Name: שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: למד שיטת דימות ex vivo לניתוח תנועתיות צילה באפיתל של קנה הנשימה בעכברים באמצעות מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה. הפרוטוקול מאפשר מדידה כמותית של תדירות פעימות הצילה וזרימת הנוזלים הנוצרת על ידן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפרויקט נתמך על ידי מענק NIH U01HL098180 מהלאומי ללב, ריאות ודם מכון. התוכן הוא באחריות בלעדית של כותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של הלאומי ללב, ריאות ודם מכון או המכונים הלאומי לבריאות

1. התקנת ריאגנטים 1.1 Dissection והדמיה בינוני L-15 בינוניות של ליבוביץ (L15) הוא השלים עם FBS (10%) ופניצילין, סטרפטומיצין (מ&quot;ל של פניצילין G נתרן ו100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של סטרפטומיצין סולפט 100 יחידות /) משמש גם במהלך המסיק וההדמיה של דגימות קנה נשימה. 2. עצרת לשכת תרבות רדודה מוקפת חומה התא נהג לקיים רקמה מקנה נשימה מוצג באיור 1. רצפת החדר היא זכוכית תחתית צלחת תרבות 35 מ&quot;מ. למעלה ובצד של החדר נוצרת על ידי הנחת פיסה קטנה של 0.3 יריעות סיליקון עבות מ&quot;מ על צלחת הזכוכית. שולי הגיליון הוא לחתוך כדי להתאים את צלחת תחתית העגולה והמרכז גזוז נוסף ליצירת חדר מרכזי רדוד (ראה שלבים 2.1-2.3). בחלק העליון של המכלול הזה, תלוש זכוכית עגול 18 מ&quot;מ כיסוי ממוקם כדי ליצור תא סגור מתאים להדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלוטין לכסות תלוש 18 מ&quot;מ עגול עם מכסה זכוכית מרובע של 0.3 יריעות סיליקון עבות מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מספריים לנתיחה חדים רגילים לקצץ את יריעות סיליקון העודפים ממסביב לקצה של להחליק את המכסה (וכתוצאה מכך שכבה מעגלית של יריעות סיליקון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם אזמל חד לחתוך ולהסיר מרובע של יריעות סיליקון (כ 10 מ&quot;מ מרובע) מאמצע להחליק את המכסה המכוסה (ובכך ליצור את החלק העליון והצדדים של חדר ההדמיה) מרכזית. </li></ol> 3. קציר והכנת קנה הנשימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים בהתאם לטיפול בבעלי חיים מוסדיים מקומי ולהשתמש בועדה ו / או הנחיות ממשלתיות ולהסיר קנה נשימה לתוך צלחת תרבות סטנדרטי פלסטיק 35 מ&quot;מ עם מספיק L15 תקשורת לרקמה לצלול (מחברים השתמשו בעכברים ממש לפני הלידה בהריון היום 16.5, ועד בעלי חיים יילוד, יילודים, ומבוגר 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרה של רקמה שאינה משויכת קנה הנשימה מחוברת לחלק החיצוני שלאת קנה הנשימה באמצעות נתיחה בוטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הגרון עם חתך רוחבי מתחת לסחוס cricoid באמצעות מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2 א, שורת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את סניפי הסימפונות העיקריים ימין ועל שמאל עם חתך רוחבי מעל קארינה באמצעות מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2 א, שורת 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להחזיק את קנה הנשימה עם מלקחיים עדינים ולשטוף את 2-3 פעמים עם הלום ~ 1 מ&quot;ל של מדיום הרחצה L15 עם Pipetman P1000 P1000 ועצה כדי לנקות את כל ריר ודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור את קטע 3-4 טבעת של קנה הנשימה באמצעות חתך רוחבי עם מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2, שורת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך longitudinally דרך אמצע שריר trachealis של קטע קצר זה קנה הנשימה באמצעות מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2, קו 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך longitudinally במרכז של טבעות הסחוס קנו נשימה באמצעות מספריים לנתיחה מיקרו (איור 2 ג </strong&gt;, קו), והשאיר את שני חלקים של קנה הנשימה רקמות מתאימות להדמיה (סעיף יחיד שמוצג באיור 2 ד). </li></ol> 4. ההדמיה cilia <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגזרי העברה קנה נשימת רקמות, לוואי לומן למטה, אל אמצע צלחת 35 מ&quot;מ זכוכית תחתונה תרבות עם 100-200 μl של מדיום L-15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את הזרימה שנוצרה ריסים להוסיף כמות קטנה של 0.20 מיקרומטר ניאון microspheres למדיום L-15 רחצה דגימת הרקמה מקנה נשימה (~ 1 x 10 11 חלקיקים / מ&quot;ל או 20 μl / מ&quot;ל של ההשעיה microsphere המימית Fluoresbrite 2.5%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את חדר ההדמיה שהוכן קודם לכן (ראה נוהל 1-3 לעיל) על גבי מדגם צד גיליון סיליקון קנה הנשימה למטה, עם מדגם קנה הנשימה הממוקם באמצע החדר המוקף חומה הרדוד שהוקם על ידי החלון חתוך ליריעות סיליקון (איור 1 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחף בעדינות מטה על coverslip כדי להבטיח מקום ובלהסיר כל L-15 תקשורת עודפת ממנצלים הקצוותGA P1000 קצה וP1000 Pipetman. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר צלחת 35 מ&quot;מ הזכוכית התחתונה התרבות ומדגם קנה הנשימה במיקרוסקופ הפוכה עם אופטיקה 100X אובייקטיבית ודסק&quot;ש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת רכישת סרט מצלמה ומהירות גבוהה לאסוף סרטים של תנועתיות ריסים ב 200 + פריימים לשנייה לאורך קנה הנשימה epithelia הריסים של מכורבל קצה של שריר trachealis (איור 2 ד מפורטים התיבה, E: ירושלים עדיין תמונה מסרט מוקלט) (סרט משלים 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות הדמיה epifluorescent FITC ואור נמוך מצלמת CCD (ראה רשימת ציוד למעלה), לאסוף סרטים של תנועת microsphere ניאון על פני ריסי epithelia קנה הנשימה על מנת לאפשר כימות מאוחר יותר של זרימה שנוצרה ריסים (משלים סרט 2). </li></ol> 5. Quantitation של תנועתיות צילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען סרטים צלמו דסק&quot;ש לחבילת תוכנת ImageJ ולאחר הטכניקה שתוארה על ידיעין דראמונד 13 להשתמש בכלי הקו למתוח קו סריקה חוצה את הריסים פועמים. &quot;Reslice&quot; של קו זה יוצר תמונה מסוג שבו רשם גלי תנועת ריסים מעבר לקו מייצרת דפוס גל. מספר הפיקסלים בין כל שיא גל נמדד (פיקסל אחד = מסגרת סרט אחד) שממנו ניתן לחשב את מספר הפעימות לדקה (כלומר הרץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד סרטי cilia תזרים עומס ניאון חרוז לתוך חבילת תוכנת ImageJ, ולהשתמש בתוסף MTrackJ 14 כדי לעקוב אחר אופן ידני חרוזי ניאון על פני השטח של epithelia קנה הנשימה ולתת לתוכנה ליצור מהירות ויווני חרוז לכל חרוז במעקב. </li></ol> יש להקפיד בעת שימוש בחרוזי ניאון לכמת זרימה כמו המרחק מהריסים פועמים חזק יכול להשפיע על עוצמת זרם נמדדת. תנועת חרוז בתוספת 2 סרט היא דוגמה טובה לכך. בדוגמה זו חרוזהתנועה היא מהירה על פני השטח של ריסי מכות ונושרים באופן משמעותי לחרוזים רחוקים יותר בתקשורת הרחצה. כדי לשלוט על זה, צריכים להיות שנאסף העתקי חרוז רק במרחק קבוע מעל epithelia הריסים בכל הדגימות על מנת לאפשר השוואה נכונה צריכה להתבצע. לבסוף, כדי לקבל נתונים יציגים בזרימת נוזל, חרוזים צריכים להיות במעקב במשך זמן רב ככל האפשר, אנחנו מעדיפים להשתמש בשירים חרוזים שמכסים תאי 10 + ריסים לחישוב זרימת נוזל.

