רומן Ex vivo שיטת תרבות ללב העכבר העוברית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכרות את הלב העוברי לתרבית ex vivo. זה מושג על ידי החזרת קרן הרחם תחילה מעכברה בהריון. לאחר מכן, העובר נשלף ומוכן לדיסקציה.

לאחר מכן נפתח דופן החזה העוברי כדי לדמיין את הלב. לבסוף, הלב נכרת ומונח בתרבית המכילה היטב מטריג'ל מדולל. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות לב חי בריא באמצעות צפייה במיקרוסקופ שדה בהיר.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות כמו תרביות נדנדה, הוא שניתן לטפל בלב באמצעות חומרים מקומיים כמו חלבון מצומד לחרוז, או באמצעות חומרים גלובליים, כגון הוספת מולקולה קטנה למטריג'ל. ההשלכות של טכניקה זו, היא משתרעת לכיוון טיפול במחלות לב וכלי דם מכיוון שהיא מאפשרת לבחון את האירועים בקטעים מיוחדים של הלב בהקשר של האיבר השלם כולו. לאחר המתת חסד של עכברה בהריון מתוזמן ביום העוברי הרצוי, באמצעות טכניקה שאושרה על ידי המכון שלך, רסס את הנקבה בנדיבות באתנול 70% לפני פתיחת חלל הבטן ושליפת קרן הרחם וכריתה.

מניחים את קרן הרחם בצלחת פטרי המכילה XPBS קר ושוטפים אותה. מניחים את המנה על קרח עד שהיא מוכנה לניתוח. לאחר מכן חתכו את קרן הרחם דרך קו האמצע כדי לחשוף את השקים העובריים המחוברים.

חותכים שק עוברי ומניחים עובר בצלחת פטרי שנייה עם PBS קר. מניחים את המנה עם קרן הרחם על קרח. לאחר עריפת ראש העובר, הניחו את העובר על גבו וחתכו.

פתח את דופן החזה כדי לדמיין את הלב והריאות. בהתאם לשלב, דופן החזה עשויה להיות שקופה. אם יש לבצע גנוטיפ, שמור את זנב העובר.

בעזרת מלקחיים הרם בזהירות את הלב וחתך את הכלים שמתחת. ואז חותכים מעל הכלים הגדולים כדי לשחרר את הלב. במידת הצורך, הסר רקמות זרות.

מניחים את הלב בבאר אחת של צלחת 24 בארות מלאה ב- PBS קר ויושבת על קרח. חזור על הדיסקציה כדי לבודד את כל הלבבות העובריים. בקולט אדים עם זרימה למינארית, שלבו ג'ל מאטרי קר ואת מדיום התרבית הרצוי ביחס של אחד לאחד תוך שמירה על ג'ל המטרי המדולל על הקרח.

פיפטה 500 עד 1000 מיקרוליטר של התמיסה לבארות של תרבית 24 בארות. צלחת את זה על קרח. בחרו בזהירות והניחו את הלבבות שנכרתו לבארות האישיות של צלחת התרבות המכילה מטריג'ל.

אם הכיוון של לב מוטבע הוא קריטי, השתמש באתנול 70% כדי לרסס בנדיבות מיקרוסקופ הפוך ואת החלל שמסביב. לאחר מכן לאחר עבודה במכסה המנוע להניח את הלב לבאר של ג'ל המחצלת על קרח. הניחו את הצלחת על במת מיקרוסקופ וכוונו במהירות את הלב כשג'ל המחצלת מתחיל להתמצק.

מניחים את צלחת התרבות בחממה לחה של 37 מעלות צלזיוס ומניחים לג'ל המטרי להתמצק למשך כ -30 דקות. הוסף מיליליטר אחד של תרבית מחוממת מראש, בינונית לכל באר המכילה לב. הלבבות יכולים להישאר בתרבית לפחות ארבעה ימים.

אם תרצה, הוסף תבנית תא חי פלואורסצנטי, כגון cyto 16. כדי להמחיש את צילום הלב החי יוגבל לצד הלב הנראה על סמך המיקום בו הוא הוטמע. אם תבוצע הדמיה או חתך של הרכבה שלמה, הסר את מדיום התרבית.

החליפו אותו בפורמלדהיד קר 4%, והניחו את המנה על קרח למשך 30 דקות. לאחר שהמטריג'ל מתמוסס, החליפו את הקיבוע והמטריג'ל בפורמלדהיד טרי וקבעו את הלבבות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. שטפו את הלבבות עם PBS או Triss ואחסנו בארבע מעלות צלזיוס עד לניתוחים נוספים.

בתרבית ex vivo במשך 24 שעות, כלי הדם הכליליים נראים כמו לב שנכרת מעובר בגיל דומה שנשמר ברחם כפי שמוצג כאן. ניתוח המט, טואין ואואין של לבבות שנכרתו ב-E 16.5 ותורבת ex vivo במשך ארבעה ימים מראה כי המורפולוגיה הכוללת, כולל דפנות העורקים הגדולים ושריר הלב המחיצה החדרית והבין-חדרית של הלב נשארת שלמה למרות היעדר זרימת הדם. האוסטיאו הכלילי נראה כפי שמצוין על ידי ראש החץ.

עם זאת, פיצול DNA המסומן בחיצים ונצפה הן עם h והן עם d ו-DAPI ניכר בשריר הלב הקומפקטי וסביב הכלים הגדולים. יתר על כן, שריר הלב פחות צפוף בהשוואה ללב מעובר E 18.5 שהתפתח ברחם למרות שהלב המתורבת ex vivo עדיין פועם. לפיכך, ישנן מגבלות על משך הזמן או השלב שבו ניתן לשמור על הלבבות הללו.

ניתן להשתמש בטכניקת תרבית זו גם לסימון פלואורסצנטי של לבבות, בעוד שבתרבית לאחר הדגירה עם צבע פלואורסצנטי ספציפי לאנדותל, לבבות מתורבתים במשך 48 שעות. במקרה זה, ההדמיה מוגבלת על סמך כיוון הלב ואטימות הרקמה. חתכים היסטולוגיים עוקבים דרך שריר הלב החדר מאשרים כי ציטו 16 יכול לחדור לשכבות התאים החיצוניות כדי לסמן כלי דם תת-אפיקרדיאלים בתוך החדרים ומשתלב עם סלקטין כפי שמודגם כאן לאחר תרבית ex vivo במשך 30 שעות, לב שנכרת מעובר E 14.5 מראה התכווצות וקצב עקביים בין הפרוזדורים לחדרים.

בעת ביצוע טכניקה זו, חשוב להיות עדין וזהיר בעת כריתת הלב. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכרות ולתרבית לב עכבר עוברי.