הדמיה ישירה של סידן ER עם ממוקד esterase מושרה טעינת צבע (טד)

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לדמיין דינמיקת סידן ישירות בלומן של הרשתית האנדופלזמית של תאים חיים. זה מושג על ידי התמרת התאים עם הצבע המושרה אסטראז ממוקד או מבנה וקטור TED כדי לבטא יתר על המידה את קרבוקס אסטראז CS 2 ברטיקולום האנדופלזמי. לאחר מכן, התאים מודגרים עם אינדיקטור הסידן אצטו מתיל אסטר שפעת או חמש NA, המתפזר דרך ממברנות הפלזמה והמיון.

ואז הקרבוקסיל אסטראז מתבקע. קבוצת האסטר משחררת את האינדיקטור הרגיש לסידן בחדר המיון. נוצרים קומפלקסים של לומן וסידן פלואורסצנטי.

מתקבלות תוצאות המראות שינויים בריכוז הסידן החופשי במיון על סמך הדמיית תאים חיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לוויסות הומאוסטזיס סידן תאי. אותות סידן מנוטרים לרוב בציטוזול, ולכן לא ניתן להבחין בקלות היכן הסידן זורם לציטוזול מהחלל החוץ-תאי או ממאגר הסידן התוך-תאי.

כדי להתגבר על מגבלה זו, פיתחנו הורדה ממוקדת המושרה על ידי אסטראז. בשיטה זו, הסידן המשתחרר מחדר המיון מנוטר ישירות. הגישה אינה מפריעה.

קרום הפלזמה נשאר שלם ומפלי איתות תוך-תאיים נשמרים. בדרך כלל, אנשים בשיטה יתקשו מכיוון שהם זקוקים לניסיון. בביטוי וקטורי של TED, פיתחנו מבנים וקטוריים המבטאים חלבון סנט המותך ל-Carboxylase CES two.

זה מאפשר לנו לזהות בקלות תאים המתאימים להדמיית סידן AR במהלך הניסויים, אשר יאפשרו תאים המאופיינים בפלואורסצנטיות אדומה חזקה ורק פלואורסצנטי אינדיקטור סידן בינוני עד חזק. תוויות פלואורסצנטיות אלה צריכות להיות מפוזרות באופן שווה בכל הרטיקולום האנדופלזמי ונעדרות באזור הגרעיני. לפני שמתחילים.

הכן נוזל מוחי מלאכותי בעמוד השדרה או CSF ושפעת או חמש NAM לפי פרוטוקול הטקסט. מחממים את ה-A CSF לטמפרטורת החדר ומוסיפים גלוקוז עמוק מאווררים את ה-A CSF עם קרבוגן למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסף תמיסת מלאי טוחנת אחת של סידן כלורי ומגנזיום כלוריד לריכוזים סופיים של שני מילימולר כל אחד.

לאחר הפעלת מיקרוסקופ ההדמיה החי ותוכנת המחשב, התחל את השפע על תא הדמיה דמה ואזן את מערכת הצינורות לחמם מראש את מחמם התמיסה המוטבעת ואת תא ההדמיה בשלב המיקרוסקופ ולאזן את המערכת ל-32 עד 37 מעלות צלזיוס. לפני שתתחיל בהליך ההורדה לטעינת צבע לתאים, הוסף 100 מיקרוליטר של CSF מחומם מראש ל-0.5 מיקרוליטר אחד של שפעת של חמישה מילי-מולרית או חמישה NAM, והמיס את התמיסה בסוניקט אמבט מים למשך 90 שניות להעביר 400 מיקרוליטר של תמיסת הדמיה חמה מראש לבאר אחת של צלחת ארבע או 24 בארות. הוסף את תמיסת D לאותה באר כדי לייצר 500 מיקרוליטר של תמיסה של חמישה מיקרומולר.

לאחר מכן, הנח בזהירות תלוש כיסוי עם תאים בדגירה של הבאר לפרק זמן מתאים בחממת תרבית תאים ב-37 מעלות צלזיוס, זמן טעינת DI וריכוז D תלויים בסוג התא, צפיפות התאים והניסויים הספציפיים. זמני דגירה ארוכים עלולים לפגוע בתאים, במיוחד בניואנסים ראשוניים ובתאי גליה, וזה קריטי להיענות לגירויים פיזיולוגיים. דגירה של יותר מ-30 דקות תהיה שימושית רק לניסויי לוקליזציה של סידן ER כדי לחקור את התפלגות סידן ER בתחומי מיקרו קטנים, למשל, MUEs של עמודי שדרה מיד לאחר הדגירה העבירו את החלקת הכיסוי לבאר תרבית תאים אחרת המכילה תמיסת הדמיה.

כדי להתכונן להרכבת התאים בתא ההדמיה, השתמש במברשת צבע כדי למרוח גריז ואקום גבוה על תא ההדמיה. אנו משתמשים בתאי הדמיה מתוצרת עצמית עבור החלקות כיסוי של 10 עד 12 מילימטר בנפח קטן, ובכך מאפשרים מהירויות זלוף גבוהות של עד פי 15 החלפת חוצץ לדקה. הרם את פתק הכיסוי עם שפעת או חמש ותאים טעונים והוסף טיפה קטנה של תמיסת הדמיה כדי לשמור עליו רטוב.

לאחר מכן הפוך את החלקת המכסה והתקן את התאים לתא ההדמיה. השתמש במקלון צמר גפן כדי ללחוץ את החלקת הכיסוי לתוך דבק הסיליקון ולנגב את שאריות המאגר מתחתית החלקה של מכסה הזכוכית. לאחר מכן, החלף את תא הדמיית הדמה עם תא ההדמיה הניסיוני.