<ol><li>Stannard, W., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+function+and+the+role+of+cilia+in+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Aerosol.+Med%22%5BJournal%5D)">Ciliary function and the role of cilia in clearance.</a> J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).</li>
<li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initiation+and+maturation+of+cilia+generated+flow+in+the+newborn+and+postnatal+mouse+airway%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).</li>
<li>Aune, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+heterotaxy+with+single+ventricle+spectrum+of+cardiac+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies.</a> Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).</li>
<li>Tan, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotaxy+and+complex+structural+heart+defects+in+a+mutant+mouse+model+of+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia.</a> J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+sequencing+identifies+the+gene+Megf8+with+ENU-induced+mutation+causing+heterotaxy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).</li>
<li>Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+scraping+in+diagnosing+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Rhinol%22%5BJournal%5D)">Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia.</a> Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).</li>
<li>Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+ciliary+dyskinesia%3A+improving+the+diagnostic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach.</a> Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).</li>
<li>Delmotte, P., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beat+frequency+is+maintained+at+a+maximal+rate+in+the+small+airways+of+mouse+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).</li>
<li>Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+3D+tissue+model+of+the+airway+wall+and+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa.</a> Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).</li>
<li>Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).</li>
<li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells%3A+selection+of+a+proliferative+population%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).</li>
<li>Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted+ciliated+epithelium+shows+slower+ciliary+beat+frequency+and+increased+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Respir.+J%22%5BJournal%5D)">Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia.</a> Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).</li>
<li>Drummond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cilia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying cilia in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).</li>
<li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+cell+and+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).</li>
<li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li>
<li>Schwabe, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+ciliary+dyskinesia+associated+with+normal+axoneme+ultrastructure+is+caused+by+DNAH11+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations.</a> Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).</li>
<li>Shah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Bardet-Biedl+syndrome+proteins+alters+the+morphology+and+function+of+motile+cilia+in+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).</li>
<li>Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effect+on+the+ciliary+beat+frequency+of+human+nasal+and+tracheal+ciliated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell+%2F+under+the+auspices+of+the+European+Cell+Biology+Organization%22%5BJournal%5D)">Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).</li>
</ol>

יש מחברים אין לחשוף.

מדידה של תדירות פעימת ריסים (CBF) היא קלה יחסית באמצעות מיקרוסקופ כוח מטרות גבוהות וחומרת רכישת תמונה מהירה 13,15, ומסבירה מדוע מדידות CBF מהוות את הבסיס של רוב המחקרים החוקרים אישור mucociliary בבריאות ובחוליים. עם זאת, בעוד CBF המדידה היא חיונית להבנת אישור mucociliary, מדידה של CBF לבד מתעלם החשיבות הבסיסית של שניהם זרימה נוצרה ריסי וצורת גל פעימת ריסים, אשר שניהם הם יותר קשים למדידה, לעתים קרובות התעלמו, ולא יכול לתאם עם CBF. דוגמה לאופן שהגדיל את CBF לא יכול להתכתב...

