מבוא לממברנה מוצקה נתמכות המבוססת Electrophysiology

אלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה נתמכת, בקיצור SSM based electrophysiology, היא גישה אלקטרופיזיולוגית חדשה. היא מציעה שיפור משמעותי בהשוואה לשיטות הקונבנציונליות עבור מספר יישומים.

הכלי העיקרי של אלקטרופיזיולוגיה קונבנציונלית הוא אלקטרודת מיקרו-חלקיק ממולאת אלקטרוליט, בעוד שאלקטרופיזיולוגיה מבוססת M מזהה תעתוק מטען באמצעות אלקטרודת ממברנה נתמכת מוצק (SSM). שיטה זו שימושית ביותר במקרים שבהם לא ניתן להשתמש באלקטרופיזיולוגיה קונבנציונלית, כגון במקרה של נשאי בקטריות, אשר למעט מספר חריגים נדירים, לא ניתן לחקור אותם באמצעות שיטות voltage clamp או patch clamp. במקרים כאלה, אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM הוכחה כבעלת הצלחה רבה.

ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לחקור נשאי אוקריוטים רלוונטיים פיזיולוגית בממברנות תוך-תאיות. קיימות דרכים רבות לביצוע ניסויי אלקטרופיזיולוגיה המבוססים על SSM. במחקר בסיסי, ניתן ליישם אותה כדי לקבוע פרמטרים קינטיים ולהבהיר את מנגנון ההובלה, אך העמידות שלה והפוטנציאל לאוטומציה הופכים אותה לאידיאלית עבור יישומי סריקה בזיהוי נשאי חומרים.

אלקטרודת ה-SSM נושאת מערכת ממברנה מורכבת המורכבת מה-SSM הבסיסית ומפרוטאוזומים או מקטעי ממברנה המכילים את חלבון ההובלה הרלוונטי. ניתן לתאר את התכונות החשמליות של הממברנה המורכבת באמצעות מעגל שווי ערך שבו הממברנות מהוות מערכת בעלת צימוד קיבולי. שימו לב כי ההתנהגות החשמלית של המערכת היא למעשה זהה, בין אם נעשה שימוש בקטעי ממברנה ובין אם נעשה שימוש בפרוטאו-ליפוזומים.

העתקת המטען בחלבון הנשאי מועברת למעגל המדידה באמצעות קיבול הממברנה של השלפוחית. עיקרון גילוי זה נקרא צימוד קיבולי. בניסוי טיפוסי, החלפה מהירה של התמיסה ב-VSSM מספקת את הסובסטרט עבור חלבון הנשאי V, ואילו פעילות ההובלה האלקטרוגנית הנובעת מכך של החלבון מייצרת זרם, המצומד למערכת המדידה באמצעות קיבול ה-SSM.

במקביל, הפעילות האלקטרוגנית של החלבון טוענת בהדרגה את ממברנת הליפוזום, מה שמוביל לעיכוב של חלבון התובח ולדעיכה של הזרם במעגל ההקלטה; הזרם הנמדד הוא תוצאה של תגובות תובח סימולטניות של מיליוני ליפוזומי חלבון שנסמכו על ה-Enzo, כאשר כל אחד מהם מכיל כ-100 תובחים. המערך מורכב מכלוב פראדיי עם נתיב תמיסה, מעגלים חיצוניים לבקרת שסתומים, הגבר אות, וכן רכיבים לרכישת נתונים וניתוחם.

כלוב ה-EC כולל מיכלים, שסתומים וצינורות הדרושים לבקרת זרימת התמיסה, וכן קיובית עם שבב XOR. שבב ה-XOR נושא את אלקטרודת ה-SSM ואת ליפוזומיי ה-prot שנספגו. ה-vete מחובר למגבר ולמחולל הפונקציות של המעגל החשמלי החיצוני.

מדידות SSM, שריפת רשת, שני תמיסות, אחת מפעילה ואחת שאינה מפעילה, מלבד התשתית, שנמצאת רק בתמיסה המפעילה. לשני התמיסות אותו הרכב בתצורת החלפה בודדת. שני שסתומים דו-כיווניים שולטים בזרימה של התמיסות שאינן מפעילות והמפעילות.

השסתום הסופי, שסתום תלת-כיווני משולש המחובר באופן מכני, משמש למעבר בין התמיסות הבלתי-מפעילות למפעילות, תוך ניתוב של אחת התמיסות למכל הפסולת והשנייה ל-qve. כאשר השסתום הסופי מופעל, זרימת התמיסה הבלתי-מפעילה מנותבת מחדש לפסולת והתמיסה המפעילה זורמת ל-qve. תצורה זו מאפשרת זרימה רציפה וסימולטנית של שתי התמיסות.

