ניתוח מחזור תא חי של

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את שלב מחזור התא היחסי וגודל התא של רקמות עם אוכלוסיות תאים שעברו מניפולציה גנטית ומתויגות עם GFP או RFP בדרוזופילה. ראשית, הגדר צלבים גנטיים ליצירת תאים המכילים צאצאים המסומנים בחלבונים הפלואורסצנטיים הרצויים ועם המניפולציות הגנטיות הרצויות ברקמה או באוכלוסיית תאים ספציפית. במחקר יש לבודד בצורה נקייה את הרקמה הרצויה מהצאצאים של שלב ההתפתחות הנכון, ואז לפרק את הרקמה לתרחיף תא בודד ולהכתים בצבע DNA בר-קיימא כדי למדוד את תכולת ה-DNA.

נתח את הדגימות המופרכות המוכתמות על ידי ציטומטריית זרימה. בסופו של דבר, תוצאות in vivo מודדות שינויים בגודל התא ובשלב מחזור התא הנגרמים על ידי המניפולציות הגנטיות הנחקרות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת של זרימה ציטומטרית על רקמות דרוזופילה חיות באמצעות צבעים אולטרה סגולים הוא שהצבע הסגול של מחזור הצבע תואם לציטומטרים זולים יותר המכילים לייזר סגול 4 0 5, אותו ניתן לרכוש בתקציב קטן ולתחזק בקנה מידה מעבדתי יחיד.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחזור התא על ידי מתן מידע מפורט יותר על שלב מחזור התא וגודל התא שהוא מפורט יותר מאשר רק מדידת גודל הרקמה הכולל וקצב ההתפשטות. ידגימו את ההליך קאגל ודן סאן, סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי ואולגה גוקו. הטכנאי שלנו אסוף זחלים בוגרים בכוכב הזחל השלישי כ-110 עד 120 שעות לאחר הטלת הביצים לנתיחות הזחלים.

שלב אישון מדויק חיוני למחקרים במהלך המטמורפוזה לקציר זה לפני גולם לבן בתחילת המטמורפוזה במידת הצורך, אני מסה אטום צלחת פטרי של גור או בקבוקון זחלים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס כדי להפעיל את החום. בסיס הפוך של צ'אק לשיבוטים של מעקב אחר שושלת. לאחר פתיחת צלחת הפטרי, הניחו אותה באינקובטור להזדקנות לשלב ההתפתחותי הרצוי לדיסקציה של האישונים.

אחוז בעדינות בגולם בקצה הקדמי של מארז האישון שבו יש בועת אוויר כדי למנוע נזק לגולם בפנים, מקם את הגולם הצף לאחיזה נכונה. לאחר מכן, בעזרת מספריים מיקרו, חתכו בצורה נקייה את הקצה האחורי של הגולם בזווית קלה לכיוון החלק הגבי של החיה כדי לשחרר את הלחץ הפנימי מבלי לאלץ את השומן ההיסטי לרקמות הרצויות בבית החזה ולחתוך את הראש בזהירות לאורך החציון הגבי, תוך הימנעות מפגיעה בכנפיים ושטיפה של קומפלקס המוח של העין הקדמית כדי להסיר את השומן שלו. לאחר מכן הסר את האישון ממארז האישון על ידי אחיזה בקצה האחורי של אפידרמיס האישון בעזרת מלקחיים ומשיכתו החוצה מבית האישון.

מעבירים את הגולם המנותח לכלי חיתוך נקי. תקעו חור קטן בציפורן הקדמית לקומפלקס מוח העין בעזרת מלקחיים. בעזרת פיפטת פסטי זכוכית עם נורת גומי.

שטפו בעדינות את תמיסת דיסקציה PBS דרך הגולם המנותח חלקית כדי להסיר את כל השומן שנותר ורקמת המעיים שלו. כדי להשיג את כנפי האישון, החזיקו את הגולם בראש בעזרת מלקחיים אחד באמצעות מלקחיים שני. אחוז בקצה האחורי ביותר של ציפורן הכנף, משוך ועקור אותו מהצד של הפגר.

