חיזוי מבנה המשני RNA באמצעות SHAPE תפוקה גבוהה

המטרה הכוללת של הליך זה היא חיזוי המבנה המשני של RNA ברזולוציית נוקלאוטיד יחיד. זה מושג על ידי שינוי כימי ראשון של ה-RNA המקופל עם מגיב אלקטרופילי ש-S מבודד אזורים חד-גדיליים או גמישים של RNA. השלב השני הוא שימוש בשעתוק הפוך כדי לזהות אתרים של ה-RNA שעברו שינוי כימי.

לאחר מכן, תוצרי CD NA של שעתוק הפוך מפוצלים על ידי אלקטרופורזה נימית. השלב האחרון הוא עיבוד נתונים ונורמליזציה. בסופו של דבר, תוכנת מבנה RNA משמשת לחיזוי מבנה משני של RNA באמצעות אילוצי האנרגיה החופשיים הפסאודו-חופשיים הנגזרים מניתוח צורה.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המולקולרית, כגון כיצד מבנה ה-RNA שולט בתפקודים של RNA קטליטי ולא נוכחי, וכיצד גנום RNA ויראלי מווסת את הרב-פונקציונליות של הגנום שלהם. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול והאבחון שלנו במחלות נגיפיות או סרטן מכיוון שהשגת תובנה לגבי המבנה המשני של RNA עשויה לסייע בתכנון תרופות מבוססות מבנה. למרות ששיטה זו מספקת תובנות לגבי מבנה ה-RNA המיוצר על ידי שעתוק במבחנה, ניתן ליישם אותה גם in vivo מכיוון שריאגנטים לצורה חדירים לתאים.

לפני שתתחיל בהליך זה, הכן RNA על ידי שעתוק חוץ גופית. שימוש בערכת תמלול מסחרית. יש לאחסן RNA במאגר TE בין מינוס 20 למינוס 80 מעלות צלזיוס בצינור מיקרו צנטריפוגה של 0.5 מיקרוליטר.

מדללים 12 שומות פיקו של RNA ל-18 מיקרוליטר במים ומוסיפים שני מיקרוליטרים של תערובת חיץ 10 x returation על ידי הקשה על הצינור ואחריו סיבוב קצר מחממים את התערובת בצינור ל-85 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ואז מצננים לארבע מעלות צלזיוס בקצב של 0.1 מעלות צלזיוס לשנייה. הוסף 100 מיקרוליטר מים ו-30 מיקרוליטר של מאגר מתקפל פי חמישה לצינור המיקרו צנטריפוגה. לאחר מכן, דגרו את תכולת הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות, תלוי בקיפול ה-RNA.

באופן כללי, קיפול תלוי מגנזיום של RNA ארוך ומובנה יותר דורש זמני דגירה ארוכים יותר העבר אליקוט של 72 מיקרוליטר לכל אחד משני צינורות מיקרו צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר, אותם יש לתייג כמותאמים ובקרה בהתאמה. השלב הבא הוא להוסיף שמונה מיקרוליטרים של דימתיל סולפוקסיד נטול מים לתערובת הבקרה ולהניח בצד. לאחר מכן הוסף שמונה מיקרוליטר של 10 x ו-MIA לתערובת ששונה.

דגרו את התערובת המותאמת והבקרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות. הוסף שמונה מיקרוליטר של שלושה נתרן אצטט, pH 5.28 מיקרוליטר של 100 מילי-מולארי EDTA, 240 מיקרוליטר אתנול קר ומיקרוליטר אחד של 10 מיליגרם למיליליטר. גליקוגן לצינור המעורב המותאם כדי לזרז את ה-RNA המותאם מקרר את תכולת הצינור למשך שעתיים במינוס 20 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-14,000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן שטפו את הגלולה פעמיים עם צנטריפוגה קרה ואתנול 70% למשך חמש דקות. לאחר כל שטיפה, הסר את הסופרנטנט עם המיקרו פיפטה וייבש את הכדור באוויר למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, הכינו את הדגימות ששונו ובקרה לשעתוק הפוך בצינורות מיקרו צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר.

