מבוא לממברנה מוצקה נתמכות המבוססת Electrophysiology

אז אלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה נתמכת בקיצור אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM. זו גישה אלקטרופיזיולוגית חדשה. הוא מציע למספר יישומים שיפור משמעותי בהשוואה לשיטות הקונבנציונליות.

הכלי העיקרי של האלקטרופיזיולוגיה הקונבנציונלית הוא אלקטרודת המיקרו-חלקיקים המלאה באלקטרוליטים, בעוד שהאלקטרופיזיולוגיה המבוססת על M שלה מזהה טרנסלוקציה של מטען באמצעות אלקטרודת ממברנה נתמכת מוצקה. זה שימושי ביותר במקרים בהם לא ניתן להשתמש באלקטרופיזיולוגיה קונבנציונלית, כמו במקרה של מובילי חיידקים, שמלבד כמה חריגים נדירים, לא ניתן לחקור אותם בשיטות מהדק מתח או מצלמת תיקון. במקרים כאלה, אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM הוכיחה את עצמה כמוצלחת מאוד.

ניתן להשתמש בו גם כדי לחקור טרנספורטרים אוקריוטיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית בממברנות תוך-תאיות. ישנן דרכים רבות לבצע ניסויים אלקטרופיזיולוגיה מבוססי SSM. במחקר בסיסי, ניתן ליישם אותו כדי לקבוע פרמטרים קינטיים ולהבהיר את מנגנון ההובלה, אך החוסן והפוטנציאל שלו לאוטומציה הופכים אותו לאידיאלי עבור סינון יישומים בגילוי מסלול.

אלקטרודת ה-SSM נושאת מערכת ממברנה מורכבת המורכבת מה-SSM הבסיסי והפרוטאזומים או שברי הממברנה המכילים את חלבון ההובלה המעניין שלך. ניתן לתאר את התכונות החשמליות של קרום התרכובת על ידי מעגל שווה ערך בו הממברנות יוצרות מערכת מצומדת קיבולית. שימו לב שההתנהגות החשמלית של המערכת זהה במהותה בין אם משתמשים בשברי ממברנה או בליפוזומי פרוטיאה.

תזוזת המטען בחלבון ההובלה מועברת למעגל המדידה באמצעות הקיבול של קרום שלפוחית השתן. עקרון זיהוי הנקרא צימוד קיבולי. בניסוי טיפוסי, חילופי תמיסה מהירים ב-VSSM מספקים את המצע לחלבון ההובלה V וכתוצאה מכך פעילות הובלה אלקטרוגנית של החלבון מייצרת זרם, המחובר למערכת המדידה באמצעות קיבול SSM.

במקביל, פעילות החלבון האלקטרוגני טוענת בהדרגה את הממברנה הליפוזומלית מה שמוביל לעיכוב של חלבון ההובלה והזרם היורד במעגל ההקלטה, הזרם הנמדד הוא תוצאה של תגובות הובלה בו זמנית של מיליוני ליפוזומי פרוטיאה הנספגים באנזו. כל אחד מהם מכיל כ-100 מובילים. ההתקנה מורכבת מכלוב פאראדיי עם מסלול פתרון, מעגלים חיצוניים לבקרת שסתומים, הגברת אותות, בתוספת איסוף וניתוח נתונים.

כלוב ה-EC כולל מיכלים, שסתומים וצינורות הנדרשים לבקרת זרימת תמיסה, כמו גם אמה עם שבב XOR. שבב ה-XOR נושא את אלקטרודת ה-SSM ואת ליפוזומי הפרוט הנספגים. ה- vete מחובר למגבר ולמחולל הפונקציות של המעגל החשמלי החיצוני.

מדידות SSM, שריפה, שני פתרונות, אחד מפעיל ואחד לא מפעיל מלבד המצע, שקיים רק בתמיסה המפעילה. לשני הפתרונות יש הרכב זהה בתצורת ההחלפה היחידה. שני שסתומים דו-כיווניים שולטים בזרימת הפתרונות שאינם מופעלים מחדש והמפעילים.

