Name: ניתוח מחזור תא חי של דרוזופילה רקמות באמצעות התמקדות Cytometer אקוסטית לכוונן וה-DNA ויולט Vybrant DyeCycle כתם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: למדו לנתח מחזור תא חי ברקמות דרוזופילה באמצעות ציטומטריה זרימה עם צביעת DNA חיה. שיטה זו מאפשרת מדידה בו-זמנית של גודל תאים, תוכן DNA ומעקב אחר תאים מסומנים בפלואורסצנטיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאאידה דה לה קרוז לפיתוח והוראת הפרוטוקול המקורי לגרסה זו מבוססת 10. לעבוד במעבדה Buttitta נתמך על ידי מענק NIH GM086517.

<ol><li>Nunez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+measurement+and+cell+cycle+analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Issues+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).</li>
<li>Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+content+histogram+and+cell-cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA content histogram and cell-cycle analysis.</a> Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).</li>
<li>Ashburner, M., Roote, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila%3A+the+laboratory+setup%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila: the laboratory setup.</a> CSH Protoc. , pdb ip34(2007).</li>
<li>del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+tools+for+gene+expression+and+clonal+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila.</a> Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+Drosophila%3A+a+fly+geneticist%27s+Swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li>
<li>McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+gene+expression+targeting+with+the+TARGET+and+gene-switch+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila.</a> Sci STKE. 2004, pl6(2004).</li>
<li>Calvi, B. R., Lilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+BrdU+labeling+and+nuclear+flow+sorting+of+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary.</a> Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).</li>
<li>Bjorklund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+pathways+regulating+cell+size+and+cell-cycle+progression+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi.</a> Nature. 439, 1009-1013 (2006).</li>
<li>Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+and+cell+division+in+the+Drosophila+wing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing.</a> Cell. 93, 1183-1193 (1998).</li>
<li>de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of Drosophila cells.</a> Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).</li>
<li>Reis, T., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+dE2F1+by+cyclin-dependent+kinases+controls+cell+cycle+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing.</a> Cell. 117, 253-264 (2004).</li>
<li>Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycling+and+patterned+cell+proliferation+in+the+Drosophila+wing+during+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).</li>
<li>Schubiger, M., Palka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+spatial+patterns+of+DNA+replication+in+the+developing+wing+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila.</a> Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3B+A+laboratory+handbook%22">Drosophila; A laboratory handbook</a>. , Cold Spring Harbor Press. (1989).</li>
<li>Theodosiou, N. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+FLP%2FFRT+system+to+study+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of FLP/FRT system to study Drosophila development.</a> Methods. 14, 355-365 (1998).</li>
<li>On-line Protocols of Protistology Workshop 2005 at The Marine Biological Laboratory [Internet]. , Woods Hole, M.A. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://starcentral.mbl.edu/eutree_workshop/protistiary/protocols/protocols_pipette.htm">http://starcentral.mbl.edu/eutree_workshop/protistiary/protocols/protocols_pipette.htm</a> (2005).</li>
<li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li>
<li>Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P.H+Exit+from+mitosis+in+Drosophila+syncytial+embryos+requires+proteolysis+and+cyclin+degradation%2C+and+is+associated+with+localized+dephosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation.</a> Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר ניתוח של מחזור התא, גודל תא יחסי ומספר תא היחסי ברקמות חיים תסיסנית בשלבי התפתחות שונים. כאשר ניתוח זה הוא בשילוב עם ביטוי תא מסוג מסוים חלבון פלואורסצנטי או שושלת התחקות, ניתן לקבל מידע מפורט על תגובות הסלולר מחזור תא דיסקרטי או הפרעות צמיחה. כהוכחה של עיקרון, אנחנו שיבשו קפאון במוח זבוב גלמי בהבעת רגולטורים מחזור תא G1-S בשיבוטי תא שכותרתו GFP, מה שמוביל לשכפול הדנ&quot;א חריג בשלב ההתפתחותי שבי תאי מוח הם בדרך כלל מעל 90% G1 נעצר (איו...

