Name: בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca 2 + ארעי וזרמים הממברנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: למדו לבודד myocytes פרוזדוריים אנושיים למדידות סימולטניות של Ca²⁺ ארעי וזרמי ממברנה. השיטה משלבת עיכול אנזימטי, צביעה פלואורסצנטית וטכניקת patch clamp לחקר פיזיולוגיה לבבית ומחלות כגון פרפורמציה פרוזדורית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

כמו כן, אנו מודים למנתחי הלב באוניברסיטת היידלברג למתן רקמת פרוזדורים אנושיים וקלאודיה Liebetrau, קטרין Kupser ורמונה נגל לקבלת התמיכה הטכנית המעולה שלהם. תודה מיוחדת גם לאנדי וו טראפורד להצעות המועילות שלו והייעוץ במהלך הקמת 2 + המדידות חולפות קליפורניה. המחברים מבקשים להביע את התודה העמוקה ביותר שלהם לחברי המחלקה לפרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה (ראש: העורבים אורסולה) מהאוניברסיטה טכנולוגית של דרזדן על ההזדמנות שהם הציעו לנו ללמוד טכניקות בסיסיות ומיומנויות בסלולריים electrophysiology ובידוד cardiomyocyte. המחקר של המחברים הוא נתמך על ידי קרן המחקר הגרמני (Do769/1-1-3), משרד הגרמני הפדרלי לחינוך ולמחקר באמצעות רשת כשירות פרפור פרוזדורים (01Gi0204) ומרכז הגרמני לחקר לב וכלי דם, איחוד האירופי באמצעות האיחוד האירופירשת ropean למחקר Translational בפרפור פרוזדורים (EUTRAF, FP7-בריאות-2010, פרויקט שילוב בקנה מידה גדול, הצעת מס &#39;261,057) והברית אירופית בצפון אמריקה פרפור פרוזדורי המחקר (ENAFRA) מתן הגט Leducq (07CVD03). הסקירה סכמטית שמוצגת בקובץ הווידאו הופקה באמצעות אמנות רפואית Servier.

