Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשוות תמונות של הפרופילים המטבוליים של קבוצות שונות של דגימות ביולוגיות. זה מושג על ידי שימוש במיצוי נוזלי ונוזלי להפרדת מולקולות אורגניות וקוטביות. כשלב שני, מולקולות מופרדות עוד יותר על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ומנותחות על ידי ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה, המספקת זמן שמירה, יחס מסה למטען ונתוני עוצמה להמשך ניתוח.

ריצות הכרומטוגרפיה הנוזלית הבאות מיושרות ותכונות מזוהות, מכומתות וממוינות. על מנת לזהות תכונות בשפע דיפרנציאלי בין קבוצות. התוצאות מראות את ההבדלים בתכונות על פני תנאי טיפול בהתבסס על שפע דיפרנציאלי של אנליטים כפי שזוהה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה.

למרות שניתן להשתמש בשיטה זו לחקר חילוף החומרים התאי, היא יכולה גם לספק תובנה לגבי גילוי סמנים ביולוגיים או מטבוליזם ביוטי של זנו. לקווים דביקים, הוסף 1.5 מיליליטר מדיה לתאים בצלחת של 10 סנטימטרים. מניחים את הצלחת על קרח ומגרדים בעדינות כדי להרים את התאים.

העבר את 1.5 מיליליטר של מתלה תאים מורמים לצינור צנטריפוגה מזכוכית של 10 מיליליטר מסומן מראש. לאחר מכן, הוסף שישה מיליליטר של שניים עד אחד כלורופורם מתנול לכל אחד מצינורות הזכוכית של 10 מיליליטר המכילים את הדגימות. לנער את הדגימות במהירות נמוכה למשך 30 דקות לאחר הטלטול, צנטריפוגה את הדגימות עם הגדרת האטה בתאוצה נמוכה ב-1, 935 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להפריד לחלוטין את השלבים באמצעות פיפטת מרעה ארוכה.

העבירו את השכבה האורגנית לצינור צנטריפוגה חדש מזכוכית בנפח 10 מיליליטר. לאחר מכן, העבירו את השכבה המימית לצינור פלסטיק נקי של שני מיליליטר. בשלב זה, אידוי הדגימות האורגניות והמימיות תחת גז חנקן.

הרכיבו מחדש את הדגימות המיובשות ב-50 עד 100 מיקרוליטר של תמיסת ההתחלה לשיטת UPLC הרצויה. פיפטה בעדינות את הדגימה למעלה ולמטה כדי לסייע בהמסת האנליטים. לאחר מכן העבירו כל דגימה למסנן צינור ניילון של 0.22 מיקרון וסובבו עד 14, 000 פעמים G למשך כחמש דקות עד שהדגימה עברה לחלוטין דרך המסנן.

בדוק את הדגימה כדי לוודא שלא נותרו משקעים גלויים בדגימה. העבירו את ה-supernatant של הדגימה המסוננת לבקבוקון UPLC עם תווית מראש עם מכסה הכנס את הבקבוקון. לאחר מכן החלק אותו כדי להסיר בועות מתחתית בקבוקון הדגימה.

הנח את הדגימה בדגימת הרכב המצוננת. כעת צור ריצה לדגימה האורגנית באמצעות תוכנת הבקרה של הכרומטוגרף הנוזלי. לאחר מכן, צור ריצה עבור הדגימה האורגנית על סמך תנאי ה-UPLC המותאמים.

השתמש בתנאי ה-UPLC הממוטבים כדי ליצור שיטה גם עבור הפאזה המימית. אם קבוצה ידועה של אנליטי מטרה מעניינת מאוד, מטב את תנאי ה-UPLC באמצעות האנלוגי המסומן הכבד של תרכובות אלה וצור שיטה. באמצעות תנאים אלה, אפשר ל-UPLC לאזן כראוי.

זה צריך לכלול תחול מלא של ממיסים לפני חיבור עמודה ומעקב אחר הוראות היצרן לנפח שיווי המשקל של עמודה חדשה, נהל יומן של לחצים חוזרים כדי לסייע באבחון בעיות עתידיות באמצעות תוכנת הבקרה עבור ספקטרומטר המסה ברזולוציה גבוהה. צור שיטת מצב חיובי. לאחר מכן באמצעות אותם תנאים, צור שיטת מצב שלילי.

נקה וכייל את המכשיר. צור ריסוס יציב לתוך הספקטרומטר ואפשר זמן לתמיסת הכיול להתפזר כראוי מהמקור ומהאופטיקה. יציבות מקובלת של ריסוס צריכה לתת סטיית תקן יחסית של 3 עד 5% בעוצמה על פני לפחות 100 סריקות עם הזרקת תמיסת כיול באותו קצב זרימה כמו שיטת ה-lc בה נעשה שימוש.

