Name: Medullary העכברוש הראשוני culturing הפנימי איסוף תאי Duct (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: למד לבודד ולגדל תאי IMCD ראשוניים ממוח העכברוש לחקר מנגנוני ספיגת מים מווסתת על ידי AVP. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח ביולוגיית תאים כליתית ותפקוד כלייתי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG; KL 1415/3-2 וKL 1415/4-2).

1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את מנות התרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירו קולגן סוג IV O / N ב 4 ° C ולפזר אותו בחומצה אצטית 0.1% סטרילית. הנפח להשתמש תלוי בסוג ובמספר המנות שבתאים שנזרעו. השתמש 2 מיקרוגרם / 2 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מנות לפחות במשך שעה 1 ב RT ולשטוף פעמיים עם מים מזוקקים (א tridest). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את הכלים לייבוש כמו שצריך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוספת של מדיום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדל את רמת הגלוקוז עד 4.5 גר &#39;/ ל&#39; על ידי הוספה גרם גלוקוז 1.75 עד בינונית 500 מ&quot;ל. כדי להתאים את המדיום ל600 mosmol, להוסיף 100 מ&quot;מ NaCl ואוריאת 100 מ&quot;מ, כדי להגדיל את osmolarity ב -200 mosmol ו100 mosmol, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חומצות 1% שאינם חיוני אמינו, 1% ultroser, DBcAMP 500 מיקרומטר, 20 nystatin U / מ&quot;ל ​​ו0.25 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין (1:200 דילול של פתרון מניות עם ריכוז של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) עד ​​600 מדיום DMEM mosmol טרי ביום ההכנה. </li></ol></p&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון אנזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מ&quot;ג / מיליליטר hyaluronidase 1 ו -2.2 collagenase מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​לDPBS המכיל 0.25 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​גנטמיצין וnystatin. להכין 1 מ&quot;ל של תמיסת אנזים זה לעיכול של medullae 2 הכליות פנימית. הפתרון חייב להיות מעוקר על ידי סינון ומאוחסן ב50 צינורות מ&quot;ל פלקון. </li></ol></li></ol> 2. טיפוח של Medullary פנימי עכברוש הראשוני איסוף צינור (IMCD) תאים כל נהלי הטיפול בבעלי החיים הם להתבצע בהתאם לחקיקה פדרלית והמקומית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש בחולדות CO 2 (בתיבה רוויה עם CO 2) או isoflurane (U-400 אלחוש יחידה, Univentor בע&quot;מ, מלטה; זרימת אוויר 350-400 מ&quot;ל / דקה עם 2-2.5% isoflurane). לערוף את החיות לדימום המאפשר זיהוי של גבול שבין הפנימי