עבור התגובה המותאמת מערבבים חמישה מיקרוליטר של RNA שונה, שישה מיקרוליטר מים ומיקרוליטר אחד של תמיסת פריימר של 10 מיקרו-מולאר. לתגובת הבקרה מערבבים חמישה מיקרוליטר של RNA בקרה, שישה מיקרוליטר מים ומיקרוליטר אחד של תמיסת פריימר 10 מיקרו-מולרית sci 5.5. הניחו את הצינורות במחזור תרמי וכרעו את הפריימר ל-RNA.

במהלך כריעת ברך הכינו תערובת של 2.5 x RT. עבור כל תגובת RT יש לערבב היטב ולדגור בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות לפני שמוסיפים לתגובות הכריעה. ברגע שטמפרטורת תגובות הברך מגיעה ל-50 מעלות צלזיוס, הוסף שמונה מיקרוליטרים של 2.5 XRT.

מערבבים ודוגרים במשך 50 דקות בחום של 50 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הידרוליזה של ה-RNA על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של ארבע טוחנות נתרן הידרוקסיד וחימום ל-90 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. מצננים את התגובות על קרח ואז מנטרלים אותן על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של שתי חומצה הידרוכלורית מולארית.

כעת שלבו את התגובות ששונו והבקרה והוסיפו 0.1 נפח או עשירית מנפח התגובה הכולל של שלוש נתרן אצטט מולארי ו-100 מילי-מולארי EDTA, נפח 1.5 של אתנול קר ומיקרוליטר אחד של 10 מיליגרם למיליליטר. גליקוגן. התוצאה היא שה-CDNA משקע מחוץ לתמיסה. מקררים את התמיסה למשך שעתיים, ואז צנטריפוגה בחום של 14, 000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

שטפו את הגלולה פעמיים עם השעיה קרה, 70% אתנול, ה-CD NA הגלולה ב-40 מיקרוליטר של אמיד נטול יונים על ידי חימום ל-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן מערבולת נמרצת למשך 30 דקות לפחות להכנת תגובת הריצוף בתערובת צינור מיקרו צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר 40 מיקרוליטר מתערובת סיום ה-DDA. חמש שומות PICA של תבנית ה-DNA, 4.6 מיקרוליטר של מאגר 10 x sease ו-10 מיקרוליטר של פריימר D שנקרא היטב. לתערובת זו מוסיפים 4.6 מיקרוליטר QUIN A ומדללים במים כדי להביא את הנפח הכולל ל-82 מיקרוליטר.

הכן תגובת ריצוף שנייה באותו אופן באמצעות DDT ו-lycor IR 800 פריימר במקום זאת. לאחר מכן, המשך להגברת PCR באמצעות התנאים המומלצים של USB הנתונים. הוסף 16 מיקרוליטר של שלושה נתרן אצטט מולארי, pH 5.2, 16 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי EDTA, מיקרוליטר אחד של 10 מיליגרם למיליליטר גליקוגן, ו-480 מיקרוליטר של 95% אתנול כדי לזרז את ה-DNA, ואז לדגור בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות וצנטריפוגה ב-14,000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

השעו מחדש את ה-CD NA הגלולי ב-100 מיקרוליטר של אמיד נטול יונים על ידי חימום ל-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן מערבולת נמרצת למשך 30 דקות לפחות. לאחר מכן, מערבבים 40 מיקרוליטר מדגימות הצורה המאוגדות עם 10 מיקרוליטר של סולמות הריצוף המאוגדים ופיפטה את הנפח הכולל של הדגימה לתוכנית צלחות דגימה של 96 באר והכינו את מכשיר האלקטרופורזה הנימים והתחילו ריצה לפי הוראות היצרן. ארבעת העקבות המקודדים בצבע חופפים מיוצרים על ידי נדידה של ארבע קבוצות תוצרי התגובה דרך הנימים כדלקמן, העקבות הכחולות מציגות תוצרי שעתוק הפוך שנוצרו משעתוק הפוך של RNA שהשתנה ב-NMIA.