שסתום המסוף, שסתום תלת-כיווני המחובר מכנית שלוש פעמים, משמש למעבר בין הפתרונות שאינם מפעילים לפתרונות ההפעלה, ומפנה את אחד הפתרונות למיכל הפסולת ואת הפתרון השני ל-qve. כאשר שסתום המסוף מוחלף, זרימת התמיסה שאינה מפעילה מנותבת מחדש לפסולת והתמיסה המפעילה זורמת ל-qve. תצורה זו מאפשרת זרימה רציפה בו זמנית של שני הפתרונות.

בכל עת במהלך פרוטוקול הזרימה, ניתן לייעל את מסלול הזרימה בהתאם לצורך. עם זאת, יש לזכור כי יש לשמור על מרחק קצר ככל האפשר בין ה-SSM לבין הצומת של הפתרונות שאינם מפעילים ומפעילים. מכיוון שהוא קובע את פתרון הטיימר של חילופי הפתרונות.

המגבר הנוכחי מחוץ לכלוב סיפון החשמל מחובר לשבב חיישן. בדרך כלל, זה מוגדר להגברה של 10 להספק של שמונה עד 10, להספק של תשעה וולט לאמפר וזמן מנוחה של 1 עד 10 אלפיות השנייה. מחולל פונקציות מחובר לאלקטרודה הייחוס ומחשב עם תוכנת בקרת שסתומים ורכישת נתונים ותיבת ממשק משלימים את המערכת.

תיבת הממשק מכילה את רכישת הנתונים של מנהלי השסתומים וזרימת פתרון חומרת הפלט הדיגיטלי נשמרת על ידי אוויר בלחץ של oh 0.22. לחץ בר אחד מנוטר באמצעות מילימטר דיגיטלי. ניתן לתחזק אותו על ידי מילוי מיכל פלדה המותקן בין אספקת האוויר למיכלי התמיסה בכלוב EC באמצעות שסתום מחט.

ה-CVIC מורכב מארבעה חלקים. שבב הזן דחוס בין בסיס הווטרינר לראש הווטרינר. מחבר יציאה גלילי מוברג לראש הווטרינר ונושא את מכלול אלקטרודות הייחוס.

אלקטרודת הייחוס מורכבת מחוט כסף כלור עם מחבר SMC מיניאטורי ומבודדת ממסלול הזרימה על ידי גשר מלח ג'ל פולי אקרי. מכלול גשר הג'ל אינו בשימוש, מאוחסן בתמיסת אשלגן פוספט pH של 100 מילי-מולרית המכילה 100 מילי-מולרי אשלגן כלורי. ראשית, יש להתקין את אלקטרודת הייחוס במכלול אלקטרודות הייחוס המכיל את הגשר הגיאוגרפי.

חשוב להימנע מבועות אוויר בעת התקנת אלקטרודת הייחוס. כעת חלק זה של הווט מחובר למחבר השקע, שמולא מראש בתמיסת חיץ. יש לאטום את כל החיבורים בטבעות O.

SM זה נוצר על שבב זור, אור זכוכית מובנה מצופה עז. זהו כביש סמטי בקוטר של מילימטר אחד ומחובר למשטח המגע באמצעות פס מגע לבן של 0.2 מילימטר. סיכת מגע קפיצית יוצרת מגע למגבר.

שבב הזן מאוחסן בחושך בתמיסת אתנול תיול 10 LAR Okta Deccan. כדי לשמור על השכבה המסתורית שלה להסרת המולקולות הנגיפיות של אוקטה דקאן, שלא נספגו, האלקטרודה נשטפת באתנול טהור והאלקטרודה מיובשת בגז חנקן. כעת ניתן להרכיב את שכבת המונו של הפוספוכולון.

תמיסת השומנים מכילה 15 מיליגרם למיליליטר כולין DFI ו-250 מיקרוגרם למיליליטר. אוקטה שתיים מכרה בריקבון ומאוחסן במינוס 20 מעלות. האלקטרודה ממוקמת כעת במדויק על בסיס אמה SA.

מיקרוליטר אחד של התמיסה מתווסף לאלקטרודה SSM מבלי לגעת בשכבת הזהב. מיד לאחר הוספת תמיסת השומנים, ניתן להרכיב את הווטה. נפח ה-vete האטום על ידי טבעת O הוא גלילי עם נפח פנימי של 17 מיקרוליטר בעת הרכבה.

ה-SSM צריך להיות מרוכז מתחת לקידוח הכניסה. לפני חיבור הווטרינר, יש למלא מראש את מערכת הנוזלים בתמיסת חיץ אשלגן פוספט 100 מילימולרי. חשוב לוודא שאין בועות אוויר בצינורות ובשסתומים.