ניתוח של תפקוד ריסי ניעתי בepithelia הנשימה חשוב בניסוי להבהרת גורמים הגנטיים וסביבתיים שיכול להשפיע על אישור mucociliary ובריאות ריאתי 1. הפרוטוקול פשוט פיתחה להדמית עכבר הנשימה epithelia מספק שיטה יעילה לחקור את תנועתיות ריסי נשימה במודלים של עכברים שעברו מוטציה ונוקאאוט ודורש מיומנויות בסיסיות בלבד בנתיחת רקמות קנה הנשימה עכבר והדמיה vivo לשעבר של תנועתיות ריסי נשימה עם videomicroscopy ברזולוציה גבוהה. פרוטוקול זה הוקם ומעודן במהלך מסך mutagenesis עכבר בקנה מידה גדול, כדי לאפשר הערכה מהירה של תפקוד ריסי ניעתי (תדירות פעימות ריסים, צורת פעימת ריסים, זרימה שנוצרה cilia) במוטנטים עם מחלת לב מולדת הקשורים heterotaxy 2-5. טכניקות קיימות בשימוש כדי ללמוד תנועתיות ריסי דרכי הנשימה יכולה להיות מקובצים או סוג vivo לשעבר החריף או לוןטווח גר במבחנת גישות ניסיוניות. ניסויים אקוטיים כוללים הדמיה vivo לשעבר של ביופסיות אדם מכחול האף / נשימה 6,7 וניתוח של סעיפי נשימה רוחביים פשוטים 8. במבחנת הגישות להשתמש בטכניקות של תרביות תאים שונות כדי ליצור גיליונות של epithelia מובחן ריסים כמו בתרבויות ממשק נוזלי אוויר או תרבויות השעיה נשימה 9-11. עם זאת, טכניקות הנשימה reciliation epithelia אלה דורשות השקעה משמעותית מאוד בזמן ובאימונים לפני כל תאי אפיתל ריסים שמישים מיוצרים לניסויים (4-6 שבועות 9,10). בעוד ניתוח vivo לשעבר חריף של ביופסיות מברשת אפיתל נשימה משמש בדרך כלל למחקרים קליניים בבני אדם, שיטה זו אינה שמישה במחקרי עכבר בשל החמירה פגיעה ברקמות מכאנית 12. הטכניקה שתוארה בפרוטוקול זה לניתוח של mousדואר קנה הנשימה דרכי הנשימה epithelia הוא לא רק פשוט לביצוע, אבל זה לא דורש כישורים מיוחדים ולא לנתיחה כל ציוד מיוחד מלבד אלו סטנדרטי להדמיה על ידי videomicroscopy. ישנם יתרונות רבים לפרוטוקול זה פשוט. ראשית, כפי שקציר הרקמה מקנה נשימת העכבר הוא מהיר וקל לביצוע, שהוא מאפשר להערכה מהירה של תפקוד ריסי נשימה במספר רב של עכברים. זה יכול לכלול ניתוח חריף של ההשפעות לטווח הקצרים של טיפולים שונים במבחנה. שנית, להיות טכניקת vivo לשעבר, אפיתל דרכי הנשימה הריסים נשאר קשור אליו שבבסיס רקמות תומכות ובכך לשמור על מסלולים הקשורים תא איתות. לכן בהשוואה במבחנת reciliated הנשימה epithelia, הכנה זו היא ייצוג טוב יותר של הסביבה הטבעית ברקמות גוף חייה. שלישית, פרוטוקול זה מאפשר רכישה של מספר הפרמטרים כמותיים שונים שיכול לספק הערכה האובייקטיבית של f ריסי ניעתימשיחה. לבסוף, בניגוד לשיטות קיימות אחרות לשם ויזואליזציה ריסי דרכי הנשימה, פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של הריסים בזווית ישרה לכיוון הכה הריסים, המאפשר צפייה בפרופיל של הריסים שהם אופטימלי להדמיה ברזולוציה גבוהה של פעימת ריסים ודור גל metachronal . פרוטוקול זה יכול להיות שונה במספר הדרכים לטפל במגוון רחב של צרכי ניסיוניים, כגון התפקיד של סוכנים תרופתיים, גורמים גנטיים, חשיפות סביבתיות, ו / או גורמים מכאניים כגון עומס ריר על תפקוד דרכי הנשימה ריסים ודור / תחזוקה של קצב נשימה ריסים והתפשטות גלי metachronal.

<table><tbody><tr><td>לייבוביץ' s L-15 בינוני </td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>ללא פנול אדום </td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי </td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין </td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2x מלקחיים עדינים </td><td>Roboz</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לדיסקציה </td><td>Roboz</td><td>RS-5676</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיקרו דיסקציה </td><td>Roboz</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>אזמל </td><td>Roboz</td><td>RS-9801-15</td><td></td></tr><tr><td>P1000 פיפטמן </td><td>גילסון, בע"מ</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P1000 טיפים </td><td>Molecular BioProducts</td><td>2079E</td><td></td></tr><tr><td>18 מ"מ כיסוי זכוכית עגול החלקות </td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>פלסטיק 35 מ"מ כלי תרבות </td><td>קורנינג</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית תחתון 35 מ"מ כלי תרבות </td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>W3 64-0758</td><td></td></tr><tr><td>יריעת סיליקון בעובי 0.012 אינץ' (0.3 מ"מ) </td><td>AAA Acme Rubber Co</td><td>CASS-.012X36-63908</td><td></td></tr><tr><td>0.20 &mu; קוטר m Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres </td><td>Polysciences</td><td>09834-10</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך, עם מטרת שמן פי 100 ומסנני DIC </td><td>Lecia</td><td>DMIRE2</td><td>המותג אינו קריטי. </td></tr><tr><td>מנורת כספית 100 וואט, מסנני עירור/פליטה FITC אפיפלואורסצנטיים</td><td>Lecia</td><td></td><td>Brand אינו קריטי.</td></tr><tr><td>חממת שלב מיקרוסקופ</td><td>Lecia</td><td>11521749</td><td>לא נדרש אם הדמיית ריסים בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>מצלמה במהירות גבוהה שדה בהיר </td><td>Vision Research</td><td>Phantom v4.2</td><td>Brand אינו קריטי. חייב להיות מהיר יותר מ-125 פריימים לשנייה</td></tr><tr><td>מצלמת פלורסנט מהירה </td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-12</td><td>המותג אינו קריטי. חייבת להיות מהירה יותר מ-10 fps</td></tr><tr><td>תוכנה לניתוח סרטים</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות</td><td>ImageJ עם תוסף</td><td></td> MtrackJ</tr></tbody></table>

שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי airway epithelia

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

טכניקת הדמיה vivo לשעבר עכבר הנשימה epithelia לניתוח כמותי של תפקוד ריסי ניעתי חשוב לתובנה פונקצית אישור mucociliary כבר נקבע. שנקטפו זה עתה בעכבר קנה הנשימה היא לחתוך longitudinally דרך שריר trachealis ורכובה בתא מוקף חומה רדוד על צלחת זכוכית בעל תחתית. המדגם קנה הנשימה ממוקם לאורך הציר הארוך שלה כדי לנצל את היתרון של שריר trachealis להתכרבל longitudinally. זה מאפשר הדמיה של תנועת הריסים בתצוגת הפרופיל לאורך קנה הנשימה כולה. קטעי וידאו ב200 מסגרות / שני מתקבלים באמצעות מיקרוסקופ לעומת פער התערבות ומצלמה דיגיטלית במהירות גבוהה, כדי לאפשר ניתוח כמותי של תדירות פעימת ריסים וצורת גל הריסים. עם התוספת של חרוזי ניאון במהלך הדמיה, גם ניתן לקבוע את זרימת נוזל ריסים שנוצרו. זמן הפרוטוקול משתרע על פני כ -30 דקות, עם 5 דקות לחדר הכנה, 5-10 דקות למדגםהרכבה, ובמשך 10-15 דקות videomicroscopy.

ריסי נשימה שליטה צריכים להיות לעין וראה להכות באופן מתואם (סרט משלים 1; צפייה בסרט מואטת עד 15% בזמן אמת), עם זרימה מורגשת בכיוון של קצב ריסים (סרט משלים 2; צפייה בסרט היא 100% בזמן אמת). Quantitation של סרטי cilia אמור להניב תוצאות דומות לזה שניתן לראות באיור 3. אוסף של סרטי דסק&quot;ש במהירות גבוהה מאפשר כימות של תדירות פעימת ריסים (איור 3 ג) ונותן תמונות טובות להערכה איכותית של צורת פעימת ריסים, תוך המעקב של חר...

טכניקה קלה ואמינה המאפשרים הדמיה וכימות תנועתיות ריסי דרכי הנשימה וזרימת ריסים נוצר באמצעות עכבר קנה הנשימה מתוארת. יכולה להיות שונה בטכניקה זו כדי לקבוע כיצד מגוון רחב של גורמים המשפיע על תנועתיות ריסים, כולל סוכנים תרופתיים, גורמים גנטיים, חשיפות סביבתיות, ו / או גורמים מכאניים כגון עומס ריר.

שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להדמינ ולהכבית כמותית את תנועתיות ה-CLIA בדרכי הנשימה ואת הזרימה הנוצרת על ידי ה-CLIA באמצעות קשקשת עכבר שבודדה לאחרונה. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת תא הדמיה רדוד. השלבים הבאים של הפרוצדורה הם איסוף והרכבה של רקמת הקשקשת לצורך הדמיה.לאחר מכן מוצג כיצד להדמיאן ולהקליט את ניידות ה-C ואת הזרימה הנוצרת על ידי CLIA באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם וידאוגרפיה במהירות גבוהה דרך עדשה של 100 XDIC. השלב האחרון הוא לנתח את הווידאו על ידי כימות תדירות הפעימות של ה-CLIA והזרימה הנוצרת על ידי CLIA באמצעות תוכנת Image J. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות שינויים בניידות של CLIA נשימתי ובזרימה הנוצרת על ידי CLIA באמצעות מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מאפשרת דימות הדידקטיבי של אפיתל קשקשת הנשמה של מכרסמים לצורך הערכות כמותיות עקביות של תנועת הריסונים. ניתן לבצע זאת תוך 20 עד 30 דקות עם הכשרה מינימלית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח הנוגעות למנגנונים התאיים והמולקולריים המווסתים את פינוי המוקוס ב-eWAY, במיוחד כאשר היא משולבת עם דגמי עכברים מוטגניים והנדסיים גנטית שונים.התחילו בבניית התא המשמש להחזקת דגימות הקנה עבור הבסיס או רצפת התא. השתמשו בצלחת תרבית של 35 מילימטר עם תחתית זכוכית עבור החלק העליון. השתמשו בגיליון סיליקון בעובי 0.3 מילימטר.הניחו את היריעה מעל זכוכית כיסוי עגולה בקוטר 18 מילימטרים וגזרו את השוליים. לאחר מכן, בעזרת סקאלפל, גזרו ריבוע של 10 מילימטרים ממרכז הסיליקון. זכוכית הכיסוי והסיליקון מהווים את החלק העליון ואת הדפנות של תא התרבית.הם יوضوعו מעל הדגימה הממוקמת בצלחת התרבית. לאחר הדומיה של עכבר בהתאם להנחיות המוסדיות, בצע בידוד כירורגי של הקנה. אסוף את הקנה לתוך צלחת תרבית מפלסטיק בקוטר 35 מילימטר עם כמות מספקת של מצע L 15 כדי להטביعه לחלוטין.באמצעות דיסקציה קהה, הסר את כל הרקמה שאינה קשרית מסביב לקנה הנשימה. לאחר מכן, באמצעות מספרי מיקרו-דיסקציה, הסר את הגרון באמצעות חיתוך רוחבי ממש מתחת לסחוס הקריקואיד. כעת הסר את ענפי הסימפונות הראשוניים השמאלי והימני באמצעות חיתוך רוחבי ממש מעל הקרינה, בעזרת פינצטה עדינה.החזיקו בעדינות את הקנה. לאחר מכן, בעזרת פיפטה של 1 mL, שטפו את הלומן פעמיים או שלוש פעמים עם מצע L 15 כדי להסיר ריר ודם.לאחר מכן, במקטע הקנה הקטן, בצעו חתך לאורכי דרך מרכז שריר הקנה. לבסוף, חתכו לאורכה דרך מרכז טבעות סחוס הקנה באמצעות מספרי מיקרו-דיסקציה, כך שיישארו שני מקטעי רקמת קנה המתאימים לדימוי. לאחר הדיסקציה, העבירו את מקטעי רקמת הקנה, כאשר הצד של הלומן פונה כלפי מטה, למרכז צלחית בעלת תחתית זכוכית המכילה כ-100 µL של L 15.כדי לכמת את הזרימה שנוצרה ב-CLIA ב-20 µL של תרחיף של 2.5% של מיקרוספירות פלואורסצנטיות למיליליטר של מצע L 15. כעת הניחו את כיסוי הסיליקון והזכוכית מעל הקנה והפעילו לחיצה עדינה כדי להבטיחו במקומו. לאחר מכן, הסירו מכל הצדדים שאריות מצע בעזרת פפית של 1 מיליליטר.