בכל שלב במהלך פרוטוקול הזרימה, ניתן לייעל את נתיב הזרימה בהתאם לצורך. עם זאת, יש לזכור שיש לשמור על מרחק קצר ככל האפשר בין ה-SSM לבין נקודת המפגש של התמיסות הבלתי-מפעילות והמפעילות, שכן מרחק זה קובע את זמן התגובה של החלפת התמיסות.

מגבר הזרם שמחוץ לכלוב סיפון ההספק מחובר לשבב חיישן. בדרך כלל, הוא מכוון להגברה של 10⁸ עד 10⁹ וולט ל-אמפר וזמן מנוחה של 1 עד 10 מילי-שניות. גנרטור פונקציות מחובר לאלקטרודת הייחוס, ומחשב עם תוכנה לבקרת שסתומים ורכישת נתונים יחד עם תיבת ממשק משלימים את המערכת.

תיבת הממשק מכילה את רכיבי רכישת הנתונים של מניעי השסתומים ופתרון חומרת הפלט הדיגיטלי; זרימת התמיסה נשמרת באמצעות אוויר בלחץ של 0.22 bar. הלחץ מנוטר באמצעות מנומטר דיגיטלי. ניתן לשמור על הלחץ על ידי מילוי מכל פלדה המותקן בין אספקת האוויר למכלי התמיסה ב-EC Cage באמצעות שסתום מחט.

ה-CVIC מורכב מארבעה חלקים. שבב ה-zen דחוס בין בסיס ה-vet לבין ראש ה-vet. מחבר יציאה גלילי מחובר בברגה לראש ה-vet ונושא את מכלול אלקטרודת הייחוס.

אלקטרודת הייחוס מורכבת מחוט כסף מכלור עם מחבר SMC מיניאטורי, והיא מבודדת מנתיב הזרימה על ידי גשר מלח של ג'ל פולי-אקריל. כאשר היא אינה בשימוש, מכלול גשר הג'ל נשמר בתמיסת פוטסיום פוספאט 100 millimolar ב-pH 7 המכילה 100 millimolar פוטסיום כלוריד. ראשית, יש להתקין את אלקטרודת הייחוס בתוך מכלול אלקטרודת הייחוס המכיל את גשר הג'ל.

חשוב להימנע מהיווצרות בועות אוויר בעת התקנת אלקטרודת הייחוס. כעת חלק זה של ה-vete מחובר למחבר היציאה, שמולא מראש בתמיסת בופר. יש לאטום את כל החיבורים באמצעות טבעות O.

SM זה נוצר על גבי שבב zor, שהיא זכוכית מצופה ב-goat ומובנית. מדובר בנתיב סמנטי בעל קוטר של 1 mm, המחובר למסעד המגע באמצעות פס מגע לבן ברוחב 0.2 mm. פין מגע קפיצי יוצר את המגע עם המגבר.

שבב ה-zen מאוחסן בחושך בתמיסת 10 LAR Okta Deccan thiol ethanol. כדי לשמור על שכבת ה-arcane thi ולהסיר מולקולות ויראליות של Okta deccan שלא נספגו, שוטפים את האלקטרודה באתנול טהור ומייבשים אותה בגז חנקן. כעת ניתן להרכיב את השכבה המונולאית של הפוספוכולין.

תמיסת הליפידים מכילה 15 mg/mL DFI choline ו-250 µg/mL Okta two A mine in decay, והיא מאוחסנת בטמפרטורה של 20°C- . כעת מניחים את האלקטרודה במדויק על בסיס ה-SA cubit.

מיקרוליטר אחד של התמיסה מתווסף לאלקטרודת ה-SSM ללא מגע בשכבת הזהב. מיד לאחר הוספת תמיסת הליפידים, ניתן להרכיב את ה-vete. נפח ה-vete הנאטם על ידי טבעת O הוא גלילי עם נפח פנימי של 17 microliter בעת ההרכבה.

את ה-SSM יש למרכז תחת פתח הכניסה. לפני חיבור המכשיר, יש למלא מראש את מערכת הנוזלים בתמיסת בופר פוטסיום פוספאט בריכוז 100 millimolar. חשוב לוודא שאין בועות אוויר בצינוריות ובשסתומים.

