Name: רומן Ex vivo שיטת תרבות ללב העכבר העוברית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: למד שיטת תרבות ex vivo ללב עכבר עוברי באמצעות Matrigel מדולל. פרוטוקול זה מאפשר תצפית לטווח ארוך בפיתוח לב ותפקוד קרדיולוגי במודל עכברי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ברצוננו להודות לאנדראה Portbury לקריאה ביקורתית של כתב היד וNIH (מענק # R01HL061656) לתמיכה במימון.

1. מוציא את הלבבות עובריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר מתוזמן בהריון ביום העוברי הרצוי באמצעות טכניקת המתת חסד מאושרת. כל הניסויים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת שימוש באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ&#39;אפל היל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נדיבות לרסס את הנקבה עם אתנול 70% לפני הניתוח. פתח חלל הבטן של הנקבה כדי לאחזר והבלו קרן הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קרן הרחם בצלחת פטרי שמכילה תמיסת מלח קר 1x פוספט שנאגרו (PBS) ולשטוף במידת הצורך. גזור לפתוח קרן הרחם דרך קו האמצע לחשוף את שקי העובריים המצורפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור לפתוח השק עוברי ולאחזר עובר. הנח את העובר בצלחת פטרי שנייה עם PBS הקר. להחזיר את צלחת פטרי עם קרן הרחם לקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את העובר כדי לשפר את הגישה לקיר החזה. אם genotyping יש צורך, הסר אותו ולהציל את הזנב בצינור Eppendorf מונח על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עםהעובר על הגב שלה, לחתוך לפתוח את דופן בית החזה כדי להמחיש את הלב וריאות. בהתאם לבמה, קיר החזה עשוי להיות שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רם בזהירות את הלב באמצעות מלקחיים ולחתוך את כלי בהמשך. לאחר מכן, לחתוך מעל כלי הגדול כדי לשחרר את הלב. אם יש צורך, להסיר רקמות זרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הלב באחד טוב של צלחת 24 גם מלאות PBS הקר ומניח את הצלחת על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרו על השלבים הקודמים עד שכבר נכרת לב מכל העוברים. </li></ol> 2. תרבות Set-up <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בברדס למינרית, לשלב Matrigel קר ומדיום התרבות הרצויה (למשל 10% בסרום שור העובר (FBS) בהשתנה Dulbecco נשר בינוני (DMEM)) בביחס 1:1. לא מדיום התרבות מראש החם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירת Matrigel לדלל על קרח, פיפטה μl 500-1,000 של הפתרון המדולל היטב של צלחת תרבות 24 גם כי הוא נשמר גם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במכסת המנוע, להרים בזהירות ומניח נכרתלב בטוב של צלחת התרבות המכילה Matrigel תוך שמירה על צלחת התרבות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הכיוון של הלב המשובץ הוא קריטי: נדיבות לרסס מיקרוסקופ הפוכה ומרחב הסובב עם 70% אתנול. במכסת המנוע, הנח את הלב נכרת בטוב של צלחת התרבות המכילה Matrigel בעודו על קרח. לאחר מכן, הנח את הצלחת על מיקרוסקופ ובמהירות אוריינט הלב נכרת כMatrigel מתחיל לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת התרבות בhumidified 37 ° C חממה (5% CO 2) ולאפשר Matrigel לבסס לכ -30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיום התרבות מחומם מראש 1 מ&quot;ל לכל המכיל גם לב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבבות יכולים להישאר בתרבות במשך לפחות ארבעה ימים. שינוי התרבות בינונית כל יומיים מומלץ. </li></ol> 3. קיבעון ויזואליזציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, להוסיף צבע לחיות תאי ניאון (למשל Syto-16) כדי להמחיש את הלב החי. צילום יהיהמוגבל לצד של הלב, כי הוא גלוי הבוסס על המיקום שבו הוא משובץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ניתוחים שלאחר culturing (למשל כל הדמיה הר או חתך) יבוצעו, להסיר את מדיום התרבות ולהחליף עם 4% פורמלדהיד קר. מניחים את הצלחת על קרח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פורמלדהיד והקרח הקרים לקדם את פירוקה של Matrigel, החלף את המקבע (וMatrigel) עם פורמלדהיד הטרי ולתקן לבבות הלילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את לבם עם חיץ (למשל PBS או טריס) ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד ניתוח נוסף. </li></ol>