כעת ניתן להרכיב את הווטרינר לכלוב היום של בלוטת התריס, לחבר את המגבר, את הכניסה והיציאה של מסלול זרימת התמיסה ואת מחולל הפונקציות. לבסוף, ניתן לשטוף את האמה עם חוצץ אשלגן פוספט 100 מילימטר. זה מוביל להיווצרות ספונטנית של SSM כדי לבדוק את איכות ה-SSM.

הקיבול והמוליכות נמדדים באמצעות מחולל הפונקציות כדי למדוד את המוליכות נעשה שימוש במתח DC של 100 מילי-וולט. הדעיכה הנוכחית מראה את טעינת קבל הממברנה לאחר טעינה מלאה של הקבל. הזרם הנמדד מניב את מוליכות הממברנה באמצעות חוק M'S.

כאן אנו צופים במוליכות של oh 0.17 ננו סימנס. ניתן למדוד את הקיבול באמצעות מתח AC משולש של 50 מילי-וולט שיא למשרעת שיא ותדר של oh 0.5 הרץ. המשרעת של זרם הגל הריבועי המתקבל מייצגת את זרם השיפוט של הקבל.

הקיבול שווה למטען המועבר חלקי המתח המופעל. ממברנה זו מציגה קיבול של 2.3 ננו, מוליכות גבוהה וקיבול נמוך מעידים על כך שה-SSM אינו נוצר כהלכה. במקרים אלה יש להשליך את הממברנה ולהכין SSM נוסף באמצעות שבב אלקטרודה חדש.

בדרך כלל ליפוזומי פרוט מאוחסנים קפואים במינוס 80. TRE th הדגימה על סוניקציה של קרח חיונית מכיוון שדגימה מצטברת סופגת גלגלת ל-SSM כדי להשיג תרחיף ליפוזום פרוט הומוגני. שלושה מחזורי סוניקציה של עשר שניות מתחלפים עם מרווחי קירור של עשר שניות על קרח.

שטפו את ה-SSM שלהם בתמיסה שאינה מפעילה. לאחר מכן הברג את מחבר השקע יחד עם דגימת האלקטרודה הייחוס. בעזרת פיפטה, הזרקו 30 מיקרוליטר מדגימת החלבון דרך יציאת הווט לנפח האט.

ראשית התקן את קצה הפיפטה לקידוח היציאה. לאחר מכן פתח את המדריך למעלה במסלול שאינו מפעיל והזריק את ליפוזומי הפרוטאה. לפני הורדת קצה הפיפטה.

סגור את המדריך למעלה כדי למנוע זרימת פתרון נוספת. אפשר לליפוזומי הפרוטאה להיספג ל-SSM למשך זמן דגירה של שעה עד שעתיים. השתמש בפרוטוקול הזרימה חלון של תוכנת בקרת השסתומים ורכישת הנתונים כדי להגדיר את פרוטוקול הזרימה שלך.

אם ברצונך למדוד בתנאים סימטריים, כגון לקביעת ספציפיות המצע, ערך KM או תלות pH, בחר בפרוטוקול החלפת פתרון יחיד. הגדר את משך הזרימה עבור כל תמיסה ל-0.5 עד שנייה אחת. הזרם נרשם לאורך כל פרוטוקול הזרימה.

ההגברה מוגדרת בדרך כלל ל-10 בחזקת תשע, ועבור קצב הדגימה, אנו בוחרים 2000 נקודות נתונים לשנייה. לבסוף, שמור את הפרוטוקול החדש שלך תחת הכותרת NA a ו-a. בהקשה השנייה של חלון פרוטוקול הזרימה, אתה יכול להגדיר את המצב הפתוח או הסגור של שסתומים ספציפיים כדי לשלוט בזרימה של פתרון שאינו מפעיל או מפעיל דרך קיוביט.

כאן אנו מדגימים את המדידה של ליפוזומי פרוטיאה, ייבוא פרוטון הסוכר כמו Y מ-E coli. התמיסה המפעילה מכילה את הלקטוז המצע המועבר, ואילו התמיסה הלא מפעילה מכילה את אותה כמות של הגלוקוז שאינו מועבר כמו תרכובת מפצה. בנוסף לסוכרים, התמיסות מכילות 100 מילי-מולרי אשלגן פוספט ב-pH 7.6 ו-DTT מילי-מולרי אחד.