פרוטוקולי ניסוי צריכים להיות מאושרים על ידי ועדת האתיקה המקומית וכל החולים צריכים לתת הסכמה מדעת בכתב. המחקר שלנו אושר על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה במנהיים, אוניברסיטת היידלברג (# 2011-216N-MA) ובוצע בהתאם לכל הנחיות מוסדיות, לאומית ובינלאומיות לרווחת אדם. כל החולים נתנו הסכמה מדעת בכתב. 0. קבלת רקמות אנושי פרוזדורים במהלך הליכי cannulation שגרתי בחולים שעברו ניתוח לב פתוח להשתלת המעקפים cardiopulmonary, קצה תוספת פרוזדורי ימין בדרך כלל להסיר ויכול לשמש לבידוד של cardiomyocytes פרוזדורים. לאחר כריתת דגימת הרקמה מועברת מייד לתוך צינור פלקון 50 מ&quot;ל עם סטרילי Ca 2 + ללא פתרון תחבורה המכיל 2,3-butanedione monoxime (טבלת I; BDM, מעכב התכווצות, מניעת ג myocyteontracture). עם זמני הובלה בין דקות 30 ו -45, שלא זיהו את יתרון ברור של קירור או חמצון ביחס לשניהם מספר והאיכות של cardiomyocytes פרוזדורים מבודד. בתחבורה בכלל למעבדה צריכה להיות מהיר ככל האפשר. עם זאת, אם לא ניתן להימנע מתחבורה זמן ארוכה יותר, תחבורה על 4 מעלות צלזיוס בפתרון חומץ עשויה להיות יתרון. 1. Prearrangements <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את thermocirculator, אשר שולט על הטמפרטורה של כוס המעייל (לוח ב &#39;). ודא שהטמפרטורה בתוך הכוס שווה 37 ° C. לכסות את הכוס עם מכסה זכוכית כדי לשמור על טמפרטורה קבועה בתוך הכוס לאורך כל תהליך הבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל אני collagenase ופרוטאז XXIV לשלוש כוסות זכוכית ולאחסן אותו בטמפרטורת חדר. האנזימים ידוללו רק לפני שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות 20 מ&quot;ל של Ca 2 + פתרון חופשי בצלחת פטרי ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">חנות 250 מ&quot;ל של Ca 2 + פתרון חופשי באמבט מים ב 37 ° C. </li></ol> 2. ניקוי של הרקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את דגימת הרקמה יחד עם פתרון התחבורה לתוך צלחת פטרי (~ קוטר 10 ס&quot;מ) ולהסיר רקמת שומן בערך באמצעות מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את דגימת הרקמה. בין 200 ל 600 מ&quot;ג משמש לבידוד בתא. הרקמה שנותרה ניתן להקפיא בחנקן נוזלי לצורך הניתוח מאוחר יותר ביוכימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את דגימת הרקמה לתוך צלחת פטרי המכילה 20 מ&quot;ל Ca 2 + פתרון חופשי על 4 מעלות צלזיוס (ראה שלב 1.3) וקוצץ את דגימת הרקמה לחתיכות קטנות של כ 1 מ&quot;מ 3 בגודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלבים הבאים צריכים להיות מוצאים להורג על 37 מעלות צלזיוס ותחת המתה בגז רציפה עם 100% O 2. קצה פיפטה ניתן להציב על צינור החמצן כדי למנוע בעבוע חזק וליצור זרימת אוויר רציפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את נתחי הרקמות יחד עם פתרון Ca 2 + ללא בלכוס ומערבבים בזהירות מעייל לכ -3 דקות עם בר בחישה מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק לבחוש ולאפשר את נתחי הרקמות להתיישב לכמה שניות. מסנן את supernatant בזהירות דרך רשת ניילון (200 מיקרומטר, לוח ב &#39;). להחזיר את נתחי רקמות המאופקים מהרשת לתוך הכוס באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את הכוס עם Ca 2 + פתרון חופשי ולחזור על שלב הכביסה 2.4 ו -2.5 פעמיים. </li></ol> 3. עיכול אנזימתי ראשון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את נתחי רקמות עם 20 מיליליטר אנזים הפתרון E1 (טבלת I) המכיל collagenase ופרוטאז ומערבבים היטב במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של 10 מ&quot;מ CaCl 2 פתרון להשיג ריכוז סופי של 20 מיקרומטר Ca 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 35 דקות מסננות את supernatant בזהירות דרך רשת ניילון (200 מיקרומטר, לוח ב &#39;) באופן שרוב גושי הרקמה יישאר בכוס. תשואת יתרירד גשם גושי רקמה מהרשת לתוך הכוס. </li></ol> 4. עיכול אנזימתי שני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את נתחי רקמות שוב עם collagenase 20 מיליליטר אנזים פתרון E2 המכיל רק אני (טבלת I). הוסף 40 μl של 10 מ&quot;מ CaCl 2 פתרון באופן מיידי כדי להשיג ריכוז סופי של 20 מיקרומטר Ca 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך שימוש במספרי העיכול השני לקצוץ נוסף קרישי רקמות מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 דקות לקחת דגימה באמצעות פיפטה פסטר כדי לבדוק את הניתוק של תאים. חזור על כל 2-3 דקות עד שזה cardiomyocytes בצורת המוט, מפוספס יופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק לבחוש ולאפשר את נתחי הרקמות להתיישב לכ 20-30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את supernatant בזהירות דרך רשת ניילון (200 מיקרומטר, לוח השני) לתוך 50 מ&quot;ל פלקון צינור (Tube). להחזיר את נתחי רקמות המאופקים מהרשת לתוך הכוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את נתחי רקמות בכוס עם 20 מ&quot;ל StoraGE הפתרון (טבלת I) 10 ועוד יותר לנתק את התאים על ידי טחינה דקה מכאנית עדינה בעזרת פיפטה סרולוגיות 20 מ&quot;ל עם מתקן. נסו להימנע מהיווצרות בועה מאז בועות משפיעות לרעה על הישרדות תא ואיכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את supernatant בזהירות דרך רשת ניילון (200 מיקרומטר, טבלה השנייה) לתוך 50 מ&quot;ל פלקון Tube (צינור B). </li></ol> 5. הכנה סופית והתאמה הסופית Ca 2 + ריכוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הן פלקון צינורות A ו-B (ראה שלב 4.5 ו -4.7) בשעה 95 XG במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant משני הצינורות בזהירות על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את שני כדורים בפתרון 1.5 מיליליטר אחסון (טבלת I) כל אחד (בטמפרטורת חדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שתי פעמים μl 7.5 מ&quot;מ של פתרון 2 10 CaCl לכל פלקון ומערבבים בזהירות. דגירה של 10 דקות לאחר כל שלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">הוסף 15 μl של פתרון 10 מ&quot;מ CaCl 2 להשיג 2 + ריכוז Ca סופי של 0.2 מ&quot;מ. </li></ol> 6. טעינה של myocytes עם פלורסנט Ca 2 + מחוון Fluo-03:00 (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 1.5 מ&quot;ל של השעיה תא (צינור ו / או צינור B) לתוך צינור microcentrifuge 2 מ&quot;ל (צינור Eppendorf). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לבצע את הפעולות הבאות בחשבון של הרגישות לאור של ניאון Ca 2 + מחוון Fluo-3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 50 מיקרוגרם של נגזר הקרום החדיר acetoxymethyl אסתר של Fluo-3 (Fluo-3 בבוקר, טבלת III) ב44 μl של Pluronic פתרון מניות ה-F-127 (טבלת III) (20% w / v בDMSO נטול מים) כדי לקבל 1 מ&quot;מ Fluo-03:00 פתרון מניות, שניתן לאחסן ב -20 ° C למשך שבוע לכל היותר 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 μl של Fluo-03:00 מניות פתרון לצינור microcentrifuge המכיל 1.5 מ&quot;ל של השעיה תא (ראה שלב 6.1) ולהתסיסבזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ההשעיה התא למשך 10 דקות בקופסה אטומה אופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה צנטריפוגות בכ -6,000 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant מחדש להשעות את גלולה בפתרון אמבטיה 1.5 מ&quot;ל (לוח ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את ההשעיה התא לכ -30 דקות לדה esterification לפני תחילת עם ניסויים. </li></ol> 7. תיקון-מהדק וepifluorescent Ca 2 + מדידות בו זמנית מאז מדידות תיקון-הידוק לא הנושא המרכזי של סקירה זו, אנו מתייחסים לקורא מעוניין לפרסומים אחרים המספקים יותר בתיאור מעמיק של טכניקה זו. 11-14 למען השלמות אנו מספקים סיכום קצר של פרוטוקול למדידה פוטנציאל פעולה או L-type Ca 2 + שני זרמים, ביחד עם 2 הקלטות בו זמנית חולפות +-CA. במהלך ניסויי myocytes הם superfused על 37 מעלות צלזיוס עם האמבטיה solutiעל לוח (IV) באמצעות מערכת טפטוף מהירה (Octaflow IITM, ALA מכשירים מדעיים, ניו יורק). עבור ניסויי מתח מהדק, K + זרמים חסומים על ידי הוספת 4-aminopyridine (5 mmol / L) וBaCl 2 (0.1 mmol / L) לפתרון האמבטיה. microelectrodes זכוכית ורוסיליקט משמש וצריך להטות התנגדויות של 2-5 MΩ כאשר התמלא פיפטה פתרון (לוח ה). בנוסף לFluo-03:00 טעינה של myocytes (ראה שלב 6), Fluo-3 כלולים גם בפתרון פיפטה (לוח ה). הקרינה היא נרגשת ב488 ננומטר ואור נפלט (&lt;520 ננומטר) יומר ל[ Ca 2 +] אני מניח <img alt="משוואת 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> כאשר k = ד ניתוק מתמיד של Fluo-3 (864 Nז), F = Fluo-3 הקרינה;. F max = Ca 2 + רווי הקרינה המתקבלת בסופו של כל ניסוי 12 שני אותות חשמליים וCa 2 + אותות epifluorescent נרשמים בו זמנית. פוטנציאל פעולה הוא גירוי ברמה של 0.5 הרץ במצב נוכחי מהדק באמצעות פולסים 1 msec הנוכחיים של כוח סף 1.2x. L-סוג Ca 2 + זרמים נמדדים במצב מתח מהדק באמצעות פוטנציאל החזקת -80 mV ורמפת דופק של 100 אלפית שנייה ל-40 mV להשבית Na המהיר + שוטף, ואחרי 100 אלפיות שנייה בדיקת דופק ל+10 mV ברמה של 0.5 הרץ.