cytometry הזרימה יכול לשמש למדידות של כדאיות תא, גודל תא יחסי, תוכן ה-DNA וביטוי חלבון פלואורסצנטי באוכלוסיות תאים חיים. עקב השכפול של ה-DNA הגרעיני במהלך השלב-S, מידע על תוכן ה-DNA באוכלוסייה של תאים יכולים לשמש כדי להסיק אחוזים יחסית בשלבי מחזור תא שונים 1-3. שיטה זו הפכה לאבן פינה של ניתוח מחזור תא במערכות מודל משמרים ליונקים. זבוב פירות תסיסנית הפכה מערכת מודל מצוינת לניתוחים גנטיים בvivo של ויסות מחזור תא. הכלים הגנטיים הנרחבים הזמינים בזבובים לאפשר למניפולציות רקמה אלגנטית ספציפיות ומוסדרות באופן זמני של רגולטורים מחזור תא יחד עם בשושלת מבוססת חלבון פלואורסצנטי vivo התחקות 4-6. cytometry הזרימה נעשה שימוש כדי ללמוד תוכן ה-DNA במספר סוגי תאים תסיסנית, כולל endoreplicating תאים ותאים בתרבית mitotic 7,8. מקדמה חשובה במחקרי vivo מחזור התא נעשתה על ידי דה לה קרוז ואדגר, עם הפיתוח של פרוטוקול לניתוח תזרים cytometric של חיות דיפלואידים תסיסנית דיסקים דמותי 9,10, פרוטוקול בו נעשה שימוש והותאם על ידי מעבדות רבות. טכניקה זו, כאשר בשילוב עם גנטי בשושלת vivo מעקב דרך ביטוי חלבון פלואורסצנטי מושרה וסימון רקמות ספציפי, מאפשרת לאדם לקבל מידע על השפעות המניפולציה גנטיות בזמן הכפלת תא כללי, גודל תא ולקבוע את עיתוי מדויק של שלבי מחזור תא in vivo 9 , 11. אולם שיטה זו הסתמכה עד כה על השימוש בצבע תא ה-DNA intercalating החדיר Hoechst 33342 להכתים ולכמת-DNA בתאים חיים, שהגביל את המשתמשים לזרום cytometers עם לייזר UV מסוגל המרגש לצבוע Hoechst. אלה נמצאים בדרך כלל רק בממיינים (כלומר BD FACS VantaGE, BD FACSAria) או יקרות ססגוניות benchtop מערכות (כלומר BD LSR), תמיכה בדרך כלל המחייב ידי מתקני גרעין זרימה מוסדיים. יש לנו שונה בפרוטוקול מבוסס Hoechst להשתמש לצבוע DNA לחיות תאים חדשים מInvitrogen, Vybrant DyeCycle יולט. צבע זה תואם לייזר ננומטר 405 סגול, נפוץ יותר בנתחים קטנים יותר המעבדתיים וזמין במנתח benchtop עצמאי הקטן, אקוסטית לכוונן התמקדות Cytometer. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לניתוח מחזור תא שיכול להיות בשילוב עם סוג התא, גודל תא, מספר תאים וניתוח שושלת במגוון רחב של רקמות דרוזופילה במהלך שלבים שונים של פיתוח באמצעות יולט DyeCycle ולכוונן. פרוטוקול זה מרחיב את מספר cytometers המתאים לניתוח כזה עם רקמות תסיסנית ומספק דוגמאות כיצד ניתן לשנות סוג של ניתוח מחזור תא חי זה לסוגי רקמות נוספים ושלבי התפתחות.