שטפו את התאים במשך חמש עד 10 דקות על ידי זלוף רציף לבחירת התאים. השתמש בכמות מינימלית של תאורת לייזר כדי למנוע הלבנת פוטו מהירה של שפעת או חמש וסידן שניים במיון, קצב סריקה גבוה של שניים עד ארבעה הרץ, גודל תמונה קטן ורווח גבוה שהוגדר במיקרוסקופ. על פי ניסוי הצמחים.

בתחילת הניסוי, תעד את ההתפלגות התאית של תווית השפעת או חמש והסידן ואת התווית הפלואורסצנטית האדומה של מבנה ה-carbox האדום cel esterase. בתא המעניין שלך כאן, נוירונים מייצגים ברזולוציה גבוהה X, ערימות תמונות YZ מבצעות הדמיית XYT כדי לנטר את דינמיקת הסידן של ER בתנאי הניסוי הספציפיים. הגדרות אופייניות למערכת שלנו מפורטות בטבלה השנייה של פרוטוקול הטקסט: עקוב אחר שינויים בסידן ER תחת זלוף רציף עם תמיסת הדמיה, שיעורי חילופי מאגר הם 1.5 מיליליטר לדקה לשטיפת תאים ודלדול האחסון על ידי חסימת סידן הרשתית האנדופלזמית של סרקו, שני TPAs ושלושה מיליליטר לדקה לגירוי על ידי TP ו-DHPG ואגוניסט לקולטן הגלוטמט המטבוטרופי

כאן תאי גליה מגורים עם 200 מיקרו-מולרי A TP למשך 10 שניות. כדי לעבד את התמונות, פתח את אוסף התמונות בתוכנית Image J להדמיה מרובת צבעים. פצל את ערוצי ה-RBG כאשר התוכנה תבקש זאת.

זהה את אזורי העניין. בהתאם למטרה, צייר אזורי עניין סביב חדר המיון השלם או אזורים קטנים של חדר המיון. השתמש בתוסף מנתח סדרות הזמן כדי לקרוא את עוצמת הפיקסלים הממוצעת באזור עניין.

חשב את השינויים היחסיים המתוקנים ברקע בקרינה על ידי דלתא F על פני F אפס באמצעות נוסחה זו. הצג שינויים יחסיים בקרינה כעקבה עם דלתא F מעל F אפס עבור ציר Y וזמן עבור ציר x. באיור זה, תאי אסטרוציטים בקליפת המוח ונוירונים בהיפוקמפוס מבטאים וקטור TED פלואורסצנטי אדום ומסומנים במחוון סידן בעל זיקה נמוכה.

שפעת הו חמש N.קומפלקס אינדיקטור הסידן הפלואורסצנטי ממוקם ברטיקולום האנדופלזמי של כל סוגי התאים. איור זה מראה שפעת או חמישה תאי גליה מסומנים N. במהלך הטיפול ב-CIN, ניתן לראות תיוג ציטוזולי בהיר אם קרום הפלזמה של התא נפגע לפני ואחרי הטיפול ב-CIN.

זה מגלה ששפעת או חמש N משתחררת גם בציטוזול על ידי אסטרזות אנדוגניות. בניסוי זה, לאחר תיוג TED עם שפעת, דלדול הסידן של תאי עצב בהיפוקמפוס בתרבית נגרם על ידי חומצה ציקלונית חוסמת מעגלים. שימו לב, השינוי העצום בצפיפות הקרינה הממוצעת לאזור עניין שנצפה כאן הוא סדרת זמן-lapse עם תאי GL של קליפת המוח של עכבר המעוררים עם TP. הקרינה יורדת בפתאומיות ומתאוששת המייצגת שחרור ומילוי סידן ER בו זמנית, הקרינה של החלבון הפלואורסצנטי האדום פוחתת באופן שולי כתוצאה מדיאגרמות הלבנת צפחה המציגות את השינוי בעוצמת הקרינה לאורך זמן בחלק מהניסויים, אך לא בכולם.

ערכי הקרינה אינם חוזרים לרמות עוצמת הקרינה הראשוניות מכיוון שחלק ממתחמי השפעת או חמישה חנקן הולכים לאיבוד במהלך הגירוי. סרטון זה מציג קרבוקסילאז שני תאים נגועים BHK 21 ברזולוציה גבוהה המסומנים על ידי שפעת או חמישה קומפלקסים של סידן N ומגורים עם TP. שימו לב ששחרור סידן המושרה על ידי TP ומילוי מחדש של מאגר סידן ER מוצגים במבנים עדינים של צינורות ER. בזמן השתתפות בהליך זה, חשוב לזכור שרק תאים בריאים לחלוטין מראים תגובות סידן פיזיולוגיות.

לכן אנו ממליצים לבצע סדרה של ניסויים בהומאוסטזיס סידן הקשורים זה בזה ביום אחד עם אותה אצוות תאים. בהתבסס על הניסיון שלנו, שפעת הצבע של חמישה N עובדת בצורה הטובה ביותר, אך אינדיקטור סידן זה אינו עמיד במיוחד בפני פריצה. לכן, שיטה זו תיהנה מפיתוח מדדי סידן עמידים יותר בפני אקונומיקה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין סידן חולף E עם מדדי סידן סינתטיים בעלי זיקה נמוכה. אינדיקטורים אלה מאפשרים לך לנטר דינמיקת סידן אלקטרוני ברזולוציה זמנית גבוהה. מסיבה זו, השיטה שלנו עשויה להועיל לחקירת מפלי איתות סידן המעורבים בפלסטיות סינפטית ולניטור שינויים בהומאוסטזיס סידן במודלים תאיים למחלות ניווניות.