מכן טופלו התאים עם פתרון hypotonic והשתמרו במצב הנפוח שלהם עם המקבע של Carnoy. לאחר מכן התאים נפלו על שקופיות ואז יכולים להיות מנוצל עבור מגוון רחב של נהלים. G-banding כרוך טיפול טריפסין ואחרי צביעה עם Giemsa כדי ליצור אור אופייני ופסים כהים. אותו יחסי הציבורocedure לבודד את הכרומוזומים יכול לשמש להכנת תאים להליכים כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה השוואתית גנומית (CGH), וkaryotyping ספקטרלי (SKY) 14,15.

ממרחי metaphase איכות גבוהה חיוניים לניתוח כרומוזום. Assay מוצלח מניב כרומוזומים אשר פרוסים היטב ומורפולוגיה כרומוזום המתאימה. כרומוזומים כראוי התאגדו-G מכילים את האור האופייני ודפוסי פסים כהים. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1.jpg" /> איור 1. כרומוזומליות התפשטות...

יכולים להיות מבודדים הכרומוזומים מתאי חיים כגון לימפוציטים או fibroblasts עור, ומאורגניזמים כולל בני אדם או עכברים. הכנות כרומוזום אלה יכולים להיות מנוצלים נוספים עבור ה-G-פסים שיגרתי ונהלים ציטוגנטית מולקולריים כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה השוואתית גנומית (CGH), וkaryotyping ספקטרלי (SKY).