כעת העבירו את התא למיקרוסקופ הפוך המצויד בעדשה אובייקטיבית 100x ובאופטיקת DIC. באמצעות מצלמה במהירות גבוהה ותוכנה לרכישת סרטים, דגמו סרטים של תנועתיות CLIA בקצב של למעלה מ-200 פריימים לשנייה לאורך אפיתל הטרכאה המצוי בקיפול של שריר הטרכאה. באמצעות הדמיית פלואורסצנציה של FS e epi ומצלמת CCD בעלת רגישות לאור נמוך, דגמו סרטים של מיקרוספירות פלואורסצנטיות הנעות על פני שטח האפיתל המצוי של הטרכאה.השתמש בסרטים אלה כדי לבצע כימות של זרימה שנוצרה על ידי CLIA. ניתן לצלם את הדגימות למשך עד שעה ללא שינוי ניכר בתפקוד ה-Celia Beat. התחל בחישוב פעימות לדקה של ה-CLIA. טען את הסרטים שצולמו ב-DIC לתוך חבילת התוכנה Image J.פעלו לפי הטכניקה המתוארת על ידי Aian Drummond. השתמשו בכלי הקו כדי לצייר קו רסטר. חצו את הריספים הפועמים.בצעו חיתוך רזולוציה (res slice) של קו זה כדי להפיק תמונה מסוג גרף, שבה תנועת ה-CA לאורך הקו יוצרת תבנית של גלים. כעת ספרו את מספר הפיקסלים בין כל שיא של גל לאורך קו זה. מהספירה הזו.חשבו את מספר הפעימות לדקה בידיעה שכל פריים בסרטון מיוצג על ידי פיקסל אחד לאורך הקו. לאחר מכן, מדדו את הזרימה שנוצרה על ידי ה-C Cate. טענו את סרטוני החרו지를 הפלורסצנטיים לתוך חבילת התוכנה Image J.השתמשו בתוסף MT track J כדי לעקוב באופן ידני אחר חרוזי הפלואורסצנציה על פני השטח של אפיתל הקנה. התוכנה תחשב את המהירות והכיווניות עבור כל חרוז שנמעקב אחריו. שימו לב כי המרחק מהריסונים (cilia) עליהם נמצאים החרוזים עשוי להשפיע משמעותית על עוצמת הזרימה הנמדדת.בדוגמה זו, תנועת החרוזים מהירה על פני השטח של הריסונייב (beading cilia) ופוחתת עבור חרוזים רחוקים יותר במדיום הרחצה; כדי להבטיח זאת, יש לאסוף עקבי חרוזים רק במרחק קבוע מעל האפיתל השריסוני בכל הדגימות, כדי לאפשר ביצוע השוואות נכונות. לבסוף, עבור זרימת נוזלים, יש לעקוב אחר החרוזים למשך זמן רב ככל האפשר. עדיף להשתמש בחרוזים העוברים מעל יותר מ-10 תאים שריסוניים כדי לבצע חישובים אלו.בשימוש בפרוטוקול המתואר, הריסונים של דרכי הנשימה בביקורת צריכים להיות גלויים בבירור ולהיראות כפועלים באופן מתואם. כמו כן, צריכה להיות זרימה מורגשת בכיוון התנועה. בדרך כלל, איסוף סרטי DIC במהירות גבוהה מאפשר כימות של תדירות התנועה של הריסונים ומספק תמונות איכותיות.להערכה איכותית של צורת פעימת ה-CLIA. מעקב אחר חלקיקים פלואורסצנטיים מספק מדידה של מהירות הזרימה הנוצרת על ידי ה-CLIA. הכיווניות מחושבת על ידי חלוקת ההעתקה הכוללת של חלקיק פלואורסצנטי באורך נתיב העקבה של חלקיק פלואורסצנטי.לפיכך, קו מסלול ישר מקבל ציון אחת, בעוד שנתיב מפותל מקבל ערך נמוך בהרבה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לנקות כראוי את שריר הטרכיאה מכל הרקמות החיבוריות והרקמות השומניות שסביבו לפני החיתוך.מכיוון שהתכרבללות של שריר הקנה לאחר חיתוכו חיונית למיקום ה-CLIA הנשימתי לצורך ויזואליזציה מיטבית, ניתן לאחר הליך זה לבצע שיטות נוספות, כגון מחקרים פרמקולוגיים, כדי לענות על שאלות נוספות כמו כיצד או מדוע סוכנים פרמקולוגיים מווסתים את פעילות ה-C הנשימתי?