<ol><li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li>
<li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+signals+regulate+a+wave+of+Hedgehog+activation+that+is+essential+for+coronary+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development.</a> Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).</li>
<li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464, 549-553 (2010).</li>
<li>Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+and+retinoic+acid%2C+secreted+from+the+epicardium%2C+are+required+for+cardiac+myocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation.</a> Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FGF-BMP+signaling+axis+regulates+outflow+tract+valve+primordium+formation+by+promoting+cushion+neural+crest+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation.</a> Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).</li>
<li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+mouse+embryonic+heart+slice+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%3A+international+journal+of+experimental+cellular+physiology%2C+biochemistry%2C+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).</li>
<li>Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+heart+slices+for+cell+transplantation+and+physiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies.</a> Organogenesis. 5, 62-66 (2009).</li>
<li>Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+contractile+characteristics+of+human+myocardium+in+multi-day+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).</li>
<li>Brandenburger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+from+human+adult+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium.</a> Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).</li>
<li>Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp4+and+Fgf10+play+opposing+roles+during+lung+bud+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis.</a> Development. , 127-2695 (2000).</li>
<li>Viragh, S., Challice, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+epicardium+and+the+embryonic+myocardial+circulation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse.</a> Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).</li>
<li>Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKirby%2C+ML+%22Cardiac+Development%22">Cardiac Development</a>. , Oxford University Press. (2007).</li>
<li>Arima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מערכת התרבות הנוכחית מהווה יתרונות משמעותיים למחקרי לב עכבר עובריים. מערכת זו התרבות משמרת contractility שריר הלב ומקלעת כלילית, עם סימנים מוגבלים של נמק, גם לאחר ארבעה ימים בתרבות. יתר על כן, המטריצה ​​מוצקה למחצה מספקת מספיק תמיכה כדי לשמור על המורפולוגיה תלת ממדית של הלב תוך מתן אפשרות לפיתוח גמישות לחוזה וגם להחזיק חרוזים מצופים במקום במהלך התרבות. למרות התמיכה הזאת, מטריצה ​​זו היא חדירה לצבעי ניאון כגון Syto 16, המאפשרת ניאון ניתוח של הלב החי. <p class="jove_content" sty...