<table><tbody><tr><td>12x75 מ"מ פוליסטירן עגול-תחתון 5 מ"ל מבחנה </td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td>צינורות 5 מ"ל</td></tr><tr><td>Attune מיקוד אקוסטי</td><td>טכנולוגיות חיים / תצורת Applied Biosystems</td><td>4445315</td><td>כחול / סגול</td></tr><tr><td>Attune Cytometer Software (גרסה 1.2.5)</td> <td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td><td>Free</td><td>PC בלבד</td></tr><tr><td>Attune חרוזי מעקב אחר ביצועים (5 x 106 חרוזים/מ"ל) </td><td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td><td>4449754</td><td>למבחן ביצועים יומיומי</td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים Inox </td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>צלחות עובר 30 מ"מ x 12 מ"מ </td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>70543-30</td><td>כלי חיתוך זכוכית </td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>022670051</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין-EDTA (10x)</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&#252; מספריים אביב bingen </td><td>כלי מדע עדינים</td><td>15003-08</td><td>ישר 5 מ"מ קצה חיתוך </td></tr><tr><td>Vybrant DyeCycle סגול</td><td>כתמים טכנולוגיות חיים/ Invitrogen</td><td>V35003</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">טבלה 1. ריאגנטים ומכשירים נדרשים.</td></tr><tr><td colspan="4">תמיסת כתמי DNA חיה (10 מ"ל): 1 מ"ל 10X Ca2+ Mg2+ ללא PBS (pH7.2) 9 מ"ל 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 5 &mu; l Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (שימו לב שזהו פי 0.25 מהריכוז המומלץ לתאי יונקים. אנו מוצאים שריכוזים גבוהים יותר רעילים לתאי Drosophila). 10X Ca2+ Mg2+ PBS חופשי (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 מ"מ KCl, 100 מ"מ Na2HPO4 (דו-בסיסי), 20 מ"מ KH2PO4 (monobasic) מותאם ל-pH 7.2 </td></tr><tr><td colspan="4"><table border="1"> <tbody> <tr> <td> </td> <td>FSC</td> <td>SSC</td> <td>BL1</td> <td>VL1</td> </tr> <tr> <td>סף (x1000)</td> <td>100</td> <td>10</td> <td>10</td> <td>10</td> </tr> <tr> <td>מתח (mV)</td> <td>2950</td> <td>4250</td> <td>1800</ td> <td>1150</td> </tr> </tbody> </table> טבלה 2. הגדרת סף ומתח עבור הניתוח באיור 2.</חזק></td></tr></tbody></table>

ניתוח מחזור תא חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות באמצעות התמקדות cytometer אקוסטית לכוונן וה-dna ויולט vybrant dyecycle כתם

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

cytometry הזרימה כבר בשימוש נרחב כדי להשיג מידע על תוכן ה-DNA באוכלוסייה של תאים, כדי להסיק אחוזים יחסית בשלבי מחזור תא שונים. טכניקה זו הורחבה בהצלחה לרקמות mitotic של מודל אורגניזם תסיסנית למחקרים גנטיים של ויסות מחזור תא בגוף חי. בשילוב עם ביטוי תא מסוג מסוים חלבון פלואורסצנטי ומניפולציות גנטיות, ניתן לקבל מידע מפורט על השפעות על מספר תאים, גודל תא ומחזור תא הדרגת in vivo. עם זאת שיטה לחיות תאים זו הסתמכה על השימוש בצבע התא חדיר Hoechst 33342-DNA intercalating, הגבלת משתמשי cytometers זרימה המצוידים בלייזר UV. יש לנו שונה בפרוטוקול זה כדי להשתמש בצבע חדש יותר לחיות תאי ה-DNA, ויולט DyeCycle Vybrant, תואם עם לייזר 405nm הסגול הנפוץ יותר. הפרוטוקול המובא כאן מאפשר ניתוח מחזור תא יעיל בשילוב עם תאסוג, גודלו היחסי של תאים ומידע מספר תא, במגוון רחב של רקמות תסיסנית. פרוטוקול זה מרחיב את הטכניקה שימושית במחזור תא הניתוח לרקמות תסיסנית למנתח benchtop קטן, Cytometer ההתמקדות אקוסטית לכוונן, אשר ניתן להפעיל ומתוחזק בקנה מידת מעבדה אחת.

תרשים 2 מציג תוצאות עבור נציג אגף מדגם הזחל, להביע GFP במחצית האחורית של הרקמה, תוך שימוש בתבנית ה-GFP סיפק. תוצאות דומות מתקבלות עם אותו סוג הרקמה ודפוס ביטוי למכרז באמצעות סיפק RFP התבנית (איור 3 א). את התבניות שסופקו והמתחים (טבלה 2) מתאימות לניתוח עיני זחל (איור 3), מוח וכנפיים, כמו גם עיניים גלמי, מוח (איור 3D) וכנפיים. Histograms של גודל תא יחסי הניתן על ידי קשירת קשר FSC לאוכלוסיות בשערי 5 ו 6 גם יכול להיות...

