דפוסי שיתוף תרבות נייד באמצעות מערכות מימיות שני שלבים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לעצב ישירות תאים בסביבות מימיות לחלוטין. זה מושג על ידי המסה ראשונה של פולימרים ארוכי שרשרת, כגון פוליאתילן גליקול ודקסטרין בצינורות נפרדים המכילים מדיום תרבית תאים. השלב השני הוא לנסות, לקצור גלולות ולהשעות תאים בצפיפות הזריעה הרצויה באחת או בשתיהן.

לאחר מכן, תמיסות הפולימר מחולקות על צלחת תרבית תאים. חוסר ההתאמה של שני הפולימרים מאפשר דפוס מרחבי של שני הנוזלים המימיים במלואם. ניתן לכלול תאים בתמיסת פולימר או בשתי התמיסות הפולימריות, כדי לייצר מגוון דפוסים.

השלב האחרון הוא להסיר את תמיסות הפולימר לאחר שהתאים הורשו להיצמד במשך ארבע שעות או יותר ולהחליף אותם במדיום תרבית. בסופו של דבר, ניתן להשתמש במיקרוסקופ שדה בהיר או פלואורסצנטי כדי לאשר דפוס תאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו הדפסת מיקרו מגע, הוא שהתאים מעוצבים בסביבה מימית לחלוטין עם כלים פשוטים כמו דפוסי מיקרו צינורות.

שיטה זו יכולה לשמש להנדסת רקמות כדי להעריך את נדידת התאים ולחקור איתות פריקריני ואוטוקריני מתא לתא המדגימים את ההליכים יהיו אברהם, סטודנט לתואר ראשון, וג'ושוע ווייט, סטודנט לתואר שני ממעבדת טקיאמה. התחל בהמסת שני הפולימרים השונים למדיום הספציפי שישמש בניסויים שלך. בדוגמה זו, פוליאתילן גליקול, הידוע גם בשם PEG ו- Dextrin, הידוע גם בשם Dex, הוא בעל משקל מולקולרי של 35 קילודלטון ו -500 קילודלטון בהתאמה.

הכן 16 דגימות של שתי מיליליטר בצינורות חרוטיים של 15 מיליליטר, כל אחת עם ריכוזים שונים של PEG ו-dex, בדומה לתרשים המוצג כאן. כדי להשיג זאת, שקלו את הכמויות המתאימות של PEG ו-dex לפי התרשים וערבבו אותם במדיה על ידי נדנודם בעדינות עד ששני הפולימרים מומסים לחלוטין. זה עשוי לחלוף מספר שעות לאחר המסת הפולימרים במלואם.

הפתרון צריך להיות מעונן. אשר את הפרדת הפאזה על ידי צנטריפוגה של הדגימות ב-1000 Gs למשך חמש דקות. השלב התחתון הצפוף יותר יהיה עשיר בדקס.

השלב העליון יהיה עשיר יתדות. לאחר מכן, הוסיפו לאט לאט 0.1 מיליליטר של מדיום נוסף לצינורות ומערבלו את הדגימות למשך 20 שניות. לאחר מכן צנטריפוגה שוב את הדגימות כדי לבדוק אם יש הפרדת פאזה.

הפתרון ברור לאחר הוספת כמויות נוספות של מדיום, חזור על שלב זה והוסף עוד 0.1 מיליליטר של ערבוב בינוני וצנטריפוגה של הדגימות עד שהתמיסה מתבהרת וכבר לא מפרידה פאזה. זה מצביע על כך שסף הנקודה הקריטית הושג עבור התערובת הספציפית הזו. רשום את המשקל הסופי של כל צינור בשלב זה.

לבסוף, קבע את אחוז המשקל למשקל של שני הפולימרים בנקודת ההפרדה של הפנים. שרטט את עקומת הצומת של הפח, והצב אחוז משקל לכל יתד משקל על ציר y ואחוז משקל לכל סיפוני משקל על ציר X. עקומה זו היא ריכוזי הסף להפרדת פנים של PEG ו-dex במדיום זה.