<ol><li>Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+molecular+pathophysiology+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation.</a> J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).</li>
<li>Margaret, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsation%2C+migration+and+division+in+dissociated+chick+embryo+heart+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro.</a> Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).</li>
<li>Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+single+atrial+and+ventricular+cells+from+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+Med.+Assoc.+J%22%5BJournal%5D)">Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart.</a> Can. Med. Assoc. J. 126, 791-793 (1982).</li>
<li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-Protein+%CE%B23-subunit+825T+allele+is+associated+with+enhanced+human+atrial+inward+rectifier+potassium+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">G-Protein β3-subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents.</a> Circulation. 102, 692-697 (2000).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phosphorylation-dependent+regulation+of+constitutively+active+and+muscarinic+receptor-activated+IK%2CACh+channels+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Cardiovasc. Res. 74, 426-437 (2007).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+IK%2CACh+current+may+contribute+to+clinical+efficacy+of+class+I+and+class+III+antiarrhythmic+drugs+in+patients+with+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn.+Schmiedebergs+Arch.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation.</a> Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 381, 251-259 (2010).</li>
<li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G+protein-gated+potassium+current+IK%2CACh+is+constitutively+active+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">The G protein-gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 112, 3697-3706 (2005).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-to-right+atrial+inward+rectifier+potassium+current+gradients+in+patients+with+paroxysmal+versus+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Arrhythm.+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation.</a> Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 3, 472-480 (2010).</li>
<li>Amos, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+outward+currents+of+human+atrial+and+subepicardial+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differences between outward currents of human atrial and subepicardial ventricular myocytes.</a> J. Physiol. 491 (Pt. 1), 31-50 (1996).</li>
<li>Feng, J., Xu, D., Wang, Z., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrarapid+delayed+rectifier+current+inactivation+in+human+atrial+myocytes%3A+properties+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences.</a> Am. J. Physiol. 275, H1717-H1725 (1998).</li>
<li>Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-clamp-based+methods+for+the+detection+of+constitutively+active+acetylcholine-gated+IK%2CACh+channels+in+the+diseased+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated IK,ACh channels in the diseased heart.</a> Methods Enzymol. 484, 653-675 (2010).</li>
<li>Trafford, A. W., Diaz, M. E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca2%2B+buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+content+in+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A novel, rapid and reversible method to measure Ca2+ buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 437, 501-503 (1999).</li>
<li>Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proarrhythmic+atrial+calcium+cycling+in+the+diseased+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 740, 1175-1191 (2012).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+leak+and+increased+Na%2B-Ca2%2B+exchanger+function+underlie+delayed+afterdepolarizations+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 125, 2059-2070 (2012).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+metabolism+of+intact+muscle+cells+isolated+from+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart.</a> Circ Res. 26, 679-687 (1970).</li>
<li>Farmer, B. B., Mancina, M., Williams, E. S., Watanabe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+calcium+tolerant+myocytes+from+adult+rat+hearts%3A+review+of+the+literature+and+description+of+a+method%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description of a method.</a> Life Sci. 33, 1-18 (1983).</li>
<li>Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211, 646-647 (1966).</li>
<li>Bielecki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+changes+in+pH+of+the+perfusion+fluid+on+the+occurrence+of+the+calcium+paradox+in+the+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">The influence of changes in pH of the perfusion fluid on the occurrence of the calcium paradox in the isolated rat heart.</a> Cardiovasc. Res. 3, 268-271 (1969).</li>
<li>Kramer, J. H., Chovan, J. P., Schaffer, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+taurine+on+calcium+paradox+and+ischemic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of taurine on calcium paradox and ischemic heart failure.</a> Am. J. Physiol. 240, H238-H246 (1981).</li>
<li>Rich, T. L., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+depletion+in+rabbit+myocardium.+Calcium+paradox+protection+by+hypothermia+and+cation+substitution%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium depletion in rabbit myocardium. Calcium paradox protection by hypothermia and cation substitution.</a> Circ. Res. 51, 131-141 (1982).</li>
<li>Isenberg, G., Klockner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+tolerant+ventricular+myocytes+prepared+by+preincubation+in+a+%22KB+medium%22%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium".</a> Pflugers Arch. 395, 6-18 (1982).</li>
<li>Diaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+exogenous+calcium+buffers+on+the+systolic+calcium+transient+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes.</a> Biophys. J. 80 (01), 1915-1925 (2001).</li>
<li>Worthington, K., Worthington, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWorthington%2C+K+%22Worthington+Enzyme+Manual%22">Worthington Enzyme Manual</a>. , (1993).</li>
<li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology-specific+effects+of+the+IKur%2FIto%2FIK%2CACh+blocker+AVE0118+on+ion+channels+in+human+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pathology-specific effects of the IKur/Ito/IK,ACh blocker AVE0118 on ion channels in human chronic atrial fibrillation.</a> Br. J. Pharmacol. 154, 1619-1630 (2008).</li>
<li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+downregulation+of+G-protein-coupled+inward+rectifying+K%2B+current+IK%2CACh+in+chronic+human+atrial+fibrillation%3A+decrease+in+GIRK4+mRNA+correlates+with+reduced+IK%2CACh+and+muscarinic+receptor-mediated+shortening+of+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current IK,ACh in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials.</a> Circulation. 104, 2551-2557 (2001).</li>
<li>Hatem, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+compartments+of+sarcoplasmic+reticulum+participate+in+the+excitation-contraction+coupling+process+in+human+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Different compartments of sarcoplasmic reticulum participate in the excitation-contraction coupling process in human atrial myocytes.</a> Circ. Res. 80, 345-353 (1997).</li>
<li>Heidbuchel, H., Vereecke, J., Carmeliet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+different+potassium+channels+in+human+atrium.+Contribution+to+the+basal+potassium+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance.</a> Circ. Res. 66, 1277-1286 (1990).</li>
<li>Hove-Madsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation+is+associated+with+increased+spontaneous+calcium+release+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+human+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes.</a> Circulation. 110, 1358-1363 (2004).</li>
<li>Molina, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+adenosine+monophosphate+phosphodiesterase+type+4+protects+against+atrial+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).</li>
</ol>

וורטינגטון יוכימית קורפ נתמך פרסום זה על ידי כיסוי עלויות ייצור של קובץ וידאו. היו הממנים שום תפקיד בתכנון מחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד.