לאחר החלפת פתרונות, השתמש בשסתום הידני כדי לוודא כי בועות האוויר מוסרות. לפני שתתחיל בפרוטוקול זרימה, כוונן את הלחץ ממש לפני תחילת המדידה. אנו משתמשים באופן שגרתי בלחץ של O 0.6 בר, אשר בתצורת השסתום והצינור הספציפית שלנו מניב קצב זרימה של כמיליליטר לשנייה.

לאחר מכן בחר פרוטוקול זרימה בטוחה כאן, פרוטוקול NAA, ולחץ על כפתור ההתחלה כדי להתחיל כל מדידה. במהלך המדידות הראשונות נספגים באופן רופף, ליפוזומי פרוטיאה מוסרים ולכן זרם השיא עשוי לרדת. חזור על המדידה עד שזרם השיא יישאר קבוע.

במהלך השלב הראשון של זרימת התמיסה שאינה מפעילה, הזרם הוא אפס. ההחלפה מאי-הפעלה לתמיסה מפעילה, המכילה לקטוז מעוררת את פעילות ההובלה האלקטרוגנית של הממברנה. מטען חיובי של חלבון מצטבר בתוך ליפוזומי הפרוטה, והמגבר מזהה זרם חולף חיובי עקב צימוד חיובי באמצעות ה-SSM.

זרם חיובי זה בצימוד חיובי נקרא חילופי אות V מהפתרון המפעיל. בחזרה לתמיסה שאינה מפעילה גורמת להובלת קוד סוכר פרוטונים מהליפוזומים. במקרה זה, זרם צימוד LY שלילי מוצג מה שנקרא אות כבוי לניתוח קינטי של חלבון.

נעשה שימוש רק באות ההפעלה מכיוון שאות הכיבוי מוגדר בצורה גרועה בגלל מצב הטעינה של שסתום הממברנה, מיתוג יוצר חפצים מכניים וחשמליים. למרבה המזל, אלה מוגבלים לטווח זמן לפני שנצפו האותות המושרים על ידי החלבון. שימו לב שהעיכוב של 50 אלפיות השנייה בין חפצי מיתוג השסתומים לאותות הטרנספורטר הוא הזמן שהפתרון צריך להתפשט משסתום ההדקים אל פני השטח של חילופי הפתרונות המהירים של SSM, כמו זה שבוצע על ה-SSM מייצג ניסוי הרפיה טיפוסי.

בניסויים כאלה, הזרם נרגע דרך שלב טרום מצב יציב תלוי זמן למצב יציב קבוע. הפרטים הקינטיים הנוכחיים של מחזור התגובה עשויים להיגזר מהצורה והגודל של זרם המצב היציב הקדם-יציב. בעוד שזרם המצב היציב מספק מידע על תחלופת חלבון הממברנה הרציפה.

במערכת המשולבת שבה ליפוזומי פרוטיאה נספגים ל-SSM שלהם, זרמי המצב היציב הקדם-יציב כמעט ללא שינוי. בעוד שלעולם לא מתקבל זרם קבוע במצב יציב, במקום זאת עקב טעינת הליפוזומים, הזרם הנמדד פוחת בהדרגה. ניתן לחשב את זרם הטרנספורטר מהזרם הצמוד הנמדד באמצעות ניתוח מעגלים.

כאן אנו מדגימים תוצאות מייצגות באמצעות טרנספורטר משותף של פרוטון סוכר, כמו Y בטווח PA בין 8.5 ל-7.6. זרם הטרנספורטר נשלט על ידי תגובה אלקטרוגנית מאוחרת במחזור התגובה. בתנאים אלה, פני המצב היציב הקדם-יציב מורכבים מעליית זרם פשוטה לערך המצב היציב שלו.

לאחר מכן זה דועך עקב צימוד קיבולי. אנחנו מעוניינים בזרם התחבורה היציב. בהיעדר פוטנציאל ממברנה, זה מיוצג לקירוב טוב על ידי זרם השיא.