כדי להתחיל דפוס אי הכללה של תאים, הכינו פתרונות נפרדים של PEG ו-dex בפי שניים מערכי הנקודה הקריטית שלהם כפי שנקבע על ידי סף צומת הסל. עבור ניסויים אלה, 5% משקל למשקל PEG ו-12.8% משקל למשקל מתווספים ל-DMEM עם 10% FBS ו-1% אנטיביוטיקה. הצינורות מונחים על נדנדה כדי לאפשר להם להתמוסס במלואם.

לאחר מכן, קצרו את התאים שישמשו לדפוס הרחקה לניסוי זה, תאי הלה במפגש של 80% עוברים טריפסים באמצעות 0.5% טריפסין למשך שלוש דקות. לאחר הקציר, ספרו את מספר התאים באמצעות ציטומטר המו ואז גלולה והשעו מחדש את התאים ב-375,000 תאים למיליליטר במדיום עם תוספת של 5% PEG. ריכוז זה יפיק דגימות שכאשר הן מתורבתות יהפכו למתכנסות למחרת.

לאחר מכן, באמצעות מיקרו פיפטר מחלקים טיפות של 0.5 מיקרוליטר מתמיסת הסיפון של 12.8% על צלחת יבשה של 96 בארות לדפוס הרחקה. ניתן לאפשר לטיפות דקס להתייבש בתנאים סטריליים לשימוש מאוחר יותר. לאחר מכן הוציאו 200 מיקרוליטר של תרחיף תאי PEG hela לבאר לאט.

כדי לכסות את טיפות D, חשוב לכסות תחילה את טיפת D בתמיסת PEG לפני מילוי האזורים הסובבים מכיוון שהדבר מונע ממנה לשבש את הטיפה כאשר היא מתפשטת על פני הבאר. לאחר שכל הבארות עוצבו ונזרעו בקפידה, הנח את צלחת תרבית התאים לתוך אינקובטור לח. וודאו שהצלחת אינה מוטה במהלך הטיפול ושהיא מונחת על מדף אינקובטור ישר כדי למנוע שיבוש הדפוסים לאחר שהתאים הורשו להיצמד למשך 12 שעות.

הסר את תמיסת ה-PEG ושטוף שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית כדי להסיר שאריות פולימרים. לאחר מכן מוסיפים 200 מיקרוליטר מדיום תרבית טרי ומחזירים את הצלחת לחממה. עקוב אחר התרביות מעת לעת כדי לצפות בהתפשטות התאים ובנדידת התאים לאזורי ההדרה כדי להתחיל בתבנית האי.

הכן פתרונות של 5% משקל למשקל PEG ו-12.8% משקל למשקל סיפונים במדיום תרבית תאים. קצרו גם את תאי ההלה שישמשו לדפוס האי ושוב, קבעו את המספר הכולל של התאים הזמינים באמצעות ציטומטר המו. הכדור הבא והחייאה.

סובב את התאים ב -5 מיליון תאים למיליליטר במדיום. בהמשך ל-12.8% דקס, ייתכן שיהיה צורך בריכוז גבוה יותר של תאים כדי להגיע למפגש תוך 24 שעות אם התאים אינם נדבקים כמו תאי הילה. לאחר מכן, פיפטה 200 מיקרוליטר של תמיסת PEG לכל באר של צלחת 96 בארות.

לאחר מכן הוסף לאט טיפה של 0.5 מיקרוליטר של מתלה תאי סיפון בכל באר המכילה את תמיסת ה-PEG. הטיפות ישקעו לתחתית ויצרו קשר עם משטח התרבות. לאחר מכן העבירו בזהירות את הצלחת לחממה, הקפידו לא להטות את המנה בשום שלב, מה שעלול לשבש את הדפוסים לאחר 12 שעות.

הסר את תמיסת ה- PEG ושטוף שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר מדיום תרבית. לאחר מכן מוסיפים 200 מיקרוליטר מדיום תרבית טרי ומחזירים את הצלחת לחממה. עקוב אחר התרביות מעת לעת כדי לצפות בהתפשטות התאים ובנדידת התאים החוצה מהאיים.