לבנבן והלשד החיצוני הכהה יותר מדויק. בנוסף, הדימום ממזער את מספר אריתרוציטים בודדים. הסר כליות ולשטוף אותם בDPBS סטרילית השלים עם גנטמיצין וnystatin (ראה לעיל) על קרח. כל צעדים נוספים הם להתבצע בתנאים סטריליים ספסל נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הכליות מפתרון DPBS על לדחוס סטרילי כדי להסיר נוזל מוגזם. הסר את הקפסולה כליות שומן עם מלקחיים ומספריים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהכליות עדיין קבועות ברטייה, לחתוך מעט ליד ציר האורך של הצד החיצוני (קליפת המוח). הקפד לא לחתוך לגמרי, אבל כדי להשאיר אותו בחתיכה אחת, מחובר באגן הכליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מספריים מעוגלים לנתח medullae הפנימי לבנבן, שמוקפים בלשד החיצוני נצנץ רוזה בזהירות. לאסוף אותם בDPBS, המכיל גנטמיצין וnystatin בצלחת תרבות 60 מ&quot;מ על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שכל medullae מבודד ונאסף על קרח, להפחית את עוצמת הקול של DPBS לרמה שבה הם פשוט מכוסים במאגר. השתמש בסכין גילוח סטרילית לחתוך לקוביות של medullae 5מ&quot;מ 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממסים ולעגל את הקצה החד של פסטר פיפטה סטרילית על ידי מחזיק אותו לזמן קצר לתוך להבה. ודא פיפטה היא מקוררת לפני שתמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה הרקמות ל50 צינורות מ&quot;ל פלקון המכילים פתרון אנזים סטרילי מוכן טרי עם hyaluronidase וcollagenase (ראה 1.3.1) על ידי השימוש בפיפטה פסטר המעוגלת. סגור את המכסה בחוזקה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס תחת תסיסה מתמשכת (220 סל&quot;ד) באמבטיה רגילה שולחן מים עבור 1.5 - 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטחינה דקה של ההשעיה, פיפטה את התערובת מעלה ומטה מספר פעמים עם סיבוב פיפטה פסטר (ראה לעיל) ועד להשעיה הופכת עכור הומוגנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה למשך 5 דקות ב 300 XG ו16 ° C. בטל supernatant, resuspend את הכדור באופן יסודי בDPBS, המכיל גנטמיצין וnystatin ו צנטריפוגות שוב. חזור על שלב שטיפה זה פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים במדיום וזרעם לג בתוספת באופן מלאמנות ulture ו / או צלחות גם מיקרו כייל. הכנת 2 medullae (בעלי החיים 1) תניב תאים יספיקו לצלחת תרבות 60 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, לשטוף תאים פעמיים עם 600 mosmol DMEM ולהוסיף מדיום חדש. במהלך השבוע הבא יש לשטוף את התאים 2-3 פעמים (איור 1). 6-8 ימים לאחר זריעה, תאי IMCD יכולים לשמש לניסויים. זכור לדגירה אותם במדיום בלי DBcAMP וnystatin למשך 24 שעות לפני תחילת הניסוי. אחרת AQP2 יהיה ממוקם באופן בלעדי בקרום הפלזמה. </li></ol>