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לאסוף ולהכין כרומוזומים לצביעת פסי GB ולבדיקות ציטוגנטיקה מולקולרית. ראשית, תרבתו את התאים עד לשלב הלוגריתמי. לאחר מכן, אספו את הכרומוזומים באמצעות smid, תמיסה היפוטונית וחומר מקבע.טפטפו את תרחיף התאים על למסליות. צבעו למסלית אחת. כדי לבקר את תהליך הכנת הכרומוזומים, המשיכו לצביעת פסי GB או לטכניקות מולקולריות בלמסליות שנותרו.כשלב סופי בצביעת פסי GB, נתחו את הכרומוזומים באמצעות מיקרוסקופיה של אור וקריוטיפינג. בסופו של דבר, הכרומוזומים והגרעינים יהיו זמינים לקריוטיפינג או ל-FISH. הרעיון לפרסום שיטה זו עלה תחילה בשל הדרישה הגבוהה מצד חוקרים אחרים שביקשו סיוע בזיהוי אי-יציבות כרומוזומלית בסוגים שונים של תאים מאורגניזמים מגוונים ולביצוע בדיקות ציטוגנטיקה מולקולרית בהמשך.טכניקה זו חיונית לאבחנה ובסופו של דבר לפרוגנוזה של הפרעות גנטיות מולדות רבות, כולל סרטן, מכיוון שהיא מאפשרת ויזואליזציה של ארגוני מחדש של כרומוזומים, שהם בעלי ערך אבחנתי. עבור הפרעות אלו, למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ארגוני מחדש של כרומוזומים הנמצאים בסוגים שונים של תאי אדם, ניתן ליישמה גם על תאים מאורגניזמים אחרים כגון תרביות של Resus Maca, חולדות ועכברים.2 מיליון תאים דבקים עד ל-80% התמלאות (confluency) והוסף 10 µL של 10 µg/mL. Col למיליליטר של תאים. דגרי את התאים בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור עם 5% CO2 למשך 45 דקות.לאחר מכן, באמצעות פיפטה סטרילית, העבירו את המצע מהתרבית לשפופרת קונוסית של 15 מיליליטר ושמרו אותה להמשך. לשטיפת התאים, הוסיפו שני מיליליטר של HBSS לבקבוק, סובבו אותו בעדינות והסילו את הבופר. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של trypsin, וודאו שהוא מכסה את כל שטח הפנים של הבקבוק. ברגע שרוב התאים ניתקו, העבירו באמצעות פיפטה את המצע מהשפופרת הקונוסית בחזרה אל התאים.העבירו מנות של 10 milliliters של תרחיף התאים למבחנות קוניות בנפח 15 milliliter. סבבו בצנטריפוגה ב-200 Gs למשך 10 דקות. הסירו את הנוזל העליון (supernatant).יש להשעות מחדש את המשקע ב-10 milliliters של 75 millimolars potassium chloride, אשר חומם מראש ל-37 degrees Celsius, לאחר דגירה של 10 דקות ב-37 degrees Celsius. יש לסבב בצנטריפוגה ב-200 Gs למשך חמש דקות. בטמפרטורה של 25 degrees Celsius, יש להסיר את כל הנוזל העליון (supernatant) למעט 0.5 milliliters, ולהשעות מחדש את המשקע בזהירות.הוסיפו חמישה מיליליטרים של מקבע car noise טרי לתאים. לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליליטרים נוספים של המקבע וסבבו בcentrifuge במהירות של 200 Gs למשך חמש דקות. השביו כל משקע תאים בחמישה מיליליטרים של מקבע.אחסן את התאים בטמפרטורה של ארבע מעלות למשך עד שנה אחת. סבב את התאים בצנטריפוגה ב-200 Gs למשך חמש דקות. בטמפרטורה של 25 degrees Celsius.הסר את ה-sup natant עד שנותרו 0.3 עד 0.5 milliliters לאחר השעיה עדינה של המשקע. טפטף באמצעות פיפט שלוש טיפות של תרחיף התאים ממרחק של כשני אינץ' על עלית המוטה בזווית של כ-45 מעלות, ואפשר לתרחיף להתגלגל על פני העלית.הוסף טיפה גדולה אחת של מקבע רעש רכב טרי לסלייד. העבר את גב הסלייד על נייר סופג, ולאחר מכן השאר את הסלייד לייבוש מלא. הכן תמיסת תחזוקה gim טרייה.הניחו את השקופיות על מתקן צביעה. כסו את כל השקופית בתמיסת התחזוקה של ה-gim. לאחר חמש דקות, שטפו את השקופיות במים מזוקקים, נקו את שאריות הנוזל והניחו להן להתייבש באוויר.הוסיפו ארבע טיפות של חומר קיבוע קבוע (perm mount) לזכוכית הערימה והניחו זכוכית כיסוי תוך כדי וידוא שאין בועות תחתיה. הסירו את עודפי חומר הקיבוע בעזרת נייר סופג. נתחו את התאים באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלה של 10x ו-100x.אם תאי המטפאזה שפעים ופרוסים היטב, ניתן להשתמש בשקופיות הנותרות להליכים ניסיוניים אחרים. הוסיפו 50 milliliters של תמיסות הטיפול לארבעה צנצנות Copeland. טבלו כל שקופית בצנצנת מספר אחת למשך חמש שניות לאחר מכן.שטיפה מהירה של הפלטה בצנצנת מספר שתיים. השאר אותה בצנצנת מספר שלוש למשך 30 שניות לפחות. שטיפה בצנצנת מספר ארבע, ולאחר מכן יש להניח לפלטות להתייבש.הכינו תמיסת תחזוקה GIM טרייה. הניחו את השקופיות על מתקן צביעה. כסו את השקופית כולה בתמיסת התחזוקה GIM למשך חמש דקות.שטפו את העגיות במים מזוקקים באותו סדר שבו בוצע הצביעה. לאחר מכן, ייבשו למשך 10 דקות לפחות. הניחו זכוכית כיסוי באמצעות perm mount כפי שהודגם קודם לכן.לאחר מכן, נתחו את התאים תחת מיקרוסקופ אור עבור שאר השקופיות. התאימו את זמן הדגירה בטריפסין על בסיס תוצאות השקופית הראשונה.בדיקה מוצלחת מניבה כרומוזומים הפרוסים היטב ובעלי מורפולוגיה כרומוזומלית מתאימה. כרומוזומים שעברו צביעת GB בצורה נכונה מכילים את תבניתי הפסים הבהירים והכהים האופייניים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן קצירת הכרומוזומים לצביעת GB ולבדיקות ציטוגנטיקה מולקולרית נוספות לצורך בירור של אי-יציבות כרומוזומלית.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע את תהליך הקציר בתוך כשלוש שעות אם הוא מבוצע כראוי. עבור הליך הצביעה ב-GB, חשוב לבחון תחילה את זמן הדגירה של ה-tripsin על שקופית אחת לפני המעבר לצביעת GB עבור שאר השקופיות.

chromosome-preparation-from-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Karyotyping היא טכניקה פשוטה ושימושית בשימוש נרחב לאיתור שינויים גנטיים. כאן אנו מתארים צעד אחר צעד להכנת פרוטוקול כרומוזום התפשטות בתאי גזע עובריים אנושיים לניטור מצב הכרומוזומים של תאים אלה נשמר בתרבות.

מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

שיטה כמותית לניתוח עיתוי שכפול כרומוזום מתוארת. השיטה מנצלת התאגדות BrdU בשילוב עם...

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

מסלולי תיקון DNA חיוניים לתחזוקה של שלמות הגנום ומוטצית מניעה וסרטן. המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת חוסר יציבות גנומית על ידי תצפית ישירה של סטיות כרומוזום בmetaphase מתפשט מתאי B עכבר באמצעות ניאון הכלאה באתר (FISH) לחזרות דנ"א telomeric.

ניתוח מהיר של סטיות כרומוזום בעכבר לימפוציטים מסוג B על ידי הרשות הפלסטינית-FISH

המנגנונים המולקולריים של דה-קונדנסטציה של כרומטין מיטוטי דחוס מאוד אינם מוגדרים כהלכה. אנו מציגים בדיקה נטולת תאים המבוססת על אשכולות כרומטין מיטוטיים שבודדו מתאי HeLa ותמצית ביצי Xenopus laevis המשחזרת נאמנה את תהליך העיבוי במבחנה.

תא Assay חינם לחקר הכרומטין Decondensation בסוף מיטוזה

פרוטוקול מתואר להכנת התפשטות כרומוזומים מיטוטיים איכותיים בשיטת ייבוש אוויר מהירה המתאימה לזיהוי FISH של בדיקות DNA בודדות וגבוהות.

כרומוזום מהיר האוויר יבש השמטת הכנת שיטה מתאימה לדגים בצמחים

פרוטוקול זה מתאר שיטות כימות ואפיון של סטיות כרומוזומליות במבחנה מקרופאגים העכבר RAW264.7 לאחר הטיפול עם חומר חלקיקי באוויר הסביבה.

ניתוח של סטיות כרומוזומליות Matter הנגרמת חלקיקי אמביינט שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת

זוהי שיטה לזיהוי חלבונים אינטראקציה-DNA הרומן ב לוקוסים יעד ספציפיות, בהסתמך על רצף ספציפי לכידתו של כרומטין תפור עבור ניתוחים פרוטיאומיה מבנית עוקבות. ידע מוקדם לגבי פוטנציאל מחייב חלבונים, ולא תא שינויים נדרשים. בתחילה פותח עבור שמרים, הטכנולוגיה כבר עכשיו מותאם בתרבית של תאים.

עיבוד של הכלאה צלמו של חלבונים הקשורים כרומטין פרוטאומיקס בתרבית של תאים

שילוב של תכשירי הילה של DNA עם הכלאה פלואורסצנטית באתרו מאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות גנומיות עם השלד הנוקלאו-שלד. גנום מחובר מוביל לאותות פלואורסצנטיים היברידיים הממוקמים בתוך הגרעינים השיוריים שחולצו, בעוד שהגנום שאינו מחובר נמצא בהילת הדנ"א המקיפה את הגרעינים השיוריים.

הכלאה פלואורסצנטית באתרה על תכשירי הילה של DNA לחשיפת כרומוזומים שלמים, טלומרים ומיקומי גנים

Hi-C 3.0 הוא פרוטוקול Hi-C משופר המשלב פורמלדהיד ודיסוקינימידיל גלוטראט קרוסלינקרים עם קוקטייל של אנזימי הגבלה DpnII ו- DdeI כדי להגדיל את יחס האות לרעש ואת הרזולוציה של זיהוי אינטראקציית כרומטין.

לכידת קונפורמציה של כרומוזומים על פני סולמות אורך

פרוטוקול זה מתאר את שיטת Capture Hi-C המשמשת לאפיון הארגון התלת-ממדי של אזורים גנומיים ממוקדים בגודל מגה-מבוסס ברזולוציה גבוהה, כולל גבולות של תחומים משויכים טופולוגית (TADs) ואינטראקציות כרומטין ארוכות טווח בין אלמנטים רגולטוריים ורצפי DNA אחרים.

פענוח ארגון כרומטין תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה באמצעות לכידת Hi-C

למדו הכנת כרומוזומים מתאים חי לצורך בדיקות ציטוגנטיות מולקולריות ו-G-banding. השיטה כוללת שימוש בתמיסה היפוטונית ופיקסטיב, ומתאימה לתאי לימפוציטים ופיברובלסטים עור אנושיים ומכרסמים.

הכנת כרומוזום מתאים בתרבית

גלה סרטונים נוספים