כאן אנו מתארים שיטה לבידוד של myocytes פרוזדורי אדם מנספחי פרוזדורים הנכונים שהתקבלו מחולים שעברו ניתוח לב פתוח. על מנת להשתמש בmyocytes אלה למדידות של cytosolic Ca 2 + מתאמנים שיטה שתוארה בעבר על ידי השמטת EGTA 4-11 מפתרון האחסון. כבר בשנת 1970 זה היה ציין כי למרות שmyocytes לנתק בנוכחות של Ca 2 + במהלך עיכול, כולם היו בהתכווצות ואינו בת קיימא. 16,17 לכן, בידוד תא מתבצע בCa 2 + ללא פתרון. עם זאת, מחדש המבוא של ריכוזים פיסיולוגיים של Ca 2 + הביא המהיר Ca 2 + זרם ומוות של תאים. זו תוארה כ2 + תופעת פרדוקס Ca אשר נצפתה במקור בלבבות perfused ידי צימרמן וHulsman. 18 שינויים של תקשורת הבידוד כולל הפחתה של ה-pH 7.0, &lt;sup&gt; 19 תוספת של 20 taurin או של כמויות קטנות של 2 + (ראה שלב 3.2 ו -4.1) Ca, 21 כמו גם אחסון של myocytes מבודד בEGTA המכיל אחסון פתרון 22 כבר הציע על מנת למנוע את Ca 2 + פרדוקס. 17 עם זאת, זה ידוע היטב כי Ca 2 + חציצה באמצעות EGTA מקטין את המשרעת של L-סוג Ca 2 +-Induced Ca 2 + נוכחי אמפליטודות ותוצאות בריקבון biphasic של Ca 2 + הארעיים חולפות. 23 לכן, אנו הושמטו EGTA לאורך כל תהליך הבידוד על מנת לקבל Ca 2 + ארעיים עם מאפיינים טיפוסיים והתפרקויות monophasic. כדי להגן על התאים מCa 2 + פרדוקס הגדלנו 2 + ריכוז Ca הסופי של פתרון האחסון באופן הדרגתי עד 0.2 מ&quot;מ. הבחירה של collagenase היא כנראה השלב הקריטי ביותר לבידוד myocyte מוצלח. קול קונבנציונליagenases הם הכנות גולמי המתקבלות מקלוסטרידיום histolyticum ומכיל collagenase בנוסף למספר proteinases, polysaccharidases וlipases האחרים. בהתבסס על collagenases ההרכב הכללי שלהם מחולקים לסוגים שונים. -24 סוגי collagenase ורטינגטון I ו-II היו בשימוש בהצלחה לבידודה של myocytes פרוזדורי אדם. 4-10,15,25-30 בפרוטוקול המתואר כיום אנו ממליצים על השימוש בcollagenase הקלד, למרות שהיינו גם יכול להשיג כמויות מקובלות של תאי קיימא באמצעות collagenase סוג II. עם זאת, אפילו בתוך סוג collagenase אחת יש וריאציה אצווה כדי אצווה משמעותית ביחס לפעילות האנזים. וריאציות אלו דורשות בחירה אצווה זהירה ובדיקה של קבוצות שונות כדי לייעל את הליך בידוד. הכלי אצווה בחירה זמינה באינטרנט ומורטינגטון קורפ (ביוכימית <a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / CLS / match.php) ניתן להשתמש כדי למצוא קבוצות זמינות עם הרכב שהוכח להיות מתאים לבידודה של myocytes פרוזדורי אדם. כיום אנחנו משתמשים בcollagenase הקלד עם פעילות 250 U / מ&quot;ג collagenase, פעילות 345 U / מ&quot;ג caseinase, פעילות 2.16 U / מ&quot;ג clostripain ופעילות 0.48 U / מ&quot;ג tryptic (הרבה 49H11338 #). את התאים המתקבלים באמצעות ההליך המתואר בכתב היד הזה יכולים לשמש בתוך 8 שעות ללימודי תיקון-קלאמפ, Ca 2 + מדידות חולפות, ושילוב של שניהם. 15 בנוסף, תאים אלה מאפשרים מדידות של התכווצות סלולרית בתגובה לגירוי שדה החשמלי או גירוי חשמלי באמצעות פיפטה את תיקון המהדק (תצפיות שלא פורסמו).

<html> לימוד מאפייני אלקטרו של תעלות יונים לב עם טכניקת תיקון המהדק והחקירה של הסלולר Ca 2 + מומים טיפול דורשים cardiomyocytes מבודד. אלה הם בדרך כלל מתקבלים בעקבות החשיפה במבחנה של דגימות רקמת לב לאנזימי עיכול (collagenase, hyaluronidase, peptidase וכו &#39;). מאז הדו&quot;ח הראשון של בידוד של myocytes לב קיימא בשנת 1955 2 כמות גדולה של פרוטוקולים פותחה במטרה לקצור cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים בודדים ממינים שונים, כולל עכבר, חולדה, ארנב, כלב, חזיר ואדם. בסקירה זו אנו מתמקדים בבידוד של myocytes פרוזדורי אדם. בנוגע לנהלים לבידודה של myocytes ממינים אחרים שאנחנו מתייחסים לאוכלוסיית &quot;וורטינגטון רקמות דיסוציאציה המדריך&quot; המסופק על ידי וורטינגטון יוכימית קורפ, ארה&quot;ב <a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">(www.tissuedissociation.com).</a> = &quot;Jove_content&quot;&gt; פרוטוקולי בידוד myocyte פרוזדורי אדם בדרך כלל נגזרים מהשיטה שתוארה על ידי בוסטמנטה, et al. 3 כאן אנו מספקים תיאור צעד אחר צעד של טכניקה, אשר מותאם משיטה שפורסמה בעבר, על מנת להשיג myocytes פרוזדורים מתאים לא רק לניסויי תיקון-מהדק אלא גם עבור Ca 2 + מדידות תאיות בו זמנית. 4-11

