בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca 2 + ארעי וזרמים הממברנה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד מיוציטים פרוזדורים אנושיים המתאימים למדידות בו זמנית של סידן, ארעיים וזרמי ממברנה. דגימת הפרוזדורים הנכונה מתקבלת ממטופלים שעוברים ניתוח לב פתוח ומועברת במהירות כדי להתחיל בהליך. השלב הראשון בהליך הוא ניקוי הרקמה וחיתוך אותה לגושי רקמה קטנים.

השלב השני הוא עיכול אנזימטי כפול של הרקמה עם אנזימים פרוטאוליטיים וכתוצאה מכך מיוציטים פרוזדורים מבודדים. השלב האחרון כולל העמסת המיוציטים בצבע פלואורסצנטי רגיש לסידן. בסופו של דבר, השימוש המשולב במיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי וטכניקת מהדק התיקון מייצרים הקלטות בו זמנית של מעברי סידן עם זרמי ממברנה או פוטנציאל פעולה.

שיטה זו יכולה לעזור להבין את הבסיס המולקולרי של טיפול בסידן תאי הפרעות העומדות בבסיס מחלות לב כגון פרפור פרוזדורים, המדגימה את השיטה תהיה קלאודיה לירה, הטכנאית הבכירה של המעבדה שלנו, רקמת הפרוזדורים האנושית המתקבלת מחולים העוברים ניתוח לב פתוח להשתלת מעקפים כליליים, או החלפת מסתם מיטרלי צריכה להיות מועברת במהירות למעבדה בתמיסת הובלה. לאחר המעבדה, העבירו את דגימת הרקמה והתמיסה לצלחת של 10 סנטימטרים. ואז הסר בערך את רקמת השומן בעזרת מספריים.

לאחר מכן, נופף בדגימת הרקמה. שמור בין 200 ל -600 מיליגרם לבידוד התאים והקפיא את השאר בחנקן נוזלי לניתוח ביוכימי. העבירו את הרקמה לבידוד התאים לכלי של תמיסה קרירה ללא סידן וקוצצים את הרקמה לחתיכות של מילימטר מעוקב אחד כדי לשטוף את הרקמה.

העבירו אותו יחד עם התמיסה נטולת הסידן לכוס המעוטפת. מחומם ל 37 מעלות. ספק חמצן מקו המכוסה בקצה פיפטה כדי למנוע בעבוע חזק.

מערבבים את הממחטת בזהירות במשך כשלוש דקות בעזרת מוט ערבוב מגנטי. לאחר מכן הניחו לרקמה להתייצב. כעת מסננים בזהירות את הסופרנטנט דרך רשת ניילון של 200 מיקרון.

רוב הרקמה צריכה להישאר בכוס. מלאו את הכוס בתמיסה מחוממת של 37 מעלות ללא סידן. לאחר מכן החזירו את גושי הרקמה המתוחים מהרשת לכוס בעזרת מלקחיים וחזרו על הליך הכביסה פעמיים.

התחל את החלק הזה של ההליך על ידי הכנת 20 מיליליטר של תמיסת אנזים מחוממת של 37 מעלות צלזיוס E המכילה קולגנאז ופרוטאז. מסננים בזהירות את התמיסה נטולת הסידן לאחר שלב הכביסה האחרון ומשעים מחדש את הרקמה השטופה בתמיסת E one. החזירו את הרקמה שנאספה על הרשת לכוס.

מערבבים את ההשעיה בזהירות במשך 10 דקות. לאחר מכן מוסיפים 40 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי סידן כלורי, וממשיכים לערבב במשך 35 דקות. לאחר מכן, סננו את הסופרנטנט בזהירות דרך רשת ניילון.

רוב הרקמה צריכה להישאר בכוס. הכינו תמיסת אנזים של 20 מיליליטר E שתיים המכילות קולגנאז אחד בלבד, והשתמשו בה למילוי מחדש של הכוס. החזירו את הרקמה שנאספה על הרשת לכוס.

לאחר מכן הוסיפו מיד 40 מיקרוליטר של תמיסת סידן כלוריד של 10 מילי-מולרי במהלך העיכול השני, השתמשו מדי פעם במספריים כדי לקצוץ קרישי רקמות. לאחר חמש דקות, קח דגימה של התרחיף כדי לבדוק את הדיסוציאציה של התאים במיקרוסקופ. המשך לקחת דגימות כל שתיים-שלוש דקות עד שקרדיומיוציטים מפוספסים בצורת מוט נראים בבירור.

לאחר מכן הפסיקו את הערבוב, ואפשרו לרקמה להתייצב. לאחר שהתיישב, סיננו בזהירות את הסופרנטנט דרך רשת ניילון לתוך צינור פלסטיק של 50 מיליליטר. לאחר מכן, השעו את הרקמה בתמיסת אחסון של 20 מיליליטר והחזירו את גושי הרקמה המתוחים מהרשת לכוס.

לנתק עוד יותר את התאים על ידי נטייה מכנית עדינה. בעזרת פיפטה של 20 מיליליטר, נסו להימנע מהיווצרות בועות. לאחר מכן, סננו בזהירות את הסופרנטנט דרך רשת ניילון לאחר הצנטריפוגה המתאמנת, שניהם אוספים סופרנטנטים ב-90 5G למשך 10 דקות.

