Name: הרבייה מכאנית מושרה גירוי סיד גל בmonolayers הסלולרי: דוגמה לתאי אנדותל קרני שור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: חקור תקשורת בין-תאית באמצעות גלי סידן מכאניים בתאי אנדותל קרני שור. השיטה משתמשת בצביעה פלואורסצנטית ומיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לכמת את התפשטות הגלים ולחקור תעלות מפרץ וחצי-תעלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודת מחקר שבוצעה במעבדה נתמכה על ידי מענקי קרן המחקר - פלנדריה (FWO; מספרי מענק G.0545.08 וG.0298.11), תכנית הפולנים המשיכה הבינאוניברסיטאי (מדיניות מדע בלגית; מענק מספר P6/28 וP7/13) ומוטבע בקהילת מחקר FWO נתמכת. CDH הוא פוסט דוקטורט של קרן המחקר - פלנדריה (FWO). המחברים מודים מאוד לכל חברי ההווה ובעבר של המעבדה של איתות מולקולרית ותאית (KU לובן), ד&quot;ר SP Srinivas (אוניברסיטת אינדיאנה הספר לאופטומטריה, ארה&quot;ב), המעבדה של ד&quot;ר Leybaert (אוניברסיטת גנט) ושל ד&quot;ר Vinken (Vub) שסיפק דיונים מועילים, מותאם נהלים או היו מעורב בפיתוח כלים לחקר hemichannels connexin.

1. בידוד של תאי אנדותל הקרניים לפני שיתחיל: לבודד את התאים מהעיניים טריות, המתקבלות מהמטבחיים מקומי, בהקדם האפשרי לאחר enucleating העין. ודא כי העין הייתה enucleated מפרה של בן 18 חודשים, חמש פוסט המורט והשתמרו בתמיסת מלח מאוזנת של ארל דקות מקסימליים - תמיסת יוד 1% ב 4 ° C להובלה למעבדה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח עין מתמיסת מלח מאוזנת של ארל - תמיסת יוד 1% ולמקם אותו בצלחת פטרי (100 מ&quot;מ X 20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את העין עם תמיסה המכילה 70% אתנול ולשטוף עם תמיסת מלח מאוזנת של ארל המכילה 1% יוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משלב זה ואילך, לעבוד במנדף סטרילי. בזהירות לנתח את הקרנית מהעין ולמקם אותו בצלחת פטרי (35 x 10 מ&quot;מ) המכילה תמיסת מלח מאוזנת של ארל, עם שכבת תאי האפיתל פונה כלפי מעלה. להסיר כל Sti רקמת איריס שנותר בזהירותיהיה מחובר לקרנית במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הקרנית לתמיסת מלח מאוזנת של ארל אחר המכילה צלחת פטרי עם שכבת תאי האנדותל כלפי מעלה ולשטוף פעמיים עם תמיסת מלח מאוזנת של ארל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הקרנית עם שכבת האנדותל פונה כלפי מעלה לשעון חול, שהוא מאכל בצורת כוס, ולכסות אותו עם מדיום גידול. מדיום הגידול מורכב מבינוני השתנה Dulbecco של הנשר המכיל גלוקוז 25 מ&quot;מ, 10% בסרום שור עוברי, 6.6% L-גלוטמין, 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin-B ו 1% תערובת האנטיביוטיקה antimycotic המכיל 10,000 יחידות / מ&quot;ל ​​של פניצילין, 10,000 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של סטרפטומיצין, ו -25 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום עם טפטפת יניקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל μl 300 של פתרון טריפסין (0.5 גר &#39;/ ל&#39;) לשכבת האנדותל של הקרנית (כל הצעדים הכוללים טריפסין נעשים באמצעות אותו הריכוז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את שעון חול המכיל את הקרנית בצלחת פטרי מכוסה ושם אותו בincubator למשך 30 דקות בשעה 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לגרד את תאי האנדותל מקרנית עם זכוכית פיפטה פסטר בצורת וו אש מלוטשת בשכונת סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצוץ את התמיסה המכילה את תאי האנדותל ולהוסיף אותו לתרבות צלוחיות (25 ס&quot;מ 2) המכילות 4 מ&quot;ל של מדיום התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל μl 300 של מדיום גידול לקרנית וחזור גירוד ולהוסיף תמיסה המכילה את תאי האנדותל לבקבוק התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב זה סופי (1.11) פעם נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תרבות צלוחיות המכילים את תאי האנדותל בקרנית במדיום הגידול בחממה ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר יומיים, להוסיף 6 מ&quot;ל של מדיום התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן מדיום גידול כל יום שני. </li></ol> 2. תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום התרבות לשטוף את התאים פעמיים עם הפתרון של ארל מאוזן מלח, כאשר confluency הוא הגיע (באבו10 ימים לאחר בידוד t). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון 1.5 מ&quot;ל טריפסין לתאים כדי לנתק אותם ומניחים את הבקבוק בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) במשך 3 עד 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 12 מ&quot;ל של מדיום גידול. פיפטה שלוש הפעמים בינוניות פנימה והחוצה כדי לפזר את התאים ולספור את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע עם חלק קטן משתנה בהתאם לצפיפות התא ולשים אותם בחממה. הכן שתי שקופיות היטב בליעה (בשטח של 4.2 ס&quot;מ 2) עם ספירת תאים של 165,000 תאים (תא לצפיפות 39,286 2 ס&quot;מ). הכן 80 ס&quot;מ 2 צלוחיות תרבות למעבר חדש בצפיפות של 6,250 ל2 ס&quot;מ, ולהוסיף מדיום התרבות טרי עד נפח כולל של 25 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן בינונית כל יומיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Confluency של שכבת התאים הוא הגיע לאחר 3 עד 4 ימים. להשתמש בתאים לניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר confluency של שכבת התאים בצלוחיות הוא הגיע, חזור על שלבי 2.1-2.6. ניתן להשתמש בתרביות תאים עד חלוף 2 Fאו ניסויים. </li></ol> 3. גירוי מכאני לגל סיד התרמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון את התאים בשקופית הקבורים עם 10 מיקרומטר Fluo-4 בבוקר בפוספט שנאגרו מלוח למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בזמן הטלטול בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר Fluo-04:00 פתרון, לשטוף את התאים חמש פעמים עם פוספט שנאגרו מלוח, דגירה התאים עם פוספט שנאגרו מלוח ולהשאיר את התאים לפחות 5 דקות בטמפרטורת חדר לפני המדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקסייט ב 488 ננומטר עם ארגון לייזר ושימוש קורה המפצל HFT 488, לאסוף את פליטת הקרינה ב530 ננומטר באמצעות longpass פליטת מסנן LP 505, קבע את חריר במינימום. השתמש אובייקטיבי 40X טבילת שמן (אוויר, 1.2 NA). בניסויים עם ARL-67156, השתמש אובייקטיבי 10X (אוויר, 0.3 NA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחפש תחום שבו התאים ומחוברות במיקרוסקופ confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמדת פיפטה כך שזה ב 45 מעלות ביחס לשקופית הבליעה ונוגע בקרום התא.לעורר גירוי מכאני קצר (≈ 1 שניות) לתא בודד. הגירוי מכאני מורכב מעיוות חריפה, קצר טווח של התא על ידי נגיעה פחות מ -1% של קרום התא בקצרה עם micropipette כוס (קוטר קצה &lt;1 מיקרומטר) מצמידים את nanopositioner גביש פיזואלקטריים, המופעל באמצעות מגבר שהוא רכוב על מיקרו מניפולטור. את micropipettes עשוי הזכוכית עם חולץ microelectrode. ודא כי nanopositioner מופעל על ידי מתח בין 0.2 ו 1.5 V במהלך הגירוי מכאני. מתח גבוה מ -1.5 וולט יכול לגרום לניזק לתאים. לכל סוג תא ולמצבו, המתח האופטימלי לגירוי מכאני ללא נזק לתאים צריך להיקבע בזהירות על ידי יישום שורה של מתחים החל מ נמוך (0.2 וולט) למתח גבוה (1.5 וולט). המתח הוא מדד לעוצמת הגירוי שכן מתח זה קובע את הלחץ מכאני ומתח שמוחלים על קרום התא.כוח של הגירוי מכאני יכול להיות מחושב על ידי הכפלת הלחץ מכאני עם האזור. מאז הן האזור (&lt;3.14 מיקרומטר 2) ולחץ מכאני הם נמוכים מאוד, כוח של הגירוי מכאני הוא נמוך. (שים לב שכאשר תא פגום, דליפות הקרינה אל מחוץ לתא והתא הופכים כהות.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד שינויים מרחביים ב[ Ca 2 +] אני בעקבות גירוי מכאני עם מיקרוסקופ confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ולאחסן את תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר אזור polygonal עניין להגדיר את שטח הפנים הכולל של תאים מגיבים (האזור פעיל, א.א.) באמצעות התוכנה של מיקרוסקופ confocal. </li></ol>

יש מחברים אין לחשוף.