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;תמיסת העברה&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>אלבומין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>&lt;em&gt;תמיסת אחסון&lt;/em&gt;: 1%</td></tr><tr><td>BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31550</td><td>&lt;em&gt;תמיסת הובלה&lt;/em&gt;: 30</td></tr><tr><td>חומצה DL-b-הידרוקסי-בוטירית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6501</td><td>&lt;em&gt;תמיסת אחסון&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;תמיסת הובלה&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסה נטולת Ca2+&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסות אנזימים E1 ו-E2&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסת אחסון&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>חומצה L-גלוטמית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td>&lt;em&gt;תמיסת אחסון&lt;/em&gt;: 70</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;תמיסת הובלה&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסה נטולת Ca2+&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסות אנזים E1 ו-E2&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסת אחסון&lt;/em&gt;: 20</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>&lt;em&gt;תמיסת הובלה&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסה נטולת Ca2+&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסות אנזימים E1 ו-E2&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסת אחסון&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td>&lt;em&gt;תמיסת הובלה&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסה נטולת Ca2+&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסות אנזימים E1 ו-E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>&lt;em&gt;תמיסת הובלה&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסה נטולת Ca2+&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסות אנזימים E1 ו-E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;תמיסת הובלה&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסה נטולת Ca2+&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסות אנזימים E1 ו-E2&lt;/em&gt;: 100</td></tr><tr><td>טאורין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86330</td><td>&lt;em&gt;תמיסת הובלה&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסה נטולת Ca2+&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסות אנזימים E1 ו-E2&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסת אחסון&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>קולגנאז I</td><td><a href="http://www.worthington-biochem.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Worthington</a></td><td>4196</td><td>&lt;em&gt;תמיסות אנזימים E1 ו-E2&lt;/em&gt;: 286 U/ml</td></tr><tr><td>פרוטאז XXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td>&lt;em&gt;תמיסות אנזים E1 ו-E2&lt;/em&gt;5 U/ml*</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;תמיסת הובלה&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסה נטולת Ca2+&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסות אנזימים E1 ו-E2&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסת אחסון&lt;/em&gt;: 7.40</td></tr><tr><td>הותאם ל-</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;תמיסת הובלה&lt;/em&gt;NaOH בריכוז 1 M&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסה נטולת Ca2+&lt;/em&gt;1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסות אנזימים E1 ו-E2&lt;/em&gt;1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;תמיסת אחסון&lt;/em&gt;1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">הריכוזים הם ב-mM אלא אם צוין אחרת. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV כלולה בתמיסת האנזים E1 בלבד.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;טבלה I. תמיסות.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>רשת ניילון (200 &amp;#956;מ)</td><td>VWR-Germany</td><td>510-9527</td><td></td></tr><tr><td>כלי תגובה עם מעטפת (Jacketed reaction beaker)</td><td>VWR</td><td>KT317000-0050</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;טבלה II. ציוד ספציפי.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דימתיל-סולפוקסיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM (אריזה מיוחדת)</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;טבלה III. חומרים לטעינת מיוציטים ב-Fluo-3 AM.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-אמיניפירידין*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A78403</td><td>&lt;em&gt;תמיסת רחצה&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>BaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342920</td><td>&lt;em&gt;תמיסת רחצה&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>CaCl2 &amp;#215; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>&lt;em&gt;תמיסת רחצה&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;תמיסת רחצה&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;תמיסת רחצה&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;תמיסת רחצה&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>MgCl2 &amp;#215; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td>&lt;em&gt;תמיסות רחצה&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;תמיסת רחצה&lt;/em&gt;: 140</td></tr><tr><td>פרובנסיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td>&lt;em&gt;תמיסת רחצה&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;תמיסת רחצה&lt;/em&gt;: 7.35</td></tr><tr><td>כוונו באמצעות</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;תמיסת רחצה&lt;/em&gt;1 M HCl</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;טבלה IV. תמיסת רחצה עבור patch-clamp.&lt;/strong&gt; *4-aminopyridine ו-BaCl נכללו עבור ניסויי voltage-clamp בלבד.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלח K+ של DL-aspartate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2025</td><td>&lt;em&gt;שאיבת תמיסה באמצעות פיפטה&lt;/em&gt;: 92</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>&lt;em&gt;שאיבת תמיסה באמצעות פיפטה&lt;/em&gt;: 0.02</td></tr><tr><td>GTP-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td>&lt;em&gt;פפט את התמיסה&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;שאיבת תמיסה באמצעות פיפטה&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;שאיבת תמיסה באמצעות פיפטה&lt;/em&gt;: 48</td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&lt;em&gt;שאיבת תמיסה באמצעות פיפטה&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>&lt;em&gt;העברת תמיסה באמצעות פיפטה&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>Fluo-3**</td><td>Invitrogen</td><td>F3715</td><td>&lt;em&gt;פפיט את התמיסה&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>7.20</td></tr><tr><td>כוונו באמצעות</td><td></td><td></td><td>KOH בריכוז 1 M</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;טבלה V. תמיסת פיפט ל-patch-clamp*. &lt;/strong&gt;*בימי ניסוי, תמיסת הפיפטור נשמרת על קרח עד לשימוש. **בימי ניסוי, Fluo-3 מתווסף מתמיסת מלאי בריכוז של 1 mM.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ארעי וזרמים הממברנה

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

המחקר של מאפייני אלקטרו של תעלות יונים לב עם טכניקת תיקון המהדק וחקר הלב הסלולרי Ca 2 + מומים טיפול דורש cardiomyocytes מבודד. בנוסף, האפשרות לחקור myocytes מחולים תוך שימוש בטכניקות אלה היא דרישה לא יסולא בפז על מנת להבהיר את הבסיס המולקולרי של מחלות לב כגון פרפור פרוזדורים (AF). 1 כאן אנו מתארים שיטה לבידוד של myocytes פרוזדורי אדם אשר מתאימות לשניהם מחקרי תיקון-מהדק ומדידות בו זמניות של 2 + ריכוזי Ca תאיים. ראשית, נספחים פרוזדורים הנכונים שהתקבלו מחולים שעברו ניתוח לב פתוח מבותרים לחתיכות קטנות של רקמה (&quot;נתח שיטה&quot;) ורחצו בCa 2 + ללא פתרון. ואז את נתחי הרקמות מתעכלים בcollagenase ופרוטאז המכילים פתרונות עם 20 מיקרומטר Ca 2 +. לאחר מכן, myocytes המבודדים הוא הארוויsted על ידי סינון וצנטריפוגה של ההשעיה הרקמות. לבסוף, Ca 2 + הריכוז בפתרון אחסון התא מותאם לשלבי 0.2 מ&quot;מ. אנו דנים בקצרה את המשמעות של Ca 2 + וCa 2 + החציצה במהלך תהליך הבידוד וגם מספקים הקלטות מייצגות של פוטנציאל פעולה וזרמים בממברנה, שניהם בו זמנית יחד עם Ca 2 + ארעיות מדידות, שבוצע בmyocytes המבודדים אלה.