כעת ניתן להניח את הדגימה בתוך כלוב היום של בלוטת התריס, ולחבר את המגבר, את פתחי הכניסה והיציאה של נתיב זרימת התמיסה ואת מחולל הפונקציות. לבסוף, ניתן לשטוף את הכלי עם 100 מיליליטר של בופר פוספט של אש🟣טסיום. פעולה זו מובילה להיווצרות ספונטנית של SSM לצורך בדיקת איכות ה-SSM.

הקיבול והמוליכות נמדדים באמצעות מחולל פונקציות; למדידת המוליכות נעשה שימוש במתח DC של 100 millivolt. דעיכת הזרם מראה את טעינת קבל הממברנה לאחר שהקבל נטען במלואו. הזרם הנמדד מאפשר חישוב של מוליכות הממברנה באמצעות חוק M'S.

כאן אנו מבחינים במוליכות של כ-0.17 nano Siemens. ניתן למדוד את הקיבול באמצעות מתח AC משולש בעוצמה של 50 millivolt peak to peak ובסבב של כ-0.5 hertz. האמפליטודה של זרם גל המרובע שמתקבל מייצגת את זרם השיפוט של הקבל.

הקיבול השווי לביטוי של המטען שהועבר חלקי המתח שהופעל. ממברנה זו מראה קיבול של 2.3 nano; מוליכות גבוהה וקיבול נמוך מעידים על כך שה-SSM לא נוצר באופן תקין. במקרים אלו, יש להשליך את הממברנה ולהכין SSM אחר באמצעות שבב אלקטרודה חדש.

בדרך כלל ליפוזומים של חלבונים מאוחסנים בהקפאה במינוס 80. יש להפשיר את הדגימה על קרח. סוניקציה היא חיונית מכיוון שדגימה מצבברת בולעת באופן לא יעיל, כדי להשיג תרחיף הומוגני של ליפוזומים של חלבונים. שלושה מחזורי סוניקציה של עשר שניות לסירוגין עם הפסקות קירור של עשר שניות על קרח.

שטפו את ה-SSM שלהם בתמיסה שאינה מפעילה. לאחר מכן, הבריגו החוצה את מחבר היציאה יחד עם דגימת אלקטרודת הייחוס. באמצעות פיפטה, הזריקו 30 µL של דגימת החלבון דרך יציאת ה-vete אל תוך נפח ה-ette.

ראשית, הרכב את טיפ הפפיטה על פתח היציאה. לאחר מכן, פתח את השסתום הידני המופיע לעיל בנתיב שאינו מפעיל והזרק את הליפוזומים של ה-protea. לאחר מכן, הסר את טיפ הפפיטה.

סגור את השסתום הידני שלמעלה כדי למנוע זרימה נוספת של התמיסה. אפשר לליפוזומים של הפרוטאה להיספג ל-SSM למשך זמן דגירה של שעה אחת עד שעתיים. השתמש בחלון פרוטוקול הזרימה (flow protocol Window) של תוכנת בקרת השסתומים ורכישת הנתונים כדי להגדיר את פרוטוקול הזרימה שלך.

אם ברצונכם למדוד תחת תנאים סימטריים, כגון לקביעת ספציפיות של סובסטרט, ערך KM או תלות ב-pH, בחרו בפרוטוקול החלפת תמיסה בודדת. הגדירו את משך הזרימה עבור כל תמיסה ל-0.5 עד שניה אחת. הזרם נרשם לאורך כל פרוטוקול הזרימה.

ההגברה נקבעת בדרך כלל ל-10 בחזקת תשע, ועבור קצב הדגימה, נבחר 2000 נקודות נתונים לשנייה. לבסוף, שמרו את הפרוטוקול החדש תחת הכותרת NA a and a. בלשונית השנייה של חלון פרוטוקול הזרימה, ניתן להגדיר את המצב הפתוח או הסגור של שסתומים ספציפיים כדי לשלוט בזרימה של תמיסה לא מפעילה או מפעילה דרך ה-qubit.

כאן אנו מדגימים את מדידת ליפוזומים של חלבוני ממbrane, ייבוא פרוטוני סוכר דמוי Y מ-E coli. התמיסה המפעילה מכילה את הסובסטרט המועבר lactose, בעוד שהתמיסה שאינה מפעילה מכילה את אותה כמות של glucose שאינו מועבר כתרכובת מפצה. בנוסף לסוכרים, התמיסות מכילות 100 millimolar potassium phosphate ב-pH 7.6 ואחד millimolar DTT.