בשנים האחרונות, העכבר המהונדס כבר את מערכת המודל העיקרית לחקר התפתחות מומי לב. עם זאת, אורגניזמים מודל אחרים, כגון דג הזברה, שהוכחו יש יתרונות משמעותיים על פני העכבר. שלושה יתרונות עיקריים של דג הזברה הם הנחת החיצונית של ביצים, על מנת להקל על גישה לעוברים; שקיפות האופטית של העוברים, מה שמאפשרת הדמיה קלה של התפתחות לב, ואת הקלות של יישום טיפולים מולקולריים קטנים כדי לווסת את התפתחותו של העובר 1. לפיכך, הפיתוח של טכניקת התרבות שאפשרה צמיחת רחם לשעבר של איבר עוברי הייתי לעקוף, לפחות בחלקו, את המגבלות כיום חוו על ידי חוקרים לומדים תהליכי התפתחות בעכברים מהונדסים. מערכות תרבות לב לשעבר vivo פותחו בשניהם חומוס ועובר עכבר המאפשרים טיפול עם מולקולות קטנות וניתוח של איך אונטערשיידאזורים שונים שממפים של לב תקשורת 2-6. לכל עכבר תרבות לב, לב שנלקח מעוברים עד עוברי (E) יכול להיות ממוקמים בגיל 12.5 במדיום התרבות עם או בלי נדנדה 2,3,5. באמצעות טכניקה זו, לב עוברי טופח בהצלחה לשקילות של E13.5, ולב בתרבית עם נדנדה נשמר כל עוד שלושה ימים (החל משעת E10.5) 3. עם זאת, מחקרים לא דיווחו התרבות המוצלחת של לב מעוברים מבוגרים יותר. כמו כן, ניסויי הצלה היו מוגבלים להחלת הסוכן הטיפולי ברחבי העולם לתרבות בינונית 2. מערכת התרבות פרוסה, שבלבם הם נכרת, מוטבעים, ומחולק באמצעות vibratome, גם נוצלה לשני לבבות צעירים יותר, כגון E12.5 לבבות עכבר חומוס ולבבות בשלב 36 (כ E16 בעכבר) המבורגר-המילטון 2,4,6, ומעלה את לב, כמו שלאחר לידה ומבוגרים עכבר שעותearts ולבבות אדם מבוגר 7,8. בעוד שהניתוחים העובריים מנוצלים בדרך כלל סעיפי 2,4-150 מיקרומטר עבים, עובי סעיף יכול להיות גדול כמו 500 מיקרומטר ללא עדות למחסור בחמצן 8. תרבויות פרוסה אלה קוימו כל עוד חודשים בתרבות, עם רוב פרוסות שמירת contractility לאורך תקופה זו 9. בהשוואה למחקרים בcardiomyocytes מבודד, תרבויות פרוסה אלה מאפשרים שיתוף התרבות של cardiomyocytes עם סוגי התאים השכנים שלהם ולספק שיטה יעילה לניתוח vivo לשעבר. עם זאת, תרבויות אלה דורשים משוכללים יותר ההגדרה מאשר פשוט הצבת לב במדיום התרבות (למשל הטבעת הלב החי עבור חתך בvibratome), וכל ניתוח הוא כמובן מוגבל לחלק של הלב בתוך הקטע. בהתחשב במגבלות שתוארו לעיל ללב עכבר עוברי culturing והשפע של עכברים מהונדס אווהilable למחקר, פיתחנו מערכת לשעבר vivo עכבר לב התרבות דומה למערכת תרבות ריאות vivo לשעבר שפותחה על ידי ויבר, מערכת et al. 10 התרבות מאפשרת תרבות לטווח ארוך והדמיה של זרימת הדם הכליליים שיפוץ בתוך כל לב עכבר עוברי. בנוסף, השימוש בMatrigel מאפשר חרוזים שיתקיימו במקום סמוך ללב, ובכך לספק טיפול מקומי עם סוכנים טיפוליים. ניתן לבצע ניסויים אלה בנקודות זמן התפתחות שונות כדי להשוות את ההשפעה של טיפול שניתן בתהליך כגון היווצרות עורקים כלילית. בגלל מולקולות קטנות יכולות לנטרל באמצעות Matrigel, מערכת זו התרבות יכולה לשמש גם לאזורי התרבות גזורים של הלב אחד ליד שני כדי לקבוע אם אנשי קשר ספציפיים תאי תאים נחוצים לתהליכים התפתחותיים מסוימים או אם איתות paracrine מאזור אחד למשנהו צורך בכך. מערכת זו התרבותהוא פשוט יחסית, ובניגוד למערכת התרבות הפרוסה, עושה שימוש בחומרים כימיים תרבות הבסיסיות ולהגדיר קופצים, כי הם זמינים ברוב המעבדות. בקיצור, לב עוברי בתרבית ניכר בMatrigel לדלל, המספק תמיכה מוצקה למחצה. תמיכה זו היא מספיק כדי לשמור את המורפולוגיה תלת ממדית של הלב בעת גם מאפשר ללב חוזה. באמצעות מערכת זו, ניתן לשמור על לב שלם מעוברי עכברים מבוגרים יותר (E14.5-E16.5) בתרבות לתקופה של עד ארבעה ימים. מקלעת כלילית כולו נשמר, שלא כמו בתרבויות פרוסה, כך שכל רמזי איתות המתרחשים באזורים שונים של הלב להישאר בהווה. יתר על כן, צבעי ניאון לחיות תאים יכולים לחלחל Matrigel כדי לאפשר הדמיה של הלב החי, והוא יכול להיות ממוקמים חרוזים חלבון מצומדות ליד הלב כדי לספק מקור איתות מקומי. יחד, יתרונות אלו הופכים טכניקה זו שיטה אידיאלית ללימוד תהליכים התפתחותיים בembryonלב עכבר IC.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>עכברים</td><td></td><td></td> בהריון מתוזמן <td>לניתוח בשלב העניין העוברי</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה מופחת מטריג'ל</td><td>BD Bioscience</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Syto-16</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td>משמש לפי ההוראות ב-13 </td></tr><tr><td>צלחת תרבית 24 בארות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאוסקופי</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>חממת תרבית תאים</td><td>Thermo</td><td>3110</td><td></td></tr></tbody></table>