איור 2 א מציג שלוש דוגמאות מייצגות מmyocytes פרוזדורי זכויות אדם מבודד. כדי לכמת את תשואת התא אנו פיפטה μl 10 של השעיה תא (שלב 5.5) בשקופית מיקרוסקופ CellFinder <a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">(http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html).</a> תשואות ממוצעות של תא באיור 2 עולה בבירור כי קיימת נטייה לתשואות נמוכות יותר בתא הכרוני AF (CAF) דגימות חולים (שפופרת A: 16.5 ± 3.1 cells/10 μl (n = 29) לעומת 5.1 ± 2.3 cells/10 μl (N = 10) בSR וקפה, בהתאמה, p &lt;0.05; צינור B: 17.9 ± 3.9 cells/10 μl (n = 29) לעומת 5.9 ± 2.0 cells/10 μl (n = 9) בSR וקפה, בהתאמה, p = 0.107). דוגמאות מייצגות של מדידות פעולה פוטנציאליות והקלטות בו זמניות של Ca 2 + ארעיים cytosolic ניתנות באיור 3. בכ -90% מהתאים שנחקרו, tהוא פעולה ופוטנציאל, מופעל Ca 2 + שחרור גורם להתכווצויות תא ברורות וקבועות. כפי שדווח בעבר, פוטנציאל הממברנה במנוחה, אשר מהווה אינדיקטור מקובל לשלמות תא, בממוצע כ -73.9 ± 2.7 mV (n = / חולים 23/10 myocytes) ו-77.7 / חולי ± 1.8 (n = 19/8 myocytes mV ) בSR וCAF בהתאמה (p &lt;0.05). 15 איור 4 מראה הקלטות בו זמנית יציגים של מתח מגודרת סוג L-Ca 2 + הזרמים וCytosolic Ca 2 + ארעיים. יישום של isoprenaline אגוניסט β-adrenoceptor לא סלקטיבי (1 מיקרומטר) מגדיל אמפליטודות של שניהם אני Ca, L ו cytosolic Ca 2 + ארעיים, המצביע על מפל הולכים אותות β-adrenergic ללא פגע. <img alt="איור 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> F1 igure. תרשים זרימה של myocytes Fluo-03:00 טעינת פרוטוקול (ראה שלב 6.1-6.5). M / V, מסה / נפח. <img alt="איור 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> איור 2. A, myocytes מבודד אדם נכון פרוזדורים לאחר שעה אחת בפתרון אחסון. B, ממוצע ± SEM של תשואת התא נספרת ב10 μl של תאים בפתרון אחסון (ראה שלב 5.5). N מתייחס למספר של הכנות בתוך כל קבוצה. * P &lt;0.05. <img alt="איור 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> הקלטות נציג איור 3. של פעולה ופוטנציאל אצבע קל על הדק Ca 2 + ארעיים (CAT) בmyocyte פרוזדורים מקצב סינוס וChrחולה פרפור פרוזדורי onic. למעלה: הזריק קרום נוכחי (אני מ &#39;) המשמש לגירוי (0.5 הרץ). להלן: הקלטה בו זמנית של פוטנציאל הממברנה (V ז), וחתול מופעל (תחתון). (Replotted באישור וויגט et al. 2012) 15 <img alt="איור 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> הקלטות נציג איור 4. של האפקט (1 מיקרומטר) isoprenaline על סוג L-Ca 2 + נוכחי אצבע קל על ההדק Ca 2 + ארעיים (CAT) בmyocyte פרוזדורים מקצב סינוס ומטופל פרפור פרוזדורים כרוני. למעלה: מתח מהדק פרוטוקול (0.5 הרץ). להלן: הקלטה בו זמנית של קרום נטו נוכחי (אני מ &#39;), המשקף בעיקר סוג L-Ca 2 + חתול נוכחי (באמצע) והפעיל (תחתון). (Replotted באישור וויגט,et al. 2012) 15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="טבלת 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> פתרונות I. טבלה. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="טבלה 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> טבלה השנייה. ציוד ספציפי. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="טבלה 3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> לוח ג. חומרים לטעינה של myocytes עם Fluo-3 PM. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="טבלה 4" fo:conteNT-width = &quot;2.5in&quot; עבור: src = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot; /&gt; לוח ד. פתרון אמבט לתיקון מהדק. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="טבלה 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> טבלת פתרון V. פיפטה לתיקון מהדק *.

אנו מתארים את בידודו של myocytes פרוזדורי אדם אשר יכול לשמש לתאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; מדידות בשילוב עם לימודי תיקון-מהדק אלקטרו.

בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ארעי וזרמים הממברנה

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד מיוציטים אטריאליים אנושיים המתאימים למדידות סימולטניות של תנודות סידן וזרמי ממברנה. הדגימה מהעליה הימנית מופקת מחולים העוברים ניתוח לב פתוח ומועברת במהירות כדי להתחיל בפרוצדורה. השלב הראשון של הפרוצדורה הוא ניקוי הרקמה וחיתוכה לחתיכות רקמה קטנות.השלב השני הוא עיכול אנזימטי כפול של הרקמה באמצעות אנזימים פרוטאוליטיים, המוביל לבידוד של מיוציטים עליים (atrial myocytes). השלב הסופי כולל טעינה של המיוציטים בצבע פלואורסצנטי הרגיש לסידן. בסופו של דבר, השימוש המשולב במיקרוסקופיה פלואורסצנטית-אפי (epi fluorescence microscopy) ובטכניקת ה-patch clamp מאפשר הקלטה סימולטנית של תנודות סידן (calcium transients) יחד עם זרמי ממברנה או פוטנציאלי פעולה.שיטה זו יכולה לסייע בהבנת הבסיס המולקולרי של הפרעות בניהול הסידן התאי העומדות בבסיס מחלות לב, כגון פרפוריות עליות; את השיטה תדגים קלאודיה לירה, הטכנאית הבכירה במעבדתנו. רקמת עליות לב אנושית שהושגה ממטופלים שעברו ניתוח לב פתוח למעקף מסלולים כליליים או להחלפת מסתם מיטראלי, צריכה להיות מועברת במהירות למעבדה בתוך תמיסת הובלה. עם ההגעה למעבדה, העבירו את דגימת הרקמה ואת התמיסה לצלחית של 10 סנטימטרים. לאחר מכן, הסירו בקירוב את רקמת השומן באמצעות מספריים.בשלב הבא, שקלו את דגימת הרקמה. שמרו בין 200 ל-600 milligrams עבור בידוד התאים והקפיאו את השאר בחנקן נוזלי לצורך אנליזה ביוכימית. העבירו את הרקמה המיועדת לבידוד תאים לצלחית המכילה תמיסה קרה נטולת סידן וקצצו את הרקמה לקוביות של one cubic millimeter כדי לשטוף את הרקמה.העבר זאת יחד עם התמיסה נטולת הסידן לכוס הביקר המעטפת. חמם ל-37 °C. ספק חמצן מקו הסנקה הסגור עם קצה פיפטה כדי למנוע בעבוע חזק.ערבבו את הרקמה בזהירות במשך כשלושה דקות בעזרת מוט ערבוב מגנטי. לאחר מכן, המתינו עד שהרקמה תשקע. כעת, סננו בזהירות את הנוזל העליון דרך רשת ניילון של 200 מיקרון.רוב הרקמה צריכה להישאר בכלי. מלאו מחדש את הכלי בתמיסה נטולת סידן מחוממת ל-37 מעלות. לאחר מכן, העבירו את חלקי הרקמה המסוננים מהרשת חזרה אל הכלי באמצעות פינצטה וחזרו על הליך השטיפה פעמיים.התחילו חלק זה של הפרוצדורה על ידי הכנת 20 milliliters של תמיסת אנזים E one מחוממת בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, המכילה collagenase ו-protease. סננו בזהירות את התמיסה נטולת הסידן לאחר שלב השטיפה הסופי, והשאיבו מחדש את הרקמה השטופה בתוך תמיסת E one. החזירו את הרקמה שנאספה על הרשת אל הכלי.ערבבו את התרחיף בזהירות למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 40 µL של calcium chloride בריכוז 10 mM, והמשיכו לערבב למשך 35 דקות. לאחר מכן, סננו את הנוזל העליון בזהירות דרך רשת ניילון.מרבית הרקמה צריכה להישאר בכלי. הכין 20 milliliters של תמיסת אנזים E two המכילה collagenase one בלבד, והשתמש בה כדי למלא מחדש את הכלי. העבר את הרקמה שנאספה על הרשת בחזרה אל הכלי.לאחר מכן, הוסיפו מיד 40 µL של תמיסת calcium chloride בריכוז 10 mM במהלך העיכול השני, והשתמשו מדי פעם במספריים כדי לקצץ קשרי רקמה. לאחר חמש דקות, קחו דגימה מהסספנסיה כדי לבדוק את הדיסוציאציה של התאים תחת מיקרוסקופ. המשיכו לדגום מדי שתיים עד שלוש דקות עד שייראו בבירור cardiomyocytes מפוספסים בצורת מוט.לאחר מכן הפסיקו את הערבוב כדי לאפשר לרקמה לשקוע. לאחר השקיעה, סננו בזהירות את הנוזל העליון דרך רשת ניילון אל תוך מבחנה פלסטית של 50 milliliter. לאחר מכן, השעיו את הרקמה ב-20 milliliters של תמיסת אחסון והחזירו את נתחי הרקמה המסוננים מהרשת אל הכלי.בצע הפרדה נוספת של התאים באמצעות תנועה מכנית עדינה. בעת השימוש בפיפטה של 20 milliliter, השתדל למנוע היווצרות בועות. לאחר מכן, סנן בזהירות את העלייה דרך רשת ניילון; לאחר הסינון, סבב במערך צנטריפוגה את שתי דגימות העלייה במהירות של 90 5G למשך 10 דקות.כדי לשקע את התאים, השליכו את העל-נוזלים באמצעות שאיבה מבלי להפריע למשקע. השעיקו כל משקע ב-1.5 milliliters של תמיסת אחסון בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 7.5 microliters של תמיסת calcium chloride בריכוז 10 millimolar לכל מבחנה והמתינו 10 דקות.לאחר מכן, הוסיפו 7.5 µL נוספים של calcium chloride, והמתינו 10 דקות נוספות. לאחר ההמתנה, הוסיפו נפח שלישי של 15 µL של calcium chloride בריכוז 10 millimolar, כדי להביא את הריכוז הסופי של calcium chloride בתמיסה ל-0.2 millimolar. מטרת בידוד זה היא להשיג תאים המתאימים למדידות סידן תוך-תאיות.לפיכך, קיים דרישה קריטית להשמיט כל תמיסות בופר של סידן, כגון EGGA, מתמיסת האחסון. העבירו 1.5 milliliters של תמיחת התאים לתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר. יש לבצע את השלבים הבאים תוך התחשבויות ברגישות לאור של אינדיקטור הסידן הפלואורסצנטי.FluO-3. ראשית, הכינו תמיסת סטוק של FluO-3 בריכוז 1 mM. ניתן לשמור תמיסה זו בטמפרטורה של 20°C- למשך עד שבוע.בשלב הבא, הוסיפו 15 µL מתמיסת המלאי של ה-flu oh 3:00 AM לתליה של 1.5 mL של התרחיף התאי. ערבבו את התערובת בעדינות והדגירו את התרחיף למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בתוך קופסה אטומה לאור. לאחר ההדגרה, סובבו את הרקמה קצרות בצנטריפוגה במהירות של כ-6,000 RPM.לאחר מכן השליכו את הנוזל העליון ותלו את המשקע ב-1.5 milliliters של תמיסת רחצה. השאירו את תרחיף התאים למשך כ-30 דקות לצורך d esterification לפני תחילת הניסויים. לאחר מכן המשיכו במדידות סימולטניות של patch clamp ושל סידן באמצעות פלואורסצנציה אפי-פלואורסצנטית (epi fluorescent) בהתאם לפרוטוקול המתואר.מיוציטים בודדו מרקמת עליות ונספרו באמצעות שקופית של מיקרוסקופ cell finder. תנובתי התאים הממוצעת מעידה בבירור על נטייה לתנובת תאים נמוכה יותר בדגימות של מטופלים עם פרפור פרוזדורים כרוני. מיוציטים הטעונים ב-Flu oh three עברו גרייה בתדר של 0.5 hertz בתצורת current clamp כדי לעורר פוטנציאלי פעולה; כ-90% מהתאים שנבדקו הראו התכווצויות סדירות.בתגובה לגירוי זה, המעבר למיקרוסקופיית פלואורסצנציה ממחיש את שחרור הסידן מהרשת הסרקופלזמית שמוגמר על ידי פוטנציאל הפעולה, דבר אשר יוזם את התכווצות התא. הקלטות מייצגות ממטופלים עם קצב סינוס ופרפור פרוזדורי מראות כי לפוטנציאלי פעולה של מטופלים יש בדרך כלל צורה של קוץ וכיפה, בעוד שטרנגולציה וקיצור של פוטנציאל הפעולה הם סימנים אופייניים לשחזור פרוזדורי (atrial remodeling).במטופלים עם פרפור פרוזדורים, הקלטה סימולטנית של תנודות סידן תוך-תאיות חשפה רמות סידן דיאסטוליות מוגברות ואמפליטודה מופחתת של תנודות הסידן במיוציטים ממטופלים עם פרפור פרוזדורים, לצורך הקלטת זרמי סידן מסוג L. זרמי אשלגן נחסמו באמצעות four amino paridine ובריום כלוריד. התאים עברו גרייה בתדר של 0.5 hertz בתצורת voltage clamp תוך שימוש בפוטנציאל החזקה של 80- millivolts, עם ramp של 100 milliseconds ל-40- millivolts ופולס בדיקה של 100 milliseconds ל-10 millivolts.הקלטות מייצגות מראות כי פרפור פרוזדורים מקושר להפחתה בזרם סידן מסוג L. שוב, רמת הסידן הדיאסטולית הייתה מוגברת, בעוד שאמפליטודת הטרנזיינט של הסידן הייתה נמוכה יותר. בפרפור פרוזדורים.יישום האיסופרן, אגוניסט לא סלקטיבי של קולטן בטא אדרנרגי, העלה את האמפליטודות של זרמי סידן מסוג L ואת תנודת הסידן הציטוזולית. בשתי הקבוצות, הדבר מעיד על כך שהתאים בעלי שרשרת העברה של אותים בטא-אדרנרגית תקינה. התוצאות מראות כי שיטה זו מספקת מיוציטים בעלי עמידות גבוהה לסידן, המתאימים למדידות סימולטניות של patch clamp ותנודות סידן.בנוסף, המיוציטים שהתקבלו עשויים להיות שימושיים למדידות של קיצור תאים, לצביעה אימונית או לצביעת TTU.