<ol><li>Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mouse+cortical+collecting+duct+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line.</a> Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).</li>
<li>Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+human+cell+line+transformed+by+DNA+from+human+adenovirus+type+5%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+general+virology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5.</a> The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).</li>
<li>Gluzman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SV40-transformed+simian+cells+support+the+replication+of+early+SV40+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants.</a> Cell. 23, 175-182 (1981).</li>
<li>Ala, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+twelve+mutant+V2+vasopressin+receptors+related+to+nephrogenic+diabetes+insipidus%3A+molecular+basis+of+a+mild+clinical+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).</li>
<li>Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+strains+of+MDCK+cells+which+resemble+separate+nephron+tubule+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+2+Promotes+Cell+Migration+and+Epithelial+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).</li>
<li>Perantoni, A., Berman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+Wilms%27+tumor+line+%28TuWi%29+and+pig+kidney+line+%28LLC-PK1%29+typical+of+normal+kidney+tubular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro%22%5BJournal%5D)">Properties of Wilms' tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium.</a> In vitro. 15, 446-454 (1979).</li>
<li>Katsura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+and+regulated+membrane+expression+of+aquaporin+1+and+aquaporin+2+water+channels+in+stably+transfected+LLC-PK1+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).</li>
<li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+characteristics+of+a+pig+kidney+cell+strain%2C+LLC-PK%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro%22%5BJournal%5D)">The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK.</a> In vitro. 12, 670-677 (1976).</li>
<li>Nedvetsky, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+aquaporin-2+abundance+and+degradation+by+protein+kinase+A+and+p38-MAP+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).</li>
<li>Iolascon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Two+Novel+Missense+Mutations+in+the+AQP2+Gene+Causing+Nephrogenic+Diabetes+Insipidus%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus.</a> Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).</li>
<li>Deen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-2+transfection+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+reconstitutes+vasopressin-regulated+transcellular+osmotic+water+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).</li>
<li>Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D'Ettorre, C., Svelto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+functional+analysis+of+water+channels+in+a+stably+AQP2-transfected+human+collecting+duct+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).</li>
<li>Steele, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+immortalization+of+principal+cells+from+mouse+collecting+duct%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).</li>
<li>Bens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroid-dependent+sodium+transport+in+a+novel+immortalized+mouse+collecting+duct+principal+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).</li>
<li>Hasler, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+regulation+of+aquaporin-2+expression+in+vasopressin-responsive+renal+collecting+duct+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).</li>
<li>Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasopressin+inhibits+apoptosis+in+renal+collecting+duct+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).</li>
<li>Kleinman, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+complexes+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane complexes with biological activity.</a> Biochemistry. 25, 312-318 (1986).</li>
<li>Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmolality+and+solute+composition+are+strong+regulators+of+AQP2+expression+in+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).</li>
<li>Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-2+expression+in+primary+cultured+rat+inner+medullary+collecting+duct+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells.</a> Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).</li>
<li>Liebenhoff, U., Rosenthal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Rab3-%2C+Rab5a-+and+synaptobrevin+II-like+proteins+in+a+preparation+of+rat+kidney+vesicles+containing+the+vasopressin-regulated+water+channel%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel.</a> FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).</li>
<li>Lorenz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+is+sufficient+for+triggering+the+exocytic+recruitment+of+aquaporin-2+in+renal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells.</a> EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).</li>
<li>Tamma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prostaglandin+E2+analogue+sulprostone+antagonizes+vasopressin-induced+antidiuresis+through+activation+of+Rho%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho.</a> J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).</li>
<li>Maric, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+volume+kinetics+of+adherent+epithelial+cells+measured+by+laser+scanning+reflection+microscopy%3A+determination+of+water+permeability+changes+of+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells.</a> Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).</li>
<li>Gonzalez, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+stimulates+renin+in+inner+medullary+collecting+duct+cells+via+protein+kinase+C+and+independent+of+epithelial+sodium+channel+and+mineralocorticoid+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity.</a> Hypertension. 57, 594-599 (2011).</li>
<li>Chou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aquaporin-2+trafficking+by+vasopressin+in+the+renal+collecting+duct.+Roles+of+ryanodine-sensitive+Ca2%2B+stores+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).</li>
<li>Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+native+inner+medullary+collecting+duct+cells+from+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney.</a> Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).</li>
<li>Tchapyjnikov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+nuclei+from+native+renal+inner+medullary+collecting+duct+cells+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS.</a> Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).</li>
<li>Stefan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+cAMP-dependent+signaling+by+phosphodiesterase-4D+is+involved+in+the+regulation+of+vasopressin-mediated+water+reabsorption+in+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).</li>
<li>Klussmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitory+role+of+Rho+in+the+vasopressin-mediated+translocation+of+aquaporin-2+into+cell+membranes+of+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells.</a> J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אנו מציגים פרוטוקול מפורט להכנה וculturing של תאי IMCD עכברוש ראשוניים. גישת תשואות של עד 21 ס&quot;מ 2 של תאים מחולדה אחת 20. הניסוי דורש ציוד תרבית תאים סטנדרטי ויכול להתבצע על ידי אדם אחד בתוך כ 6 שעות. לכן, גישה זו היא מתאימה כמו שיטת מעבדה סטנדרטית. ניתן זורעים תאי IMCD עכברוש עיקריים במנות התרבות של גודל שונה, הנעים בין 96 ל -60 צלחות גם מנות מ&quot;מ. עם זאת, לצמיחה ב384 פורמט גם ההלי...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/50366">Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells</a>. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to: Enno Klussmann instead of: Enno Klussman