ex-vivo-method-for-high-resolution-imaging-cilia-motility-rodent

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: Al Omran, A. J.,  et al. הדמיה חיה של הריסים האפנדימליים בחדרים הצדדיים של מוח העכבר. {{}}J. Vis. exp. (2015).  }סרטון זה מדגים טכניקת הדמיה חיה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) כדי לצפות בפעימות של ריסים אפנדימליים במקטעי מוח של עכבר סגיטלי. ריסים אפנדימליים מניעים נוזל מוחי שדרתי (CSF), ופעילותם נרשמת בחלקי מוח הנשמרים בתווך עשיר בחומרים מזינים ומצולמים בתא מבוקר אקלים. סרטונים בעלי ניגודיות גבוהה מאפשרים לזהות ריסים פונקציונליים ולכמת את תדירות הפעימות שלהם.

הדמיה חיה של פעילות הריסים של תאים אפנדימליים בקטע מוח של עכבר

מיקרוסקופיה Intravital היא כלי רב עוצמה המאפשר הדמיה של תהליכים ביולוגיים שונים בבעלי חיים. במאמר זה, אנו מציגים שיטה מפורטת להדמית הדינמיקה של מבני subcellular, כגון גרגרי ההפרשה, בבלוטות הרוק של עכברים חיים.

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC), תצפית vivo לשעבר של המכות של cilia ependymal ניע ממוקם בתוך החדרים במוח העכבר באה לידי ביטוי בחי הדמיה. הטכניקה מאפשרת הקלטה של ​​תדר מכות הריסים הייחודי וזווית מכות וכן נכסי צעדה תנודת סידן תוך תאי שלהם.