לאחר מכן חתכו או משכו את הכנף בציר כדי להסיר אותה מהגוף והניחו אותה בערימה הרחק מהפגרים וחומרים אחרים כדי להשיג את האישון, העיניים או המוח. שטפו את הגולם עד שתסביך מוח העין נעקר והשתחרר מהגולם. בעזרת מלקחיים, משוך בעדינות את עין האישון מהמוח ושמור את הרקמה הרצויה בעזרת פיפטה משומנת, העבירו בזהירות את הרקמות המנותחות.

דגרו את הצינורות עם ניעור ב-23 מעלות צלזיוס ב-500 סל"ד למשך 70 דקות. לאחר מכן מערבולת בעדינות במשך חמש שניות במהירות בינונית ומחזירים את הדגימות לשייקר למשך 15 עד 20 דקות נוספות. וורטקס דוגמת פעם נוספת למשך חמש שניות במהירות בינונית עבור המוח ועיני האישון.

ישן יותר מ-36 שעות. PF מנתק רקמות בתמיסת כתם DNA ב-23 מעלות צלזיוס ב-500 סל"ד למשך 45 עד 60 דקות. לאחר מכן בזה אחר זה מנתקים ידנית גושי רקמה גדולים על ידי העברה לצלחת ניתוח יחד עם כ-50 מיקרוליטר של תמיסת כתם DNA.

פיפטה במהירות למעלה ולמטה עם משיכה ידנית מעבר לפיפטה שלך של פתח של כ-100 עד 150 מיקרומטר. אסוף את הדגימות המנותקות בצינור של חמישה מיליליטר. דגירה של 30 דקות נוספות ב-23 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-500 סל"ד.

ודא חזותית שהדגימות מנותקות לחלוטין. מודע לכך שציפורן כנף האישון השקופה הא-תאית לא תשתייך. התחל את ניתוח הפקס על ידי טעינת הדגימה על הציטומטר.

לאחר מכן בחר ערוצים לזיהוי פיזור קדימה ופיזור צדדי המציין את גודל התא ומורכבות הממברנה. כדי לזהות את הצביעה הסגולה של מחזור D של ה- DNA, תצטרך למדוד VL גובה, רוחב ושטח אחד מעירור לייזר סגול. בחר גם את ערוץ הלייזר הכחול אזור אחד למדידת הקרינה של GFP.

לניתוח RFP, אנו משתמשים בערוץ הלייזר הכחול שלוש. ערוץ זה בכוונון מותאם לזיהוי RFP. הגדר את השערים על מנת להגביל את הניתוח לאוכלוסייה שנבחרה ולהגביל פסולת ולמכור גושים מהניתוח שמייצר חלקות עצירה עם שער אחד, לא לכלול פסולת וגושים בחלקה של SSC לעומת FSC בחלקה של VL אזור אחד לעומת VL אחד עם שימוש ב-GA שניים כדי לא לכלול תאים לא מוכתמים תת-G אחד תאים אפופטוטיים וגושי תאים על סמך זיהוי סינגלים.

GA 3 מקיף תאים בתוך שערים 1 ו-2 שהם GFP שלילי בתרשים הקרינה לעומת תכולת ה-DNA המבוססת על גובה VE L אחד. ההליכה הבאה ארבע מקיפה תאים בתוך שערים 1 ו-2 שהם חיוביים ל-GFP בתרשים הקרינה לעומת תכולת ה-DNA. אפשר גם ליצור שערים חמש ושש מתרשימי נקודות בגודל תא כפי שנמדד על ידי GFP לעומת פיזור קדימה.