A correction to author list has been made for article Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells.

Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

בתאים עיקריים צינור איסוף כליות, ארגינין-וזופרסין (AVP) שולט במים על ידי גירוי ספיג חוזר של החדרת המים ערוץ aquaporin-2 (AQP2) לתוך קרום הפלזמה. AVP נקשר לרצפטור וזופרסין סוג 2 G-חלבון בשילוב (V2R) גירוי cyclase adenylyl ובכך היווצרות cAMP. תחילתו של מפל איתות זה מובילה להפעלה של החלבון קינאז (PKA). PKA phosphorylates AQP2 בסרין 256 (S256), המהווה את הגורם העיקרי לחלוקה מחדש שלה משלפוחית ​​תאיות לתוך קרום הפלזמה. הכניסה הקרום מאפשרת ספיגה חוזרת של מים לאורך שיפוע האוסמוטי ועדינות מנגינות הומאוסטזיס מים בגוף. Dysregulation של ספיגת מים AVP בתיווך, בשל סטיות של הפרשת AVP או גורמי איתות AVP-מופעלים או קשור למחלות קשות. ירידה נגרמה על ידי מוטציות של V2R או AQP2 ספיגת מים מובילה לסוכרת תפלה nephrogenic, בעוד שגובה מעל פני יםרמת AVP פלזמה דם ated קשורה לספיגת מים מוגזמת במחלות לב וכלי דם, כגון אי ספיקת לב כרונית ותסמונת של הפרשת הורמון antidiuretic הולמת (SIADH). המשמעות של ספיגת מים AVP בתיווך נובעת לא רק מההשלכות שלה במחלה. טרנסלוקציה-Induced AVP של שלפוחית ​​AQP2 נושאים ולאיחוי עם קרום הפלזמה מייצגת תהליך exocytic קפדנות מחנה תלוי, אשר כיום אינה מובנת היטב. דוגמאות אחרות לexocytosis מחנה תלוי הן הפרשת רנין בכליה וH + הפרשה בבטן. לכן, הבהרת מנגנונים מולקולריים השולטים AQP2-טרנסלוקציה בתאי הכליה עיקריות לא רק עוזרת להבנת תהליכים מולקולריים דומים בסוגי תאים אחרים, אלא גם עשויה לסלול את הדרך לטיפולים חדשים לטיפול במחלות הקשורות להפרעות בספיגת מים AVP בתיווך . Elucidating AQP2 שליטה מנגנונים דורש איסוף מודלים תא עיקריים דביק. לשם כך מספר שורות תאי כליות יונקים שונים זמין. עם זאת, המודלים האלה יש כמה חסרונות. במערכות סלולריים רבות את רמת החלבון של AQP2 היא נמוכה (טבלת 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, אחרים ectopically overexpress אדם (MCD4, WT10) 11,12 או עכברוש (CD8) 13 AQP2. בMCD4 וCOS-7 תאים רצפטור V2 לא בא לידי ביטוי. למיטב ידיעתנו אין קו תא קבוע כמודל זמין, הנגזר מאיסוף הצינור הלשדי הפנימי כליות, את אותו חלק של הכליה בי AQP2 הביטוי הוא נפוץ ביותר, אבל מצינור 1,11,13-16 קליפת המוח האיסוף . מודלים תא כאלה הם למשל mpkCCD הונצח בשימוש נרחב (לדוגמה 17) או את 14 קווים שהוקמו לאחרונה mTERT-CCD הסלולרי. שתי שורות תאי endogenously המפורש AQP2 וV2R אבל מאז הם הנגזריםצינור איסוף קליפת המוח הקרוב לוודאי מכיל proteome שונה לעומת לשדי פנימי איסוף צינור (IMCD) תאים. הם חייבים להביע למשל Na שונה + מערכות תחבורה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתאי IMCD עיקריים תרבות המבטאים V2R וAQP2 endogenously. מודל זה, אם כן, מייצג באופן קרוב ביותר את המצב הפיזיולוגי בצינור איסוף הכליות. כביסוס התרבות דורש רק תקן מעבדות אחרות ציוד מעבדה יכולות בקלות לאמץ את הגישה הזו.