לאחר החלפת התמיסות, השתמשו בשסתום הידני כדי לוודא שבועות אוויר הוסרו. לפני תחילת פרוטוקול זרימה, כווננו את הלחץ רגע לפני תחילת המדידה. אנו משתמשים באופן שגרתי בלחץ של 0.6 bar, אשר בתצורת השסתום והצינור הספציפית שלנו מניב קצב זרימה של כמיליליטר אחד לשנייה.

לאחר מכן, בחרו כאן פרוטוקול זרימה בטוח, פרוטוקול ה-NAA, ולחצו על כפתור ההפעלה (start) כדי להתחיל בכל מדידה. במהלך המדידות הראשונות, ליפוזומים של חלבון שנספגו באופן רופף מסולקים, ולפיכך זרם השיא עשוי לרדת. חזרו על המדידה עד שזרם השיא יישאר קבוע.

במהלך השלב הראשון של זרימת תמיסה שאינה מפעילה, הזרם הוא אפס. המעבר מתמיסה שאינה מפעילה לתמיסה מפעילה, המכילה lactose, משרה את פעילות ההובלה האלקטרוגנית של הממברנה. מטען חיובי של חלבון מצטבר בתוך הפרוטוליפוזומים והמגבר מזהה זרם חולף חיובי עקב צימוד חיובי באמצעות ה-SSM.

זרם חיובי זה, המצומד באופן חיובי, נקרא אות ה-on הנובע מהחלפת V מהתמיסה המפעילה. חזרה לתמיסה שאינה מפעילה גורמת לטרנספורט מצומד של פרוטונים וסוכר אל מחוץ לליפוזומים. במקרה זה, מוצג זרם שלילי מצומד, המכונה אות ה-off, לצורך ניתוח קינטי של החלבון.

רק אות ה-on נמצא בשימוש, מכיוון שאות ה-off אינו מוגדר היטב בשל מצב המטען; המיתוג של שסתום הממברנה יוצר ארטיפקטים מכניים וחשמליים. למרבה המזל, אלה מוגבלים לטווח זמן שקדמה לצפייה באותות המושרים על ידי החלבון. שים לב שההשהיה של 50 milliseconds בין ארטיפקטי מיתוג השסתום לאותות הנשא (transporter) היא הזמן הדרוש לתמיסה כדי להתפשט מהשסתום הסופי אל פני השטח של ה-SSM Rapid Solution Exchange. ניסוי כזה, כפי שבוצע ב-SSM, מייצג ניסוי רלקסציה טיפוסי.

בניסויים מסוג זה, הזרם נרגע דרך שלב קדם-מצב יציב (pre steady state) התלוי בזמן, אל תוך מצב יציב קבוע. ניתן להסיק פרטים קינטיים של מחזור התגובה מהצורה ומהעוצמה של זרם קדם-המצב היציב, בעוד שזרם המצב היציב מספק מידע על מחזור התחלופה (turnover) הרציף של חלבון הממברנה.

במערכת מצומדת באופן רחב שבה ליפוזומי חלבון נספגים לממברנת התמיכה (SSM) שלהם, זרמי טרום-מצב היציב נותרים כמעט ללא שינוי. בעוד שזרם מצב יציב קבוע אינו מושג מעולם, אלא בשל טעינה של הליפוזומים, הזרם הנמדד פוחת בהדרגה. ניתן לחשב את זרם הנשא מתוך הזרם המצומד הנמדד באמצעות ניתוח מעגלים.

כאן אנו מציגים תוצאות מייצגות באמצעות נשא ה-co-transporter של פרוטון וסוכר, כגון Y, בטווח pH שבין 8.5 ל-7.6. זרם הנשא נשלט על ידי תגובה אלקטרוגנית בשלב מאוחר של מחזור התגובה. בתנאים אלו, שלב ה-pre steady state מורכב מעלייה פשוטה של הזרם עד לערך ה-steady state שלו.

לאחר מכן, ערך זה דועך עקב צימוד קיבולי. אנו מעוניינים בזרם ההובלה במצב יציב. בהיעדר פוטנציאל קרומי, זרם זה מיוצג בקירוב טוב על ידי זרם השיא.

ניתן לפיכך לנתח את קינטיקת Ali Mein על ידי שרטוט זרמי השיא עבור ריכוזי סובסטרט שונים, אך יש לקחת בחשבון שניתן להשוות באופן מדויק את אמפליטודות זרם השיא רק אם הן התקבלו מחיישן בודד בניסוי אחד. סיבה אחת לכך היא השונות ביעילות הספיגה. כאשר ה-pH מופחת עוד יותר, האות המונופאזי הופך לביפאזי.