כדי לבחון את שלב מחזור התא, השתמש בשתי ההיסטוגרמות המתווים את תכולת ה-DNA על ציר ה-x וספירת התאים ב-Y ais עבור האוכלוסיות המוגדרות על ידי שער שלוש ושער ארבע. עבור גודל התא, היסטוגרמות מגדירות אוכלוסיות לשערים חמש ושש ומתווים FSC על ציר x וספירות על ציר Y בעת הפעלת דגימות מגדירים את ההקלטה לעצירה ב-10,000. אירועים חיוביים של GFP קבעו גם את נפח הרכישה ל-300 מיקרוליטר.

הגדרות הסף והמתח המתאימות כלולות בתבניות המסופקות. הפעל את הדגימות ברגישות סטנדרטית או גבוהה של 100 מיקרוליטר לדקה והקלט. קבצי הנתונים המוקלטים שנוצרו על ידי תוכנת Attune הם בפורמט FCS, התואם לרוב תוכנות הדוגמנות של מחזור התא.

סביבת עבודה מייצגת זו המכילה ארבע עלילות נקודות ושתי היסטוגרמות מציגה דגימת כנף זחל המבטאת GFP ו-Cyclin D בכנף האחורית, מונעת על ידי טרנסגן Grailed gal four. תרשים הנקודה הראשון של גודל התא עם הליכה אחת אינו כולל פסולת וגושים. תרשים הנקודות השני מפלה סינגלים עם הליכה שתיים כדי לא לכלול תאים לא מוכתמים תת G 1D NA וגושים בעלילה של GFP לעומת תוכן DNA.

ניתן להבחין בין התאים השליליים והחיוביים של GFP וניכר שניים וארבעה תכולת NDNA על סמך המיקום לאורך ציר ה-x. תרשים זה של גודל התא כפי שנמדד על ידי GFP לעומת פיזור קדימה משמש ליצירת שערים חמש ושש. הניתוחים המתקבלים מובילים להיסטוגרמות של תכולת ה-DNA לעומת ספירות עבור האוכלוסייה השלילית GFP או RFP כמו גם תאים חיוביים ל-GFP או RFP.

שימוש בתבנית ה-RFP המצורפת. תוצאות דומות מתקבלות עם אותו סוג רקמה ודפוס ביטוי. עבור RFP, התבניות והמתחים המסופקים מתאימים לניתוח של עיני זחל, מוח וכנפיים, כמו גם עיני אישון, מוח וכנפיים.

בתוכנה המכוונת. שימוש בתכונת קנה המידה האוטומטי עבור מחזור התא או היסטוגרמות גודל התא מאפשר לקבוע את המקסימום הגלובלי עבור כל אוכלוסייה. פרופילי מחזור תאים אלה מייצגים תאים חיוביים ושליליים של GFP בעיני הזחל המבטאים GFP בחלק האחורי.

באמצעות ארבעת הטרנסגנים U-A-S-G-F-P של GMR GAL, שכבת העל חושפת את ההבדלים בשלבים של מחזור התא של התאים המבטאים GFP האחוריים. ניתן גם לשרטט את השינוי היחסי בגודל התא בין תאים חיוביים ושליליים של GFP. פרופיל מחזור התא הזה נגזר ממוח האישונים ב-46 שעות A PF. התאים החיוביים ל-GFP הם שיבוטים של מעקב אחר שושלת המבטאים את הרגולטור G one S, ציקלין D ו-E שני F, המשבשים את השקט ומובילים לכניסה לשלב S.

זאת בניגוד לתאים שליליים של GFP שאינם מבטאים שבשלב זה נעצרים בדרך כלל. ב-G one, תוכנת attune מייצרת אזורים מוגדרים על ידי המשתמש בהיסטוגרמות, ותוחמים G אחד s ו-G שני פאזות. טבלת סטטיסטיקה עבור כל ריצה קובעת את הספירה המוחלטת של תאים בתוך האזורים והאחוזים המוגדרים על-ידי המשתמש.

לחלופין, ניתן להשתמש בתוכנת מידול כגון mod fit כדי להעריך אחוזים בכל שלב כמו גם תאים אפופטוטיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולתייג מספר רקמות מדרוזופילה לניתוח מחזור התא.