רומן<em&gt; ex vivo</em&gt; שיטת תרבות ללב העכבר העוברית

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

מחקרים התפתחותיים בעכבר הם הקשו על ידי חוסר הנגישות של העובר במהלך הריון. לפיכך, פרוטוקולים לבודד ואיברים בודדים התרבות של עניין חיוניים כדי לספק שיטה של ​​שתי אסטרטגיות הטיפול החדשניות לדמיין שינויים בפיתוח ומאפשרים. על מנת לקדם את התרבות לטווח הארוך של הלב העוברי בשלבים מאוחרים של הריון, פיתחנו פרוטוקול בו הלב נכרת הוא בתרבית Matrigel חצי מוצק, לדלל. מצע זה מספק מספיק תמיכה כדי לשמור על המבנה תלת ממדים, אבל הוא גמיש מספיק כדי לאפשר המשך התכווצות. בקיצור, לבבות הם נכרת מן העובר והניחו בתערובת של Matrigel הקר דילול 01:01 עם מדיום גידול. לאחר Matrigel המדולל מתמצק, מדיום גידול מתווסף למנת התרבות. לבבות עקורים מאוחר ככל יום עוברי 16.5 היו מעשיים עבור ארבעה ימים שלאחר נתיחה. ניתוח של מקלעת כלילית מראה כי שיטה זו אינהלשבש את התפתחות כלי דם כלילית. לפיכך, אנו מציגים שיטה חדשנית לתרבות לטווח הארוך של לב עוברי.

באמצעות טכניקה זו, הלב שומר מורפולוגיה תלת הממדים ונותר בת קיימא, כפי שצוין על ידי התכווצויות המשיכו (סרט 1). התכווצויות אלה הן באופן עקבי יותר בולטות בפרוזדורים מאשר בחדרי הלב. בעקבות התרבות, ניתן לתקן את לב ומעובד או אימונוהיסטוכימיה או היסטולוגיה לבחון ביטוי סמן ספציפי או מבנים. איור 1 א מציג את הבסיס של החדרים ועורקים גדולים של לב עוברי בעכבר שהיה בתרבית למשך 24 שעות, קבוע, ומעובד ל אימונוהיסטוכימיה לתייג האנדותל. micrographs confocal אלו מראה...

מחקרים התפתחותיים בעכבר הם הקשו על ידי חוסר הנגישות של העובר במהלך הריון. על מנת לקדם את התרבות לטווח הארוך של הלב העוברי בשלבים מאוחרים של הריון, פיתחנו פרוטוקול בו הלב נכרת הוא בתרבית Matrigel חצי מוצק, לדלל.

רומן<em&gt; Ex vivo</em&gt; שיטת תרבות ללב העכבר העוברית

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להוציא את הלב העוברי לצורך תרבית ex vivo. הדבר מבוצע תחילה על ידי הוצאת קרן הרחם מנקבת עכבר הרייה. לאחר מכן, מוצא עובר ומוכן לניתוח.לאחר מכן, פותח דופן בית החזה העוברי כדי לחשוף את הלב. לבסוף, הלב מוצא ומונח בבאר תרבית המכילה matrigel מדולל. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות לב חי ובריא באמצעות צפייה תחת מיקרוסקופ שדה בהיר (bright field microscope).היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון תרביות נדנודות (rocking cultures), הוא שניתן לטפל בלב באמצעות סוכנים מקומיים, כמו חלבון מצומד לחרוד, או באמצעות סוכנים גלובליים, כגון הוספת מולקולה קטנה ל-matrigel. המשמעויות של טכניקה זו משתגמרות לטיפול במחלות קרדיווסקולריות, כיוון שהיא מאפשרת לבחון אירועים בתוך מקטעים מיוחדים של הלב בהקשר של האיבר השלם והתקין. לאחר הרדמה והריגה של עכברה בהריון במועד הרצוי של היום העוברי, ובהתאם לטכניקה המאושרת על ידי המוסד שלך, יש לרסס בנדיבות את הנקבה ב-70% ethanol לפני פתיחת חלל הבטן ושליפת קרן הרחם וחיתוכה.הניחו את קרן הרחם בצלחת פטרי המכילה 1x PBS קר ושטפו אותה. הניחו את הצלחת על קרח עד למועד הדיסקציה. לאחר מכן, חתכו את קרן הרחם לאורכה לאורך קו האמצע כדי לחשוף את שקי העוברים הצמודים אליה.חתכו פתיחה של שק עוברי והניחו עובר בצלחת פטרי שנייה עם PBS קר. הניחו את הצלחת

a-novel-ex-vivo-culture-method-for-the-embryonic-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים את הנתיחה וvivo התרבות לשעבר של עור העוברי של עכבר. מערכת התרבות שומרת על ממשק אוויר נוזלי על פני השטח של הרקמות ומאפשרת הדמיה במיקרוסקופ הפוכה. Melanoblasts, רכיב של העור מתפתח, שכותרתו fluorescently המאפשרת את התנהגותם כדי להיות שנצפתה באמצעות מיקרוסקופ confocal.

אקס תרבות Vivo של עור העכבר עוברי וLive-הדמיה של הגירת Melanoblast

אנו מתארים סדרה של שיטות להזריק צבעים, וקטורי DNA, וירוסים, ותאים במטרה לעקוב אחר שני גורל התא והפנוטיפ של תאי אנדוגני והמורכבים שמקורם בתאים עובריים או pluripotent בעוברי עכברים ביום עוברי (E) 9.5 ושלבים מאוחרים יותר של פיתוח.