העקבה הירוקה מציגה תוצרי שעתוק הפוך מ-RNA מקופלים אך לא שונו. העקבה השחורה מציגה את סולם הריצוף D-N-A-D-D-G והעקבה האדומה מציגה את סולם ריצוף ה-DDT. עקבות האלקטרופורזה הנימים הגולמיים מופרדים, מעובדים, מיושרים ומשולבים באמצעות תוכנת איתור צורות.

ניתוח הנתונים מתחיל בייבוא האלקטרופרוגרמות ממערכת האלקטרופורזה הנימים למאתר הצורות. חלון תצוגת הנתונים המרכזי מספק משוב גרפי על כל שלב עיבוד נתונים. חלון מפקח הכלים הממוקם בפינה השמאלית התחתונה של המסך מציג פרמטרים עבור הכלים שנבחרו במפקח הסקריפטים.

מפקח הסקריפטים בחלק העליון של המסך מציג את הכלים שהוחלו על הנתונים, מתאים את האלקטרופרוגרמות כדי לתקן את הרקע הפלואורסצנטי, חפיפה ספקטרלית בין תעלות פלורסנט, שינויי ניידות, המוענקים על ידי פריימרים מתויגים באופן שונה אותות דעיכה הנובעת מסיום מוקדם של שעתוק הפוך והבדלים בעוצמת הקרינה של מוצרים נפוצים המסומנים בפלואורופורים שונים בכלי מוצאי צורה. השתמש בפונקציית ההגדרה כדי להקצות זהויות באופן אוטומטי לפסגות בודדות ולתאם מידע זה לרצף ה-RNA כפי שהוגדר על ידי קלט המשתמש ושני סולמות הריצוף כדי לשלב את פרופילי תגובת הנוקלאוטידים באלגוריתם המבנה המשני המשמש את תוכנת מבנה RNA 5.3 או כדי להשוות פרופילים של RNA RNAs קרובים זה לזה. נרמל את נתוני הצורה באופן מתוקנן.

לשם כך, אל תכלול חריגים מהחישובים הבאים. קבע את התגובתיות המקסימלית האפקטיבית ונרמל על ידי חלוקת כל ערכי התגובתיות במקסימום האפקטיבי. תוכנת מבנה RNA משמשת לחיזוי מבנים משניים של RNA הנתמכים בניסוי באמצעות אילוצי האנרגיה החופשית הפסאודו-מניתוח צורה.

התוכנה מספקת ייצוגים גרפיים של האנרגיה הנמוכה ביותר למבני DRNA, כמו גם ייצוג טקסטואלי של מבנים אלה. בסימון סוגר נקודות, יש לייבא את הרצף ואת הערת סוגר הנקודות במציג מבנה RNA המוצג כאן הוא המבנה הדו-ממדי של לולאת הגזע של אלמנט תגובת ה-HIV שנוצר במבנה RNA 5.3 באמצעות פרופילי התגובתיות הנגזרים מהצורה ומוצג באמצעות יישומון קל משקל של Java. לנוקלאוטידים בצבע כחול יש תגובתיות נמוכה, ואילו לנוקלאוטידים בצבע אדום יש תגובתיות גבוהה יותר לאחר שליטה, ניתן לבצע את הטכניקה תוך יומיים אם מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי יש לפרש בזהירות את מודל ה-RNA המתקבל לפני שמגיעים למסקנות סופיות לגבי המבנה המשני של ה-RNA בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו שימוש בבדיקות רדיקליות הידרוקסיות באמצעות שיטות מחשוף חלל על מנת להבהיר אינטראקציות שלישוניות מורכבות ובסופו של דבר לאפשר לחוקרים לקבוע את המבנים של RNA אלה בתלת מימד.