isolation-human-atrial-myocytes-for-simultaneous-measurements-ca2

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Kv ערוץ התפקוד קשור הפרעות בקצב לב. על מנת לחקור את המנגנונים המולקולריים שיובילו להפרעות קצב כאלה אנו מנצלים פרוטוקול שיטתי לבידודה של cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים מעכברי KV ערוץ נלווה למקטע בנוקאאוט. cardiomyocytes המבודד יכול מייד לאחר מכן לשמש למחקרים אלקטרו סלולריים, (IF) מבחנים ביוכימיים או immunofluorescence.

בידוד והקלטות בערוץ KV בcardiomyocytes פרוזדורים וחדרית Murine

ידע הנוכחי על הבסיס התאי של מחלות לב בעיקר מסתמך על מחקרים במודלים של בעלי חיים. כאן אנו מתארים ולאמת שיטה חדשה להשיג cardiomyocytes קיימא אחת מדגימות ניתוחיות קטנות של שריר הלב חדרית האנושי. myocytes חדרית האנושי יכול לשמש למחקרי אלקטרו ובדיקות סמים.

בידוד ואפיון פונקציונלי של אדם חדרית שריר לב מדוגמאות כירורגי טריות

שיטות הם הפגינו לבידוד של מיוציטים צומת sinoatrial (Sams) מעכברים בוגרים ללימודי electrophysiology צמד תיקון או הדמיה. תאים מבודדים ניתן להשתמש ישירות או יכול להישמר בתרבות להתיר ביטוי של חלבונים של עניין, כגון עיתונאים מקודדים גנטית.

שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים

פרוטוקול זה מתאר הערכת אלקטרופיזיולוגיות אטריה מאתר ניצול מערכת מיפוי אופטי עם הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית רזולוציה גבוהה, כולל הקלטות כפולה של מתח הממברנה, Ca2 + חולף תחת מתוכנת גירוי דרך קטטר אלקטרודה מיוחדת.

אלקטרופיזיולוגיות להערכת אטריה מאתר עם מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה

כאן, אנו מתארים הליך ממוטבת, המבוססים על Langendorff על בידודו של תא בודד cardiomyocytes פרפור ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר. תקנה ידנית בלחץ intraluminal של חללים לב מיושם להניב המתאימים עירור-התכווצות-מצמד לימודי תקין מבחינה פונקציונלית נייטרלים.

בידוד של פרפור Cardiomyocytes ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר

הפרוטוקול הזה משמש כדי לבודד פרפור לב בודד מהלב של העכבר המבוגר באמצעות הגישה העיכול קטע. גישה זו משמשת כדי לבודד את הפרפור הימני או השמאלי, שניתן להשתמש בו כדי לאפיין את פרפור מיציט אלקטרופיזיולוגיה במחקרים הדבקת מהדק.

בידוד של פרפור מיוציטים מעכברים למבוגרים

מוצג הוא פרוטוקול לבידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים ובעלי חיים מפרוסות שריר הלב לחתוך vibratome. תפוקות גבוהות של תאים סובלניים סידן (עד 200 תאים / מ"ג) ניתן להשיג כמויות קטנות של רקמה (&lt;50 מ"ג). הפרוטוקול ישים על שריר הלב החשוף לאישמיה קרה עד 36 שעות.

בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך

שיטה מתוארת לבידוד בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים הן מהאטיה והן מחדרי הלב של עכבר בוגר יחיד. פרוטוקול זה מביא לתשואות עקביות של מיוציטים לבביים ברי קיימא מאוד ולא מיוציטים ומפרט תנאי תרבות אופטימליים ספציפיים לתאים עבור פנוטיפים וניתוח במבחנה.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

מודלים עכבריים מאפשרים ללמוד מנגנוני מפתח של arrhythmogenesis. לשם כך, קרדיומיוציטים באיכות גבוהה נחוצים לביצוע מדידות מהדק תיקון. כאן מתוארת שיטה לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, המאפשר מדידות בו זמנית של סידן חולף וזרם סידן מסוג L.

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

פרוטוקול זה מתאר שינויים בשיטת לנגנדורף כולל עומק שינון אבי העורקים לבידוד סימולטני של מיוציטים מפרזדורים חדריים מעכברים בוגרים.

שינויים בשיטת לנגנדורף לבידוד סימולטני של מיוציטים מפרשים בוגרים

למדו לבודד myocytes פרוזדוריים אנושיים למדידות סימולטניות של Ca²⁺ ארעי וזרמי ממברנה. השיטה משלבת עיכול אנזימטי, צביעה פלואורסצנטית וטכניקת patch clamp לחקר פיזיולוגיה לבבית ומחלות כגון פרפורמציה פרוזדורית.

בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca

גלה סרטונים נוספים