<table><tbody><tr><td>קולגן סוג IV עכבר</td><td>BD Biosciences</td><td>356233</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>SIGMA</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז מסוג CLS-II</td><td>Biochrom AG</td><td>C2-22</td><td></td></tr><tr><td>DMEM +</td><td>GlutMAX Invitrogen GIBCO</td><td>21885108</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>SIGMA</td><td>N4014</td><td></td></tr><tr><td>Ultroser G</td><td>Cytogen</td><td>15950-017</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות (NEA)</td><td>Biochrom AG</td><td>K0293</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Invitrogen GIBCO</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>DBcAMP</td><td>BIOLOG</td><td>D009</td><td></td></tr></tbody></table>

medullary העכברוש הראשוני culturing הפנימי איסוף תאי duct

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

ארגינין-וזופרסין (AVP) מאפשר ספיג חוזר של מים על ידי כליות איסוף תאים עיקריים צינור ובכך עדינות מנגינות הומאוסטזיס מים בגוף. AVP נקשר לקולטנים V2 זופרסין (V2R) על פני השטח של התאים ובכך גורם לסינתזה של cAMP. זה מגרה תהליכי איתות תאיים מובילים לשינויים בזירחון של תעלת המים aquaporin-2 (AQP2). חלבון קינאז phoshorylates AQP2 ובכך מעורר את טרנסלוקציה של AQP2 משלפוחית ​​תאיות לתוך קרום הפלזמה להקל ספיגת מים משתן ראשוני. סטיות של שחרור מAVP איתות יותרת המוח או AVP המופעל בתאים עיקריים יכולות לגרום לסוכרת תפלה מרכזית או nephrogenic, בהתאמה; רמה גבוהה בדם פלזמה AVP קשורה למחלות לב וכלי דם, כגון אי ספיקת לב כרונית ותסמונת של הפרשת הורמון antidiuretic לא הולמת. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לcultivatiמלשד פנימי עכברוש העיקרי איסוף צינור (IMCD) תאים, שמבטא V2R וAQP2 endogenously. התאים מתאימים להבהרת מנגנונים מולקולריים שבבסיס הבקרה של AQP2 ובכך לגלות מטרות תרופה חדשות לטיפול במחלות הקשורות לחוסר ויסות של ספיגת מים AVP בתיווך. תאי IMCD מתקבלים מmedullae פנימי כליות חולדה ומשמשים לניסויים שישה עד שמונה ימים לאחר זריעה. יכולים להיות מתורבתים תאי IMCD במנות רגילות תרבית תאים, צלוחיות וצלחות מייקר כייל של פורמטים שונים, ההליך דורש רק כמה שעות, והוא מתאים למעבדות תרבית תאים סטנדרטיות.

הגידול המוצלח של תאי IMCD עכברוש עיקריים יביא בשכבת מחוברות 6-8 ימים לאחר הזריעה (איור 2). למנת תרבות 60 מ&quot;מ יש כ 6 x 10 6 תאים. התאים בחוזקה לדבוק במנות התרבות, שכן אלה היו מצופים בקולגן הסוג IV, מרכיב קרום במרתף 18. לכן, תאי IMCD לא לנתק גם במספר הליכי שטיפה יסודי. עד 80% מהתאים בתרבית ולהביע V2R AQP2 endogenously. אלה הם תאים העיקריים, ואילו התאים חסרי AQP2 נחשבים תאי intercalated, תאים שאינם IMCD נגזרים מגפיים דקיקים של הלולאה של Hen...

ארגינין-וזופרסין (AVP) שולט בכוונון עדין של איזון מים בגוף דרך להקל על ספיגת מים על ידי תאי הכליה עיקריות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגידול מדולרי פנימי עכברוש העיקרי איסוף תאי צינור המתאימים להבהרת מנגנונים מולקולריים שבבסיס ספיג חוזר של מים AVP בתיווך.