לכן ניתן לנתח את הקינטיקה של עלי מיין על ידי סריקת זרמי השיא עבור ריכוזי מצע שונים, אך קחו בחשבון שניתן להשוות בקפדנות את משרעות זרם השיא רק אם הן מתקבלות מחיישן יחיד בניסוי אחד. סיבה אחת היא השונות של יעילות הספיגה. כאשר ה- pH מופחת עוד יותר, האות החד-פאזי הופך לדו-פאזי.

ולבסוף, נותר טרנזיינט מהיר למוטציה חסרת הובלה Y בפיגור תחבורה. אחרי החולף המהיר מופיע רכיב שלילי קטן ואיטי יותר. הרכיב השלילי אופייני לזרמים חולפים מהירים הנמדדים במערכות מצומדות ונגרם על ידי פריקת קיבול ממברנה.

כאן, זרם השיא אינו מייצג הובלה במצב יציב, אלא אישור אלקטרוגני של מעבר מוקדם במחזור היונים, שמתברר מכיוון שמוטנט la y אינו מראה הובלה במצב יציב, ועבור פיגור מסוג בר, הובלת מצב יציב y מעוכבת על ידי pH נמוך. הראיות הניסיוניות מספקות פרשנות מכניסטית של טרנסלוקציה של מטען במחזור התגובה של פיגור y, המוצגת במודל הקינטי. החולף המהיר שנצפה עבור המוטציה החסרה בהובלה, או במקרה של פיגור Y מסוג פרא בתנאים חומציים נובע מתגובה אלקטרוגנית שבועית מהירה בעקבות קשירת לקטוז בערכי pH גבוהים יותר, האות נשלט על ידי התגובה האלקטרוגנית העיקרית מאוחר במחזור התגובה, שהוצע לייצג שחרור פרוטונים פסאודו-פלזמי במערכת המצומדת באופן קיבולי.

זה מוביל לזרמים חולפים המייצגים הובלה במצב יציב של Lag y עקב האינטראקציה החזקה של ה-Utes. עם ה-SSM, חפצים חשמליים נוצרים כאשר מחליפים פתרונות בהרכב שונה. ודא שתמיסות שאינן מפעילות ומפעילות דומות ככל האפשר, במיוחד בכל הנוגע ל-pH ולחוזק היוני שלהן.

יש לבצע בקרה מכיוון שמצעים יכולים גם לייצר חפצים. בדוק תמיד את מערכת החיץ הספציפית שלך ואת פרוטוקול הזרימה שלך לאיתור חפצים באמצעות ה-SSM החשוף לפני הוספת דגימת החלבון. לאחר הוספת החלבון ניתן לבצע מדידות בקרת דגימה עם תמיסות המכילות לא מצעים, הדומים מבחינה מבנית למצע.

יתר על כן, קיימת אפשרות לבדוק מצע עבור חפצים באמצעות ליפוזומים או שברי ממברנה ללא החלבון המעניין. אתה יכול גם להוסיף מעכבים לתמיסות שלך או לזרוק אותם. לאחר הניסוי ישירות לשקע הווטה כדי למדוד את עיכוב אות הטרנספורטר, האותות הספציפיים לחלבון ייעלמו, ויישארו רק חפצי חילופי תמיסות.

לאחר מכן ניתן לתקן את אות החלבון בקלות. ודא שאובדן הפרוט, הליפוזומים או פירוק החלבון שנספג אינו משפיע על המדידה שלך. על ידי ביצוע מדידות בקרה חוזרות ונשנות בתנאים זהים, ניתוק אות של עד 20% מקובל וניתן לתקן אותו על ידי הנחת תלות זמן ליניארית של הסיכום.

מערך זה הוא תוצאה של 20 שנות פיתוח טכני במעבדה שלנו. כמו כן, קיימות מערכות מיוחדות עם פתרון טיימר גבוה יותר לניתוח קינטי וצריכת תמיסה נמוכה יותר עבור מצעים יקרים. לבדיקת סמים, אנו משתמשים בהגדרות אוטומטיות לחלוטין עם תפוקה גבוהה יותר.

עד כה אופיינו יותר מ-20 מובילים בשיטה זו. אלה כוללים APAs הובלה, מתחמי שרשרת נשימה, מובילים קרירים, מחליפים ואפילו תעלות ברזל. אז כאשר אינך מסוגל לפתור את הבעיה שלך על ידי אלקטרופיזיולוגיה סטנדרטית, שקול להשתמש באלקטרופיזיולוגיה של SS Mase במקום זאת.