התחל דפוס תרבית משותפת על ידי הכנת פתרונות של 5% משקל למשקל PEG ו-12.8% משקל למשקל סיפונים ב-DMEM עם 10% FPS ו-1% אנטיביוטיקה גם מגדלת את שני סוגי התאים שישמשו בהרחקה ובדפוס האי כך שהם קרובים למפגש. במקביל כאן, נשתמש ב-Hep G שני C3 איי הפטוציטים עם NIH שלושה T שלושה פיברובלסטים המקיפים אותם. לאחר מכן קצרו את שני סוגי התאים וספרו אותם בנפרד באמצעות ציטומטר המו.

ניתן להבחין בקלות בין שני סוגי התאים הללו באמצעות כדור מיקרוסקופיה בהיר, ההפ G שני הפטוציטים C3 A לדפוס איים והוצאות החייאה ב-12.8% סיפונים. לאחר מכן גלולה את הפיברובלסטים להרחקה, דפוס והשעיית החייאה ב-5% יתד. לאחר מכן, יש להוציא טיפות של 0.5 מיקרוליטר של תרחיף תאי D על צלחת יבשה של 96 בארות ולכסות את טיפות הדקס בעדינות עם 200 מיקרוליטר של תרחיף תאי יתד.

ואז העבירו את הצלחת לחממה לאחר 12 שעות. הסר את המדיה ושטוף שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר מדיום תרבית. לאחר מכן מוסיפים 200 מיקרוליטר מדיום תרבית טרי ומחזירים את הצלחת לחממה.

לבסוף, ניתן להשתמש בעוצמת צביעת האלבומין של תרביות הקו כדי להעריך את ההשפעות המועילות של תרבית קו-פיברובלסטים. ריכוזי הפולימרים הנדרשים ליצירת מגוון מערכות דו-פאזיות מימיות מתוארים כאן על ידי עקומות צומת הפח בריכוזים מעל עקומת הצומת של הפח. המערכת יוצרת שני שלבים מתחת לעקומת הצומת של הסל.

הפתרון הוא מערכות דו-פאזיות חד פאזיות שקופות של לפחות פעמיים. הריכוזים של אלה שנמצאו על העקומה הבינאלית מספיקים לשימוש במערכות הדו-פאזיות המימיות המתוארות בסרטון זה. הדוגמה הראשונה לשימוש בהם היא דפוס הרחקה שבו ניתן להשאיר אזורים קטנים ריקים מתאים.

דפוס איים יוצר את ההפך הגמור מדפוס אי-הכללה שבו אזורים קטנים יכולים להיות מושבים עם תאים. ניתן להשתמש בשילוב של שני ההליכים הללו ליצירת תרבית משותפת ייחודית שבה אי של תאים יכול להיות מוקף בסוג תא אחר כפי שמוצג כאן. תאי הלה מצופים באמצעות דפוס הדרה יתרבו וינדדו כדי למלא את החלל.

עם הזמן. ניתן לנטר את גודל הריק כדי לספק תובנות חשובות לגבי נדידת תאים וצמיחה בתנאים משתנים. דפוס אי, לעומת זאת, יכול לשמש למדידת צמיחת תאים.

השילוב של דפוסי אי והדרה מייצר אזורים מוגדרים היטב של תרבות משותפת. מוצגים כאן איים של הפטוציטים שמוקפים בתאי פיברובלסטים. נמצא כי מושבות אלה שומרות על ארגונם לפחות ארבעה ימים בתרבות.

באמצעות מערכת זו, ניתן לגדל מספר איים של תאים על אותה צלחת. כאשר גדלו כאיים בלבד, הפטוציטים ייצרו מעט פחות אלבומין מאשר בגידול בתרבית משותפת עם פיברובלסטים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בריכוזים של פולימרים בריכוז כפול מהקריטי ליצירת תמיסות דו-פאזיות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנסח מערכת דו-פאזית מימית ולהשתמש בה כדי לעצב תאים ולהגדיר גיאומטריות.