פרוטוקול לניתוח של מחזור תא חי<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות באמצעות התמקדות Cytometer אקוסטית לכוונן מתוארת. פרוטוקול זה בו זמנית מספק מידע על גודל תא יחסי, מספר תא, ה-DNA ותוכן סוג התא דרך שושלת התחקות או ביטוי רקמות ספציפי של חלבוני ניאון<em&gt; In vivo</em&gt;.

ניתוח מחזור תא חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות באמצעות התמקדות Cytometer אקוסטית לכוונן וה-DNA ויולט Vybrant DyeCycle כתם

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את שלב מחזור התא היחסי וגודל התא של רקמות עם אוכלוסיות תאים שעברו מניפולציה גנטית ומתויגות עם GFP או RFP בדרוזופילה. ראשית, הגדר צלבים גנטיים ליצירת תאים המכילים צאצאים המסומנים בחלבונים הפלואורסצנטיים הרצויים ועם המניפולציות הגנטיות הרצויות ברקמה או באוכלוסיית תאים ספציפית. במחקר יש לבודד בצורה נקייה את הרקמה הרצויה מהצאצאים של שלב ההתפתחות הנכון, ואז לפרק את הרקמה לתרחיף תא בודד ולהכתים בצבע DNA בר-קיימא כדי למדוד את תכולת ה-DNA.נתח את הדגימות המופרכות המוכתמות על ידי ציטומטריית זרימה. בסופו של דבר, תוצאות in vivo מודדות שינויים בגודל התא ובשלב מחזור התא הנגרמים על ידי המניפולציות הגנטיות הנחקרות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת של זרימה ציטומטרית על רקמות דרוזופילה חיות באמצעות צבעים אולטרה סגולים הוא שהצבע הסגול של מחזור הצבע תואם לציטומטרים זולים יותר המכילים לייזר סגול 4 0 5, אותו ניתן לרכוש בתקציב קטן ולתחזק בקנה מידה מעבדתי יחיד.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחזור התא על ידי מתן מידע מפורט יותר על שלב מחזור התא וגודל התא שהוא מפורט יותר מאשר רק מדידת גודל הרקמה הכולל וקצב ההתפשטות. ידגימו את ההליך קאגל ודן סאן, סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי ואולגה גוקו. הטכנאי שלנו אסוף זחלים בוגרים בכוכב הזחל השלישי כ-110 עד 120 שעות לאחר הטלת הביצים לנתיחות הזחלים.שלב אישון מדויק חיוני למחקרים במהלך המטמורפוזה לקציר זה לפני גולם לבן בתחילת המטמורפוזה במידת הצורך, אני מסה אטום צלחת פטרי של גור או בקבוקון זחלים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס כדי להפעיל את החום. בסיס הפוך של צ'אק לשיבוטים של מעקב אחר שושלת. לאחר פתיחת צלחת הפטרי, הניחו אותה באינקובטור להזדקנות לשלב ההתפתחותי הרצוי לדיסקציה של האישונים.אחוז בעדינות בגולם בקצה הקדמי של מארז האישון שבו יש בועת אוויר כדי למנוע נזק לגולם בפנים, מקם את הגולם הצף לאחיזה נכונה. לאחר מכן, בעזרת מספריים מיקרו, חתכו בצורה נקייה את הקצה האחורי של הגולם בזווית קלה לכיוון החלק הגבי של החיה כדי לשחרר את הלחץ הפנימי מבלי לאלץ את השומן ההיסטי לרקמות הרצויות בבית החזה ולחתוך את הראש בזהירות לאורך החציון הגבי, תוך הימנעות מפגיעה בכנפיים ושטיפה של קומפלקס המוח של העין הקדמית כדי להסיר את השומן שלו. לאחר מכן הסר את האישון ממארז האישון על ידי אחיזה בקצה האחורי של אפידרמיס האישון בעזרת מלקחיים ומשיכתו החוצה מבית האישון.