Medullary העכברוש הראשוני culturing הפנימי איסוף תאי Duct

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק תאי צינורות מאספים פנימיים של המוחה (IMCD cells) מחולדה, המתאימים לחקר ספיגה חוזרת של מים המתווכת על ידי VP. דבר זה מושג תחילה על ידי הסרת הכליות של החולדה. השלב השני הוא בידוד המוחה הפנימית מהמוחה החיצוני ומהקליפה (cortex) שסביבה.בשלב הבא, המלי הפנימיים עוברים עיכול אנזימטי כדי לשחרר תאים בודדים. השלב הסופי הוא השעיה ובחירה של תאים ראשיים (principal cells), ולאחר מכן זריעתם בצלחות תרבית. בסופו של דבר, ששה עד שמונה ימים לאחר הזריעה, התאים מוכנים לשימוש בניסויים.מערכת תרבית התאים מתאימה להבהרה של מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס ספיגה חוזרת של מים המתווכת על ידי VP, וייתכן שגם לתהליכי TIC אחרים התלויים ב-CAP. בנוסף, ניתן להשתמש במערכת לגילוי מועמדים לתרופות חדשות ומטרות תרופתיות לטיפול במחלות הקשורות להפרעה בבקרת ספיגה חוזרת של מים המתווכת על ידי VP. הפרוצדורה תודגם על ידי סטודנט לדוקטורט מהמעבדה שלנו ועל ידי Beata Eman ו-Andrea Giller, שתיים מהטכנאיות במעבדתנו.בהתאם לציר הזמנים המוצג כאן, ציפו את כלי התרבית בקולגן מסוג 4, יום לפני הפרוצדורה שתתבצע למחרת. ראשית, הכינו את המצע ותמיסות האנזימים. הוסיפו תוספים למצע DMEM שהוכן טרי.להכנת תמיסת האנזים, הוסיפו 1 mg/mL hyaluronidase ו-2.2 mg/mL Collagenase ל-DPBS מסונן. סטריליזו את התמיסה ואחסנו אותה במבחנת Falcon של 50 mL.הכינו מיליליטר אחד של תמיסת אנזימים עבור כל שתי מדולות פנימיות של כליה שעוברות עיכול. השלב המורכב ביותר בפרוטוקול זה הוא הדיסקציה של המדולות הפנימיות. כדי להבטיח הצלחה, יש לרוקן את הדם מהבעליים לפני הדיסקציה, דבר המקל על זיהוי הגבול המנצנץ בין המדולות הפנימיות והחיצוניות לאחר ההמתה.הוצא את הכליות ושמור אותן ב-DPBS סטרילי שהוכן קודם לכן. בעבודה בתנאים סטריליים, העבר את הכליות מתמיסת ה-DPBS, שתוספה ב-Gentamicin Nystatin, אל גזה סטרילית כדי להסיר עודפי נוזל.בשלב הבא, בעזרת סכין מנתחים סטרילית, הסירו את קפסולת הכליה השומנית בעוד הדגימה מקובעת על התחבושת. בצעו חתך בקרבת הציר האורכי של הצד החיצוני או הקורטיקלי. הקפידו לא לחתוך לחלוטין, אלא להשאיר את הרקמה כחלק אחד המחובר עדיין באגן הכליה.בשלב הבא, זהו את המדולה החיצונית בצבע ורדרד ומנצנץ ואת המדולה הפנימית הלבננה. בעזרת מספריים קמורות, נתקו בזהירות את המדולה הפנימית מהמדולה החיצונית שמסביבה. העבירו את הרקמה לתמיסת ה-DPBS שהוכנה קודם לכן.