ולבסוף, נותר זרם חולף מהיר (rapid transient) עבור מוטנט lag Y עם ליקוי בהסעה. בעקבות הזרם החולף המהיר מופיע רכיב שלילי קטן ואיטי יותר. הרכיב השלילי מאפיין זרמים חולפים מהירים שנמדדים במערכות מצומדות ב-ly, והוא נגרם על ידי פריקת קיבול הממברנה.

כאן, זרם השיא אינו מייצג הובלה במצב יציב, אלא אישור אלקטרוגני של מעבר בשלב מוקדם של מחזור היונים, דבר שהופך לנראה מכיוון שמוטציה ב-lag y אינה מראה הובלה במצב יציב, ועבור lag y מסוג בר (wildtype), הובלה במצב יציב מעוכבת על ידי pH נמוך. הראיות הניסייניות מספקות פרשנות מכניסטית של העברת מטען במחזור התגובה של lag y, המוצגת במודל הקינטי. הטרנסיאנט המהיר שנצפה עבור המוטנט עם הליקוי בהובלה, או במקרה של lag Y מסוג בר בתנאים חומציים, נובע מתגובה אלקטרוגנית חלשה ומהירה בעקבות קישור לקטוז; בערכי pH גבוהים יותר, האות נשלט על ידי התגובה האלקטרוגנית העיקרית בשלב מאוחר של מחזור התגובה, אשר הוצעה כמי שמייצגת שחרור פרוטונים פסאודו-פלסמי במערכת מצומדת קיבלית.

דבר זה מוביל לזרמים חולפים המייצגים הובלה במצב יציב של Lag y עקב האינטראקציה החזקה של ה-Utes. עם ה-SSM, נוצרים ארטיפקטים חשמליים כאשר מחליפים תמיסות בעלות הרכב שונה. ודאו שתמיסות שאינן מפעילות ותמיסות מפעילות דומות ככל האפשר, במיוחד ביחס ל-pH ולחוזק היוני שלהן.

יש לבצע בקרה מכיוון שגם תסבס (substrates) עלולים ליצור ארטיפקטים. תמיד יש לבדוק את מערכת הבאפר הספציפית ואת פרוטוקול הזרימה לאיתור ארטיפקטים באמצעות ה-SSM החשוף לפני הוספת דגימת החלבון. לאחר הוספת דגימת החלבון, ניתן לבצע מדידות בקרה עם תמיסות המכילות חומרים שאינם תסבסים, אך הם דומים מבנית לתסבס.

בנוסף, קיימת אפשרות לבחון ארטיפקטים של תשתית באמצעות ליפוזומים או מקטעי ממברנה ללא החלבון הנחקר. ניתן גם להוסיף מעכבים לתמיסות או להעביר אותם בפיפט. לאחר הניסוי, יש להוסיף אותם ישירות לפתח היציאה של ה-vete כדי למדוד עיכוב של אות הנשא; במקרה זה, האותים הספציפיים לחלבון ייעלמו, וייותרו רק ארטיפקטים של החלפת תמיסות.

לאחר מכן ניתן לתקן את אות החלבון בקלות. ודאו כי אובדן של חלבון נספג, ליפוזומים או דגרדציה של חלבון אינם משפיעים על המדידה שלכם. על ידי ביצוע מדידות ביקורת חוזרות תחת תנאים זהים, דעיכת אות (signal rundown) של עד 20% היא מקובלת וניתן לתקנה בהנחה של תלות ליניארית בזמן של הדעיכה.

הגדרה זו היא תוצאה של 20 שנות פיתוח טכני במעבדה שלנו. כמו כן, קיימות מערכות ייעודיות עם פתרונות תזמון מתקדמים יותר לאנליזה קינטית וצריכת תמיסה נמוכה יותר עבור סובסטרטים יקרים. לסריקת תרופות, אנו משתמשים במערכות אוטומטיות מלאות בעלות תפוקה גבוהה יותר.

עד כה, יותר מ-20 נשאים אופיינו באמצעות שיטה זו. אלה כוללים APAs של הובלה, קומפלקסים של שרשרת הנשימה, נשאי קירור, מחליפים ואפילו תעלים של ברזל. לכן, כאשר אינכם מצליחים לפתור את הבעיה באמצעות אלקטרופיזיולוגיה סטנדרטית, שקלו להשתמש באלקטרופיזיולוגיה של SS Mase במקום זאת.