הדמיה חיה של צילה Ependymal בחדרים לרוחב של מוח העכבר

במחקר זה, טכניקה מיקרוסקופית מפורטת של אור עברה אופטימיזציה לתצפית וניתוח בזמן אמת של התנועה של CPEC cilia ex vivo יחד עם שיטה מיקרוסקופית אלקטרונית לניתוח אולטרה-מבני.

תצפית של תנועת ריסי תאי אפיתל דמית העין מקלעת<em&gt; Ex Vivo</em

בפרסום זה, אנו מתארים פרוטוקולים להערכת סיווג רירי בדרכי הנשימה (MCC) בעכברים ב vivo ניצול הדמיה רדיונוקלדית דו-מודאלית. פרוטוקול זה מיועד טומוגרפיה ממוחשבת פליטת פוטון יחיד (SPECT) ופרוטוקול רכישת טומוגרפיה ממוחשבת (CT) באמצעות עכבר גוף שלם (MWB) collimators במערכת SPECT / CT כפול.

In vivo הערכה של אישור Mucociliary בעכברים

כדי להבטיח ניתוח פונקציונלי ריסוני מוצלח ואיכותי לאבחון PCD, שיטה מדויקת וזהירה לדגימת אפיתל נשימתי ועיבודו היא חיונית. כדי להמשיך לספק שירות אבחון PCD במהלך מגיפת COVID-19, פרוטוקול מיקרוסקופ הווידאו הריסי עודכן כדי לכלול אמצעי בקרת זיהום מתאימים.

דגימה ועיבוד צחצוח אף באמצעות מיקרוסקופ וידאו ריסני דיגיטלי במהירות גבוהה – התאמה למגפת הקורונה

פרוטוקול זה מתאר איסוף, הרחבה והתמיינות של תאי אפיתל באף למודלים של תאי אפיתל אורגנוטיפיים של דרכי הנשימה וכימות של תדירות פעימות הריסונים באמצעות הדמיה של תאים חיים וסקריפטים שנבנו בהתאמה אישית.

איסוף, הרחבה והתמיינות של מודלים ראשוניים של תאי אפיתל באף אנושי לכימות תדירות פעימות הריסונים

ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה הוא קל יחסית לביצוע, מהיר, חסכוני, ובידיים מנוסות, כלי אמין במידה ניכרת לאבחון קו ראשון של דיסקינזיה סילארית ראשונית, שאמורה להיות זמינה בכל מרכז המעורב באבחון ובטיפול במחלות ריאה קשות.

ניתוח מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה לאבחון קו ראשון של דיסקינזיה סילארית ראשונית

פרוטוקול זה מתאר גישת לרינגוסקופיה טרנס-אוראלית סדרתית לעכברים וחולדות המאפשרת הדמיית וידאו מקרוב וללא הפרעה של הגרון במהלך הנשימה והבליעה באמצעות משטר הרדמה אופטימלי וטכניקות מניפולציה אנדוסקופיות מכווננות היטב.

לרינגוסקופיה זעיר פולשנית של עכברים להדמיה מקרוב של תנועת הגרון במהלך נשימה ובליעה

תרבית ממשק אוויר-נוזל משמשת בדרך כלל לפיתוח אפיתל דרכי נשימה פסאודוסטרטי על ידי התמיינות תאי אפיתל סימפונות אנושיים תקינים ראשוניים המחקים את הצד האפי של נתיב האוויר של הריאה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול קל לקביעת איכותו על ידי ניטור תכונותיו הביופיזיקליות, כגון תפקוד ריסוני ושלמות הממברנה.

קביעת תפקוד ריסני ואטימות הממברנה של אפיתל דרכי הנשימה הריאה הפסאודוסטרטי

שיטה זו מתארת את ניצול האות האנדוגני במודל עכבר טרנסגני ARL13B-CENTRIN-2 להדמיית ריסים ראשוניים באתרם, בתלת מימד על פני שטחים גדולים של רקמה מינרלית, מאיסוף רקמות ועד לניתוח ארגון הריסים. פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם גם על סוגים אחרים של רקמות.

הדמיה נפחית וניתוח ריסים ראשוניים ברקמת שריר ושלד באמצעות מודל העכבר ARL13B-CENTRIN-2

למד שיטת דימות ex vivo לניתוח תנועתיות צילה באפיתל של קנה הנשימה בעכברים באמצעות מיקרוסקופיית וידאו במהירות גבוהה. הפרוטוקול מאפשר מדידה כמותית של תדירות פעימות הצילה וזרימת הנוזלים הנוצרת על ידן.

שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia

גלה סרטונים נוספים