לאחר שכל ה-Meli בודדו ונאספו על קרח, יש להפחית את נפח תמיסת ה-DPBS, המועשרת ב-Gentamicin וב-Nystatin, לרמה שבה הם מכוסים בקושי בבופר. השתמשו בלהב תער סטרילי כדי לחתוך את ה-Meli לקוביות של כ-5 mm³. לאחר מכן, המיסו ועגלו את הקצה החד של פיפטת פסטי סטרילית על ידי החזקתה לזמן קצר בלהבה.לאחר הקירור, השתמשו בפפטה זו כדי להעביר את ת сусפנזיית הרקמה למבחנת Falcon של 50 מיליליטר המכילה את תמיסת האנזימים הסטרילית והטריה שהוכנה מראש. הניחו את המבחנה במקלח מים והדגירו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius תחת ערבוב רציף למשך שעה וחצי עד שעתיים.לאחר זמן זה, העבירו את התערובת למעלה ולמטה מספר פעמים בעזרת השאיבה של הפיפטה עד שהסספנסיה תהפוך לעכורה באופן הומוגני. לאחר הומוגניזציה יסודית, סבבו את הסספנסיה בצנטריפוגה למשך חמש דקות. לאחר מכן, השליכו את הסופרנאטנט.שעלק את המשקע וסבב שוב בצנטריפוגה. חזור על שלב שטיפה זה פעם נוספת. שביב מחדש את התאים במצע מוסיף באופן מלא והזרק אותם לכלי תרבית או ללוחיות מיקרוטיטר; מיד לאחר הזריעה ניתן להעריך תאי IMCD מבודדים, כמו גם אריתרוציטים ושאריות תאים, תחת המיקרוסקופ.פעולה זו תספק הערכה ראשונית של מספר התאים שהבודדו לאחר 24 שעות. יש לשטוף את התאים ב-DMEM בריכוז 600 milli osmoles ולהוסיף מצע טרי. במהלך השבוע הבא, יש לשטוף את התאים פעמיים עד שלוש פעמים.תאי IMCD צריכים להיות מוכנים לניסויים שישה עד שמונה ימים לאחר הזריעה, כאשר הם גדלים עד להגעה למצב של confluence כפי שניתן לראות כאן. זכרו לדגור את התאים במצע ללא DBC MP ו-INE למשך 24 שעות לפני תחילת הניסוי. אחרת, aquaporin two ימוקם בעיקר בממברנת הפלזמה.גידול מוצלח של תאי IMCD ראשוניים של חולדה יביא ליצירת שכבה חד-שכבתיות רציפה (confluent monolayer) שישה עד שמונה ימים לאחר הזריעה; כאשר הם מעוררים על ידי arginine, vasopressin, או forskolin, חלבון aqp two עובר מהבזולות התוך-תאיות לממברנת התא, כפי שנראה כאן. בנוסף, ביטוי AQP two בתאי IMCD עולה לאחר גירוי של 30 דקות עם VP או forline, כפי שמוצג ב-western blot זה. לאחר הליך זה, ביצוע בידוד DNA/RNA, וניסויי RT-PCR ו-Immunoprecipitation.ניתן לבצע אנליזת Western blood ומיקרוסקופיה של אימונופלורסצנציה כדי לנתח גנים ותוצרי גנים של תאי צינורות איסוף של הכליה. מערכת תרבית תאים זו, המבטאת חלבונים אנדוגניים, אטרקטיבית במיוחד לשימוש בגישות של סריקה בלתי מוטה.