כדי לגלול את התאים, השליכו את הסופרנטנטים על ידי שאיפה מבלי להפריע לחזרת הכדורים. תלו כל גלולה ב -1.5 מיליליטר תמיסת אחסון בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף 7.5 מיקרוליטר של תמיסת סידן כלוריד 10 מילי-מולרית לכל צינור והמתן 10 דקות.

לאחר מכן מוסיפים עוד 7.5 מיקרוליטר סידן כלורי, ומחכים עוד 10 דקות. לאחר ההמתנה, הוסף נפח שלישי של 15 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי סידן כלורי כדי להביא את הריכוז הסופי של סידן כלורי בתמיסה ל-0.2 מילי-מולאר. מטרת בידוד זה היא להשיג תאים המתאימים למדידות סידן תוך תאיות.

לכן, זוהי דרישה קריטית להשמיט כל מאגרי סידן כגון EGGA מתמיסת האחסון. העבירו 1.5 מיליליטר מתרחיף התא לצינור מיקרו צנטריפוגה של שני מיליליטר. יש לבצע את השלבים הבאים תוך התחשבות ברגישות האור של מחוון הסידן הפלואורסצנטי.

שפעת או שלוש. ראשית, הכינו תמיסת מלאי של שפעת מילי-מולרית אחת ב-3:00 לפנות בוקר. ניתן לאחסן תמיסה זו בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד שבוע.

לאחר מכן, הוסף 15 מיקרוליטר של תמיסת מלאי שפעת הו 3:00 AM לתרחיף התאים של 1.5 מיליליטר. מערבבים את התערובת בזהירות ומדגרים את ההשעיה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בקופסה אטומה. לאחר הדגירה, צנטריפוגה קצרה של הרקמה במהירות של כ-6,000 סל"ד.

לאחר מכן השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב -1.5 מיליליטר תמיסת אמבטיה. השאירו את תרחיף התאים למשך כ-30 דקות לאסטריפיקציה לפני תחילת הניסויים. לאחר מכן המשך עם מדידות סידן פלואורסצנטיות בו זמנית של מהדק תיקון ואפי פלואורסצנטי באמצעות הפרוטוקול המתואר.

מיוציטים בודדו מרקמת פרוזדורים וכומתו בשקופית מיקרוסקופ לאיתור תאים. תפוקת התאים הממוצעת מצביעה בבירור על נטייה לירידה בתפוקת התאים בדגימות מחולים עם פרפור פרוזדורים כרוני. שפעת או שלושה מיוציטים טעונים עוררו ב-0.5 הרץ בתצורת המהדק הנוכחית כדי לעורר פוטנציאל פעולה, כ-90% מהתאים שנחקרו הראו התכווצויות קבועות.

בתגובה לגירוי זה, המעבר למיקרוסקופיה פלואורסצנטית מדמיין את פוטנציאל הפעולה המעורר שחרור סידן מהרטיקולום הסרקופלזמי, אשר יוזם את ההתכווצות התאית. הקלטות מייצגות של מטופלים עם קצב סינוסים ופרפור פרוזדורים מראות כי sr. לפוטנציאל הפעולה של המטופל יש בדרך כלל צורת ספייק וכיפה, בעוד שטריאנגולציה וקיצור פוטנציאל פעולה הם סימני היכר אופייניים לשיפוץ פרוזדורים.

בפרפור פרוזדורים, חולים שתועדו בו זמנית מעברי סידן תוך-תאיים חשפו רמות סידן דיאסטולי מוגברות ומשרעת סידן חולפת מופחתת במיוציטים מחולי פרפור פרוזדורים כדי לתעד זרמי סידן מסוג L. זרמי אשלגן נחסמו באמצעות ארבעה אמינו פרידין ובריום כלוריד. התאים עוררו ב-0.5 הרץ בתצורת מהדק מתח באמצעות פוטנציאל החזקה של מינוס 80 מילי-וולט עם רמפה של 100 מילי-שניות למינוס 40 מילי-וולט ודופק בדיקה של 100 מילי-שניות ל-10 מילי-וולט.

רישומים מייצגים מראים כי פרפור פרוזדורים קשור לזרם סידן מופחת מסוג L. שוב, רמת הסידן הדיאסטולי עלתה, בעוד שמשרעת הסידן החולפת הייתה נמוכה יותר. בפרפור פרוזדורים.

יישום איזופרן אגוניסט קולטן בטא יותרת הכליה הלא סלקטיבי הגדיל את המשרעת של זרמי סידן מסוג L וסידן ציטוזולי חולף. בשתי הקבוצות, זה מצביע על כך שלתאים יש מפל העברת אותות בטא אדרנרגי שלם. התוצאות מראות כי שיטה זו מספקת מיוציטים עמידים לסידן באיכות גבוהה, המתאימים למדידות סידן חולפות בו זמנית.

בנוסף, המיוציטים המתקבלים עשויים להיות שימושיים למדידות קיצור תאים, צביעה חיסונית או צביעת TTU.