בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד מיוציטים אטריאליים אנושיים המתאימים למדידות סימולטניות של תנודות סידן וזרמי ממברנה. הדגימה מהעליה הימנית מופקת מחולים העוברים ניתוח לב פתוח ומועברת במהירות כדי להתחיל בפרוצדורה. השלב הראשון של הפרוצדורה הוא ניקוי הרקמה וחיתוכה לחתיכות רקמה קטנות.

השלב השני הוא עיכול אנזימטי כפול של הרקמה באמצעות אנזימים פרוטאוליטיים, המוביל לבידוד של מיוציטים עליים (atrial myocytes). השלב הסופי כולל טעינה של המיוציטים בצבע פלואורסצנטי הרגיש לסידן. בסופו של דבר, השימוש המשולב במיקרוסקופיה פלואורסצנטית-אפי (epi fluorescence microscopy) ובטכניקת ה-patch clamp מאפשר הקלטה סימולטנית של תנודות סידן (calcium transients) יחד עם זרמי ממברנה או פוטנציאלי פעולה.

שיטה זו יכולה לסייע בהבנת הבסיס המולקולרי של הפרעות בניהול הסידן התאי העומדות בבסיס מחלות לב, כגון פרפוריות עליות; את השיטה תדגים קלאודיה לירה, הטכנאית הבכירה במעבדתנו. רקמת עליות לב אנושית שהושגה ממטופלים שעברו ניתוח לב פתוח למעקף מסלולים כליליים או להחלפת מסתם מיטראלי, צריכה להיות מועברת במהירות למעבדה בתוך תמיסת הובלה. עם ההגעה למעבדה, העבירו את דגימת הרקמה ואת התמיסה לצלחית של 10 סנטימטרים. לאחר מכן, הסירו בקירוב את רקמת השומן באמצעות מספריים.

בשלב הבא, שקלו את דגימת הרקמה. שמרו בין 200 ל-600 milligrams עבור בידוד התאים והקפיאו את השאר בחנקן נוזלי לצורך אנליזה ביוכימית. העבירו את הרקמה המיועדת לבידוד תאים לצלחית המכילה תמיסה קרה נטולת סידן וקצצו את הרקמה לקוביות של one cubic millimeter כדי לשטוף את הרקמה.

העבר זאת יחד עם התמיסה נטולת הסידן לכוס הביקר המעטפת. חמם ל-37 °C. ספק חמצן מקו הסנקה הסגור עם קצה פיפטה כדי למנוע בעבוע חזק.

ערבבו את הרקמה בזהירות במשך כשלושה דקות בעזרת מוט ערבוב מגנטי. לאחר מכן, המתינו עד שהרקמה תשקע. כעת, סננו בזהירות את הנוזל העליון דרך רשת ניילון של 200 מיקרון.

רוב הרקמה צריכה להישאר בכלי. מלאו מחדש את הכלי בתמיסה נטולת סידן מחוממת ל-37 מעלות. לאחר מכן, העבירו את חלקי הרקמה המסוננים מהרשת חזרה אל הכלי באמצעות פינצטה וחזרו על הליך השטיפה פעמיים.

התחילו חלק זה של הפרוצדורה על ידי הכנת 20 milliliters של תמיסת אנזים E one מחוממת בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, המכילה collagenase ו-protease. סננו בזהירות את התמיסה נטולת הסידן לאחר שלב השטיפה הסופי, והשאיבו מחדש את הרקמה השטופה בתוך תמיסת E one. החזירו את הרקמה שנאספה על הרשת אל הכלי.

ערבבו את התרחיף בזהירות למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 40 µL של calcium chloride בריכוז 10 mM, והמשיכו לערבב למשך 35 דקות. לאחר מכן, סננו את הנוזל העליון בזהירות דרך רשת ניילון.

מרבית הרקמה צריכה להישאר בכלי. הכין 20 milliliters של תמיסת אנזים E two המכילה collagenase one בלבד, והשתמש בה כדי למלא מחדש את הכלי. העבר את הרקמה שנאספה על הרשת בחזרה אל הכלי.

לאחר מכן, הוסיפו מיד 40 µL של תמיסת calcium chloride בריכוז 10 mM במהלך העיכול השני, והשתמשו מדי פעם במספריים כדי לקצץ קשרי רקמה. לאחר חמש דקות, קחו דגימה מהסספנסיה כדי לבדוק את הדיסוציאציה של התאים תחת מיקרוסקופ. המשיכו לדגום מדי שתיים עד שלוש דקות עד שייראו בבירור cardiomyocytes מפוספסים בצורת מוט.

לאחר מכן הפסיקו את הערבוב כדי לאפשר לרקמה לשקוע. לאחר השקיעה, סננו בזהירות את הנוזל העליון דרך רשת ניילון אל תוך מבחנה פלסטית של 50 milliliter. לאחר מכן, השעיו את הרקמה ב-20 milliliters של תמיסת אחסון והחזירו את נתחי הרקמה המסוננים מהרשת אל הכלי.

בצע הפרדה נוספת של התאים באמצעות תנועה מכנית עדינה. בעת השימוש בפיפטה של 20 milliliter, השתדל למנוע היווצרות בועות. לאחר מכן, סנן בזהירות את העלייה דרך רשת ניילון; לאחר הסינון, סבב במערך צנטריפוגה את שתי דגימות העלייה במהירות של 90 5G למשך 10 דקות.