מעבירים את הגולם המנותח לכלי חיתוך נקי. תקעו חור קטן בציפורן הקדמית לקומפלקס מוח העין בעזרת מלקחיים. בעזרת פיפטת פסטי זכוכית עם נורת גומי.שטפו בעדינות את תמיסת דיסקציה PBS דרך הגולם המנותח חלקית כדי להסיר את כל השומן שנותר ורקמת המעיים שלו. כדי להשיג את כנפי האישון, החזיקו את הגולם בראש בעזרת מלקחיים אחד באמצעות מלקחיים שני. אחוז בקצה האחורי ביותר של ציפורן הכנף, משוך ועקור אותו מהצד של הפגר.לאחר מכן חתכו או משכו את הכנף בציר כדי להסיר אותה מהגוף והניחו אותה בערימה הרחק מהפגרים וחומרים אחרים כדי להשיג את האישון, העיניים או המוח. שטפו את הגולם עד שתסביך מוח העין נעקר והשתחרר מהגולם. בעזרת מלקחיים, משוך בעדינות את עין האישון מהמוח ושמור את הרקמה הרצויה בעזרת פיפטה משומנת, העבירו בזהירות את הרקמות המנותחות.דגרו את הצינורות עם ניעור ב-23 מעלות צלזיוס ב-500 סל"ד למשך 70 דקות. לאחר מכן מערבולת בעדינות במשך חמש שניות במהירות בינונית ומחזירים את הדגימות לשייקר למשך 15 עד 20 דקות נוספות. וורטקס דוגמת פעם נוספת למשך חמש שניות במהירות בינונית עבור המוח ועיני האישון.ישן יותר מ-36 שעות. PF מנתק רקמות בתמיסת כתם DNA ב-23 מעלות צלזיוס ב-500 סל"ד למשך 45 עד 60 דקות. לאחר מכן בזה אחר זה מנתקים ידנית גושי רקמה גדולים על ידי העברה לצלחת ניתוח יחד עם כ-50 מיקרוליטר של תמיסת כתם DNA.פיפטה במהירות למעלה ולמטה עם משיכה ידנית מעבר לפיפטה שלך של פתח של כ-100 עד 150 מיקרומטר. אסוף את הדגימות המנותקות בצינור של חמישה מיליליטר. דגירה של 30 דקות נוספות ב-23 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-500 סל"ד.ודא חזותית שהדגימות מנותקות לחלוטין. מודע לכך שציפורן כנף האישון השקופה הא-תאית לא תשתייך. התחל את ניתוח הפקס על ידי טעינת הדגימה על הציטומטר.לאחר מכן בחר ערוצים לזיהוי פיזור קדימה ופיזור צדדי המציין את גודל התא ומורכבות הממברנה. כדי לזהות את הצביעה הסגולה של מחזור D של ה- DNA, תצטרך למדוד VL גובה, רוחב ושטח אחד מעירור לייזר סגול. בחר גם את ערוץ הלייזר הכחול אזור אחד למדידת הקרינה של GFP.לניתוח RFP, אנו משתמשים בערוץ הלייזר הכחול שלוש. ערוץ זה בכוונון מותאם לזיהוי RFP. הגדר את השערים על מנת להגביל את הניתוח לאוכלוסייה שנבחרה ולהגביל פסולת ולמכור גושים מהניתוח שמייצר חלקות עצירה עם שער אחד, לא לכלול פסולת וגושים בחלקה של SSC לעומת FSC בחלקה של VL אזור אחד לעומת VL אחד עם שימוש ב-GA שניים כדי לא לכלול תאים לא מוכתמים תת-G אחד תאים אפופטוטיים וגושי תאים על סמך זיהוי סינגלים.GA 3 מקיף תאים בתוך שערים 1 ו-2 שהם GFP שלילי בתרשים הקרינה לעומת תכולת ה-DNA המבוססת על גובה VE L אחד. ההליכה הבאה ארבע מקיפה תאים בתוך שערים 1 ו-2 שהם חיוביים ל-GFP בתרשים הקרינה לעומת תכולת ה-DNA. אפשר גם ליצור שערים חמש ושש מתרשימי נקודות בגודל תא כפי שנמדד על ידי GFP לעומת פיזור קדימה.