באמצעות מחולל מספרים אקראיים ומפתח הגדר דגימות בצורה אקראית כדי למנוע השפעות אצווה שהוצגו על ידי הניתוח. הגדר את הרצף עבור כל הדגימות. הגדר את נפח ההזרקה המתאים והפעל ריק לפני הדגימה הראשונה.

אם יש חשד להשפעות העברה או מטריצה בין דגימות, הפעל ריקים או שטיפות נאותות, התחל ברצף ונטר מעת לעת בעיות כולל תנודות לחץ או אובדן עוצמת האות לאורך הריצה. אם מתגלות בעיות חמורות, הפסק את הריצה. נקה וכייל את המכשיר.

צור ריסוס יציב לתוך הספקטרומטר ואפשר זמן לתמיסת הכיול להתפזר כראוי מהמקור ומהאופטיקה. לפני שתתחיל בניתוח דיפרנציאלי, בדוק ידנית את סך זרמי היונים או הסתכל על כרומטוגרמות מסוננות עבור כל תרכובת ידועה בדגימה. כדי להבטיח שחזור של ריצות ויציבות ריסוס חיתוך UPLC של הזרקה בכל הדגימות, העבר את קבצי הנתונים של RAW מספקטרומטר המסה לכונן הקשיח של תחנת העבודה שבה מותקנת המסננת.

מסננת פתוחה. התחל ניסוי חדש וטען את הקבצים המתאימים למסננת. הקצה קבוצות השוואה ובחר קובץ הפניה יחיד כדי לאפשר ל-SIE V ליצור את הפרמטרים לניתוח.

עקוב אחר ההנחיות והתאם את כל הפרמטרים לפי הדרישות של כל ניסוי בודד. טען את רשימת התוספות הנכונה למצב חיובי או שלילי בפרמטרים. לאחר סיום הניתוח, בדוק שרשימת מסגרות אוכלסה על המסך.

ודא שיישור ה-lc מכסה את כל פסגות ציון הדרך. אם אחת מריצות ה-lc הלא מיושרות מציגות סטייה גדולה בפסגות ציון דרך. הדבר עשוי להצביע על בעיה במדגם.

התווה את הנתונים לפי מקדם השונות בתוך אוכלוסיית מדגם דומה. מיין את הרשימה על סמך תכונות רצויות. לאחר מכן, בחנו כל פסגה עבור יישור שיא מתאים בין קבוצות.

אינטגרציה שיא, גאוס, עוצמת אות צורת שיא, איזוטופים והקצאת אדווקטים. ייצא נתונים לפי הצורך לניתוח נוסף או ליצירת רשימות מסה ממוקדות לאישור ו-MS לניסויים הסופיים. מספר רב של פגיעות זוהו על ידי שתי התוכניות המשמשות לנקודות ירוקות דיפרנציאליות הן תכונות נפוצות יותר בביקורת, בעוד שנקודות אדומות נפוצות יותר בטיפול.

גודל נקודה גדול יותר מצביע על גודל מוגבר של שינוי קיפול בין הקבוצות ועוצמת הצבע מדגימה ירידה בערך P עם רוויה הולכת וגוברת של הצבע בתמונה. להלן הכרומטוגרמות המציגות את מצב היונים החיובי של הפאזה האורגנית חלון ניתוח UPLC MS A מציג את זרם היונים הכולל מ-S Civ 2.0. כרומטוגרמת היונים שחולצה עבור התכונה המזוהה כ-D paneth על ידי XCMS מוצגת בחלון B.חלון C מציג את כרומטוגרמת היונים שחולצה עבור התכונה המזוהה כריקבון הידוע מ-sve.

חלון D מציג את כרומטוגרמת היונים שחולצה עבור התכונה המזוהה כרקבון הידועה מנורמל לזרם היונים הכולל. תכונה בשפע דיפרנציאלי שהופחתה בקבוצה המטופלת הידועה זוהתה באופן זמני כ-d panadine על ידי חיפוש מדויק במסד נתונים המוני. זהות האנליט אושרה באמצעות ספקטרומטריית מסה טנדם U-P-L-C-H-R.

מוצגת כאן השוואה בין הכרומטוגרמות וספקטרום המסה של הדגימה והתרכובת הטהורה. אל תשכח שעבודה עם כלורופורם עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש להקפיד על אמצעי זהירות נאותים כגון מכסה אדים מאוורר היטב.