כדי לשקע את התאים, השליכו את העל-נוזלים באמצעות שאיבה מבלי להפריע למשקע. השעיקו כל משקע ב-1.5 milliliters של תמיסת אחסון בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 7.5 microliters של תמיסת calcium chloride בריכוז 10 millimolar לכל מבחנה והמתינו 10 דקות.

לאחר מכן, הוסיפו 7.5 µL נוספים של calcium chloride, והמתינו 10 דקות נוספות. לאחר ההמתנה, הוסיפו נפח שלישי של 15 µL של calcium chloride בריכוז 10 millimolar, כדי להביא את הריכוז הסופי של calcium chloride בתמיסה ל-0.2 millimolar. מטרת בידוד זה היא להשיג תאים המתאימים למדידות סידן תוך-תאיות.

לפיכך, קיים דרישה קריטית להשמיט כל תמיסות בופר של סידן, כגון EGGA, מתמיסת האחסון. העבירו 1.5 milliliters של תמיחת התאים לתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר. יש לבצע את השלבים הבאים תוך התחשבויות ברגישות לאור של אינדיקטור הסידן הפלואורסצנטי.

FluO-3. ראשית, הכינו תמיסת סטוק של FluO-3 בריכוז 1 mM. ניתן לשמור תמיסה זו בטמפרטורה של 20°C- למשך עד שבוע.

בשלב הבא, הוסיפו 15 µL מתמיסת המלאי של ה-flu oh 3:00 AM לתליה של 1.5 mL של התרחיף התאי. ערבבו את התערובת בעדינות והדגירו את התרחיף למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בתוך קופסה אטומה לאור. לאחר ההדגרה, סובבו את הרקמה קצרות בצנטריפוגה במהירות של כ-6,000 RPM.

לאחר מכן השליכו את הנוזל העליון ותלו את המשקע ב-1.5 milliliters של תמיסת רחצה. השאירו את תרחיף התאים למשך כ-30 דקות לצורך d esterification לפני תחילת הניסויים. לאחר מכן המשיכו במדידות סימולטניות של patch clamp ושל סידן באמצעות פלואורסצנציה אפי-פלואורסצנטית (epi fluorescent) בהתאם לפרוטוקול המתואר.

מיוציטים בודדו מרקמת עליות ונספרו באמצעות שקופית של מיקרוסקופ cell finder. תנובתי התאים הממוצעת מעידה בבירור על נטייה לתנובת תאים נמוכה יותר בדגימות של מטופלים עם פרפור פרוזדורים כרוני. מיוציטים הטעונים ב-Flu oh three עברו גרייה בתדר של 0.5 hertz בתצורת current clamp כדי לעורר פוטנציאלי פעולה; כ-90% מהתאים שנבדקו הראו התכווצויות סדירות.

בתגובה לגירוי זה, המעבר למיקרוסקופיית פלואורסצנציה ממחיש את שחרור הסידן מהרשת הסרקופלזמית שמוגמר על ידי פוטנציאל הפעולה, דבר אשר יוזם את התכווצות התא. הקלטות מייצגות ממטופלים עם קצב סינוס ופרפור פרוזדורי מראות כי לפוטנציאלי פעולה של מטופלים יש בדרך כלל צורה של קוץ וכיפה, בעוד שטרנגולציה וקיצור של פוטנציאל הפעולה הם סימנים אופייניים לשחזור פרוזדורי (atrial remodeling).

במטופלים עם פרפור פרוזדורים, הקלטה סימולטנית של תנודות סידן תוך-תאיות חשפה רמות סידן דיאסטוליות מוגברות ואמפליטודה מופחתת של תנודות הסידן במיוציטים ממטופלים עם פרפור פרוזדורים, לצורך הקלטת זרמי סידן מסוג L. זרמי אשלגן נחסמו באמצעות four amino paridine ובריום כלוריד. התאים עברו גרייה בתדר של 0.5 hertz בתצורת voltage clamp תוך שימוש בפוטנציאל החזקה של 80- millivolts, עם ramp של 100 milliseconds ל-40- millivolts ופולס בדיקה של 100 milliseconds ל-10 millivolts.

הקלטות מייצגות מראות כי פרפור פרוזדורים מקושר להפחתה בזרם סידן מסוג L. שוב, רמת הסידן הדיאסטולית הייתה מוגברת, בעוד שאמפליטודת הטרנזיינט של הסידן הייתה נמוכה יותר. בפרפור פרוזדורים.

יישום האיסופרן, אגוניסט לא סלקטיבי של קולטן בטא אדרנרגי, העלה את האמפליטודות של זרמי סידן מסוג L ואת תנודת הסידן הציטוזולית. בשתי הקבוצות, הדבר מעיד על כך שהתאים בעלי שרשרת העברה של אותים בטא-אדרנרגית תקינה. התוצאות מראות כי שיטה זו מספקת מיוציטים בעלי עמידות גבוהה לסידן, המתאימים למדידות סימולטניות של patch clamp ותנודות סידן.

בנוסף, המיוציטים שהתקבלו עשויים להיות שימושיים למדידות של קיצור תאים, לצביעה אימונית או לצביעת TTU.