כדי לבחון את שלב מחזור התא, השתמש בשתי ההיסטוגרמות המתווים את תכולת ה-DNA על ציר ה-x וספירת התאים ב-Y ais עבור האוכלוסיות המוגדרות על ידי שער שלוש ושער ארבע. עבור גודל התא, היסטוגרמות מגדירות אוכלוסיות לשערים חמש ושש ומתווים FSC על ציר x וספירות על ציר Y בעת הפעלת דגימות מגדירים את ההקלטה לעצירה ב-10,000. אירועים חיוביים של GFP קבעו גם את נפח הרכישה ל-300 מיקרוליטר.הגדרות הסף והמתח המתאימות כלולות בתבניות המסופקות. הפעל את הדגימות ברגישות סטנדרטית או גבוהה של 100 מיקרוליטר לדקה והקלט. קבצי הנתונים המוקלטים שנוצרו על ידי תוכנת Attune הם בפורמט FCS, התואם לרוב תוכנות הדוגמנות של מחזור התא.סביבת עבודה מייצגת זו המכילה ארבע עלילות נקודות ושתי היסטוגרמות מציגה דגימת כנף זחל המבטאת GFP ו-Cyclin D בכנף האחורית, מונעת על ידי טרנסגן Grailed gal four. תרשים הנקודה הראשון של גודל התא עם הליכה אחת אינו כולל פסולת וגושים. תרשים הנקודות השני מפלה סינגלים עם הליכה שתיים כדי לא לכלול תאים לא מוכתמים תת G 1D NA וגושים בעלילה של GFP לעומת תוכן DNA.ניתן להבחין בין התאים השליליים והחיוביים של GFP וניכר שניים וארבעה תכולת NDNA על סמך המיקום לאורך ציר ה-x. תרשים זה של גודל התא כפי שנמדד על ידי GFP לעומת פיזור קדימה משמש ליצירת שערים חמש ושש. הניתוחים המתקבלים מובילים להיסטוגרמות של תכולת ה-DNA לעומת ספירות עבור האוכלוסייה השלילית GFP או RFP כמו גם תאים חיוביים ל-GFP או RFP.שימוש בתבנית ה-RFP המצורפת. תוצאות דומות מתקבלות עם אותו סוג רקמה ודפוס ביטוי. עבור RFP, התבניות והמתחים המסופקים מתאימים לניתוח של עיני זחל, מוח וכנפיים, כמו גם עיני אישון, מוח וכנפיים.בתוכנה המכוונת. שימוש בתכונת קנה המידה האוטומטי עבור מחזור התא או היסטוגרמות גודל התא מאפשר לקבוע את המקסימום הגלובלי עבור כל אוכלוסייה. פרופילי מחזור תאים אלה מייצגים תאים חיוביים ושליליים של GFP בעיני הזחל המבטאים GFP בחלק האחורי.באמצעות ארבעת הטרנסגנים U-A-S-G-F-P של GMR GAL, שכבת העל חושפת את ההבדלים בשלבים של מחזור התא של התאים המבטאים GFP האחוריים. ניתן גם לשרטט את השינוי היחסי בגודל התא בין תאים חיוביים ושליליים של GFP. פרופיל מחזור התא הזה נגזר ממוח האישונים ב-46 שעות A PF. התאים החיוביים ל-GFP הם שיבוטים של מעקב אחר שושלת המבטאים את הרגולטור G one S, ציקלין D ו-E שני F, המשבשים את השקט ומובילים לכניסה לשלב S.זאת בניגוד לתאים שליליים של GFP שאינם מבטאים שבשלב זה נעצרים בדרך כלל. ב-G one, תוכנת attune מייצרת אזורים מוגדרים על ידי המשתמש בהיסטוגרמות, ותוחמים G אחד s ו-G שני פאזות. טבלת סטטיסטיקה עבור כל ריצה קובעת את הספירה המוחלטת של תאים בתוך האזורים והאחוזים המוגדרים על-ידי המשתמש.לחלופין, ניתן להשתמש בתוכנת מידול כגון mod fit כדי להעריך אחוזים בכל שלב כמו גם תאים אפופטוטיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולתייג מספר רקמות מדרוזופילה לניתוח מחזור התא.