culturing-primary-rat-inner-medullary-collecting-duct-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זהו פרוטוקול המתאר כיצד לבודד תרבות נוירונים אוהד העיקרי של הגנגליונים צוואר הרחם מעולה (SCG) של גורי חולדה היילוד.

פרוטוקול נוירונים culturing הסימפתטית מן הגרעינים עכברוש צוואר הרחם מעולה (SCG)

אנו מתארים מתודולוגיה מהירה לבודד ותרבות נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח של עוברי מכרסמים. פרוטוקול זה מאפשר לנו לבצע ניסויים שבהם תרבויות עצביים כמעט טהור נדרשים.

בידוד והתרבות של תאים עובריים עצביים עכברוש: ​​פרוטוקול מהיר

בסרטון זה, אנו מדגימים את השלבים לבידוד וטיהור תאי אפיתל צינוריים של הכליה עבור מגוון רחב של מחקרים בביולוגיה מולקולרית ובתרביות תאים.

בידוד תאי כליות מורין: טכניקה לבודד וליצור תרבית ראשונית של תאי אפיתל צינורית הכליה

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאי גרעיני שורש גבי (DRG) מעמוד השדרה של החולדה. DRGs שנכרתו מעמוד השדרה מטופלים באנזימים ומנתקים מכנית כדי להשיג תרחיף חד-תאי. התאים מגודלים בתרבית בתווך המכיל מעכבים וגורמי גדילה המגבילים את התפשטות תאי הגליה ומקדמים צמיחה עצבית, בהתאמה.

הקמת תרבית תאי גרעיני שורש גבי ראשונית מעמוד השדרה של חולדה

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד, תרבות, הסתיידות של עכברוש-derived שסתום תאים ביניים, דגם מאוד פיזיולוגיים במבחנה של מחלת שסתום אבי העורקים calcific (CAVD). ניצול של מודל זה עכברוש מקלה על מחקר CAVD לחקור את התא ואת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תהליך פתולוגי מורכב זה.

בידוד ואפיון של החולדה הראשית שסתום תאים ביניים: מודל חדש ללמוד הסתיידות שסתום אבי העורקים

פרוטוקול זה מספק גישה חסכונית כדי לבודד ולאפיין העכבר הראשי כליות צינורי תאים יכולים לאחר מכן להיות תת תרבותי להערכת תפקודים ביולוגיים כליות ex-vivo, כולל ביואנרגיה מיטוכונדריאלי.

ניתוח השטף חוץ-תאי בידוד, אפיון, תפוקה גבוהה של העכבר הראשי כליות צינורי בתאי אפיתל

ההורמון מופרש על ידי קליפת יותרת הכליה חיוני לבעלי מפני סטרס ומחלות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבות החולדה הראשית תאי בלוטת יותרת הכליה. זה יכול להיות פלטפורמה במבחנה טוב עבור חוקרים את המנגנונים מהתרכובת עניין steroidogenesis בלוטת יותרת הכליה, ביוסינטזה השומנים.

תרבות העיקרי של תאים Adrenocortical חולדה, מבחני של פונקציות שחלת בקר

פרוטוקול זה מנסה לקבוע פרוטוקול חוזר עבור נוירונים ראשוניים ובידוד גליה מ שלפוחית השתן של חולדה לניסויים תאיים נוספים.

בידוד ותרבות של נוירונים ראשוניים גליה משלפוחית השתן של חולדה בוגרת

מאמר זה מתאר את הבידוד וההתלות של נוירונים אוהדים של חולדה עוברית מגנגליה צוואר הרחם מעולה. הוא גם מספק פרוטוקולים מפורטים עבור כתמים חיסוניים והכנת תמציות עצביות לניתוח ספקטרומטרי מסה.

חולדה Culturing נוירונים סימפטיים מגנגליה צוואר הרחם מעולה עוברית לניתוח מורפולוגי ופרוטונומי

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לבידוד תאי מולר ראשוניים ברשתית מחולדות Sprague-Dawley (SD) יילודים. ההליך כולל הוצאת גלגלי העין, דיסקציה של רקמת הרשתית, מיצוי וזיהוי תאים, ושיקולים מרכזיים לתרבית תאים לאחר מכן.

בידוד ותרבית של תאי מולר רשתית ראשוניים מחולדות Sprague-Dawley (SD)

למד לבודד ולגדל תאי IMCD ראשוניים ממוח העכברוש לחקר מנגנוני ספיגת מים מווסתת על ידי AVP. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח ביולוגיית תאים כליתית ותפקוד כלייתי.

Medullary העכברוש הראשוני culturing הפנימי איסוף תאי Duct

גלה סרטונים נוספים