תיוג תא והזרקה בפיתוח לבבות עכבר עוברי

מוטציות המובילות למומי לב מולדים מפיקות תועלת מחקירה in vivo של מבנה הלב במהלך ההתפתחות, אך מחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה בלב העוברי של העכבר הם מאתגרים מבחינה טכנית. כאן אנו מציגים שיטת אימונופלואורסצנציה וניתוח תמונה חזקה להערכת מבנים ספציפיים לקרדיומיוציטים בלב העכבר המתפתח.

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

כאן, אנו מתארים שיטות לבידוד תאי אפיקרדיאלים ראשוניים של עכבר על ידי בדיקת תרבית צמיחה והערכת הנדידה התפקודית של תאים שמקורם באפיקרדיאלים (EPDC) באמצעות מערכת תרבית לב ex vivo. פרוטוקולים אלה מתאימים לזיהוי מודולטורים גנטיים וכימיים של מעבר אפיתל אפיקרדיאלי למזנכימלי (EMT) ותנועתיות.

Epicardial תולדת תרבות Assay ו<em&gt; Ex Vivo</em&gt; הערכה של נדידת תאים שמקורם Epicardial

לראשונה אנו מציגים כאן הליך רצועה הניתן לשחזור כדי לשנות את ההמודינמיקה בלב המתפתח ex ovo. זה מושג על ידי כיווץ חלקי של דרכי הזרימה (OFT).

רומן<em&gt; אקס אובו</em&gt; טכניקת פסים לאלטר ופרמטרים המודינמיים intracardiac במערכת עוף עוברי

האפיקרדיום הוא מקור חיוני לתאי אב קרדיווסקולריים רב-פוטנטיים ולגורמים פרקריניים הנדרשים להתפתחות והתחדשות הלב וכלי הדם. אנו מתארים כאן שיטה לתרבית תאים אפיקרדיאליים עובריים של עכברים.

במבחנה והתרבות של תאי Epicardial מתוך לב העכבר עוברי

בשיטה זו, רקמות הלב עובריים הם בניתוח microdissected, חלופה מועדפת, הנקרא fluorescently, מושתל לתוך רקמות עובריים המארח. זה מספק פלטפורמה לומד הפרט או רקמות ברמה התפתחותית הארגון תחת תנאים והמודינמיקה חוץ רחמי, ו/או שינו סביבות paracrine/juxtacrine.

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

אנו מציגים את הפרוטוקולים לבחון התפתחות הלב העכבר באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי הר שלם על העכבר עוברי גזור מן חדרית ספציפי MLC-2v-tdTomato כתב טוק-אין עכברים. שיטה זו מאפשרת לנו לבצע בכל שלב של היווצרות חדרית במהלך התפתחות הלב העכבר מבלי מהגידולים שיטות מעבדה הומנית.

ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence

הפרוטוקול הנוכחי מתאר תותח אבי העורקים וזליפה מדרדרת של לב מורין ילודים לשעבר .  אסטרטגיה של שני אנשים, באמצעות מיקרוסקופ ניתוח ומחט מד קטנה קהה, מאפשרת תותח אמין. כימות מתח התכווצות אורכי מושג באמצעות מתמר כוח המחובר לפסגת החדר השמאלי.

טכניקה שונה לשימוש בלבבות מורין יילודים בהכנת לנגנדורף

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתרבית והדמיית עוברי עכבר המאפשר הדמיה תלת ממדית + זמן של תאי אב לבביים. ערכת כלי וידאו זו מתייחסת למיומנויות המפתח הנדרשות להדמיה חיה מוצלחת שאחרת קשה לרכוש מפרסומים של טקסט בלבד.

הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים בעובר העכבר

פרוטוקול זה מציג מסגרת מתודולוגית מפורטת לטרנסגנזה מבוססת אלקטרופורציה של תאי לב בהתפתחות לבבות עכברים. נכסי הווידאו המסופקים כאן יקלו על למידה של טכניקה רב-תכליתית זו.

גישת טרנסגנזה יעילה להעברת גנים בלב העוברי של העכבר

למד שיטת תרבות ex vivo ללב עכבר עוברי באמצעות Matrigel מדולל. פרוטוקול זה מאפשר תצפית לטווח ארוך בפיתוח לב ותפקוד קרדיולוגי במודל עכברי.

רומן

גלה סרטונים נוספים