live-cell-cycle-analysis-drosophila-tissues-using-attune-acoustic

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

קביעת המיקום של מחזור התא אוכלוסייה של תאים, או להבין כיצד להשפיע על התפשטות אותות, ניתן למדוד בקלות על ידי זרימת cytometry בפרוטוקול זה. אנו מדווחים על גישה ניסויית פשוטה מכתים תאים לכימות עמדתם מחזור התא.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

Kinetochore שם SAC יוזם האות שלה ניטור הפרדה mitotic של chromatids אחותו. השיטה מתוארת לדמיין את גיוס מחזור של אחד החלבונים kinetochore ותיאום עם תנועה...

לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים סינסיציאלי

מסמך זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ confocal סריקה מהירה לתמונת התנהגות תא ישירות דרך הגולם. מאת עוזב את המקרה גלמי שלם, שיטה זו מאפשרת תצפית ומדידה של תהליכים בתא דינמיים בשלב של פיתוח דרוזופילה שקשה ללמוד באופן ישיר.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

צביעה חיסונית היא טכניקה יעילה להמחשת סוגי תאים וחלבונים ספציפיים בתוך רקמות. על ידי שימוש בסוניקציה, הפרוטוקול המתואר כאן מקל על הצורך לנתח רקמות Drosophila melanogaster מעוברים וזחלים בשלב מאוחר לפני צביעה חיסונית. אנו מספקים מתודולוגיה יעילה לצביעה חיסונית של זחלי הר שלמים קבועים בפורמלדהיד.

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות<em&gt; באתר</em

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

חטיבות התא ניתן לדמיין בזמן אמת באמצעות חלבונים מתויגים פלואורוסקופים ומיקרוסקופ זמן לשגות. בעזרת הפרוטוקול המוצג כאן, המשתמשים יכולים לנתח את דינמיקת התזמון של החטיבה הסלולרית, הרכבת הmitotic צירים והפרדה בין כרומוזום ובידוד. פגמים באירועים אלה בעקבות הפרעות RNA (RNAi)-תיווך גנים הסתרה ניתן להעריך ולכמת.

שימוש ב- Drosophila ילה S2 תאים עבור הדמיה חיה של חטיבת התא

פרוטוקול זה מיועד הדמיה וניתוח של הדינמיקה של כיוון התאים ואת צמיחת רקמות בתוך הבטן הדרוזולה epithelia כמו זבוב הפרי עובר מטמורפוזה. המתודולוגיה המתוארת כאן ניתנת להחלה על חקר שלבים, רקמות ומבנים תת-סלולאריים שונים בדרוזופילה או באורגניזמים אחרים במודל.

הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

המטרה של פרוטוקול זה היא לנתח את חלוקת התא ברקמה שלמה על ידי מיקרוסקופ התאים החיים והקבוע באמצעות דרוסוילה מיוטיק מאיוציטים. הפרוטוקול מדגים כיצד לבודד את כל האשכים שלמים, מזחלים מדרוזופילה ומהגלמים המוקדמים, וכיצד לעבד ולטעון אותם למיקרוסקופיה.

הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

ניתוח מחזור התא עם תיוג 5-אתניל-2'-deoxyuridine (EdU) ו פוספו-histone H3 (pH3) הוא הליך רב-שלבי שעשוי לדרוש אופטימיזציה נרחבת. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את כל השלבים עבור הליך זה כולל ניתוח תמונה וכימות כדי להבחין בין תאים בשלבי מחזור תאים שונים.

5-אתניל-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 פרוטוקול תיוג כפול לניתוח התקדמות מחזור התא בתאי גזע עצביים Drosophila

למדו לנתח מחזור תא חי ברקמות דרוזופילה באמצעות ציטומטריה זרימה עם צביעת DNA חיה. שיטה זו מאפשרת מדידה בו-זמנית של גודל תאים, תוכן DNA ומעקב אחר תאים מסומנים בפלואורסצנטיות.

ניתוח מחזור תא חי של

גלה סרטונים נוספים