בכתב יד זה, אנו מתארים שיטה פשוטה למדידת 2 + אינטר התפשטות גל CA בmonolayers של תאי האנדותל בקרנית שור ראשוניים על ידי מתן גירוי מכאני מקומית ומבוקר באמצעות micropipette. תאי מגורה מכאני מגיבים בעלייה מקומית בIP תאי 3 וCa 2 +, אשר שניהם הם מולקולות איתות תאיות חיוניות המניעות אינטר Ca 2 + גל התפשטות 11,67. ה-IP של 3 מועבר ישירות לתאי שכנים באמצעות ערוצי צומת פער 5, בעוד Ca 2 + מעורר פת...

תקשורת בין תאית ואיתות חיונית לתיאום של תהליכים פיסיולוגיים בתגובה לאגוניסטים תאיים ברמה 1,2 כל האיבר והרקמה. הדרך הישירה ביותר של תקשורת בין תאית נוצרה על ידי ההתרחשות של צמתים פער. צמתים פער הם לוחות של ערוצי צומת גאפ, שהם ערוצים חלבוניים שהוקמו על ידי העגינה הראש בראש של שתי connexin (CX) hemichannels של תאים סמוכים 3,4 (איור 1). צמתים פער לאפשר המעבר של מולקולות איתות קטנות עם משקל מולקולרי של פחות מ -1.5 kDa, כולל Ca 2 + או ה-IP של 3 5, מה שגרם וויסות Ca 2 + שחרור מהחנויות תאיות של התאים השכנים 6 (איור 2). ערוצי צומת פער מוסדרים היטב על ידי אינטראקציות חלבון ותוך מולקולאריים ועל ידי תהליכי איתות תאיים, כמו שינוי והחיזורזירחון 7. GJS להקל על התגובה מתואמת של תאים מחוברים, ובכך מתנהג כמו כימי וsyncytium חשמל. לדוגמה, הפצה של פוטנציאל פעולת לב על פני myocytes פרוזדורים וחדרים מתווכת על ידי ערוצי 85 GJ מבוסס CX. CXS יש לא רק תפקיד כערוצי צומת פער, אלא גם ליצור hemichannels מזווג, ובכך מתפקד כערוצים בקרום בדומה לערוצים רגילים יון 8-10 (איור 1). Hemichannels להשתתף באיתות בין תאים שכנים paracrine על ידי שליטה בחילופי יונים ומולקולות איתות בין סביבת התוך תאית ו. בסוגי תאים רבים (כמו תאי אפיתל, תאי osteoblastic, האסטרוציטים, תאי אנדותל, וכו &#39;) ואיברים (כמו מוח, כבד, רשתית, שבלול וכלי דם), אינטר Ca 2 + גלים הם יסוד לתיאום של תגובות תאיות <sup&gt; 11. עליות בCa 2 + רמות תאיות בתא מסוים אינן מוגבלות לתא זה, אבל להפיץ לתאים השכנים בסביבה, וכך לבסס Ca אינטר 2 + גל 12,13. Ca 2 + אלה אינטר גלים חשובים לויסות פיזיולוגית נורמלית של שכבות תאים כsyncytium וdysregulation נקשר עם תהליכי pathophysiological 11. באנדותל ואפיתל קרני, קבוצות שונות 14-24, כולל 25-33 משלנו, חקרו את המנגנונים ואת התפקידים של תקשורת בין תאית. בתאים שאינם נרגשים, כמו תאי אנדותל בקרנית, שני מצבים שונים של תקשורת בין תאית להתרחש 28,29, כלומר פער תקשורת בין תאית junctional ותקשורת בין תאית paracrine. תקשורת בין תאית junctional פער כרוכה בחילופים ישירים של מולקולות איתות דרך צמתים פער 7. פער juncתקשורת בין תאית tional היא קריטית לשמירה על הומאוסטזיס רקמות, השליטה התפשטות תאים, והקמה מסונכרנת תגובה ללחץ תאי 10,34,35. במספר פתולוגיות, צימוד צומת פער מצטמצם עקב פגום CXS, ומשפיע על פער תקשורת בין תאית 36 junctional בזאת. זה מדגיש את החשיבות והשפעה של תקשורת בין תאית junctional פער באורגניזמים תאיים. בניגוד לתקשורת בין תאית junctional פער, תקשורת בין תאית paracrine אינה תלויה בפרד תאי תאים, שכן היא כוללת את שחרורו של שליחים תאיים diffusible (איור 2). סוגים שונים של מולקולות איתות משתחררים בחלל החוץ התאי על ידי תאי איתות. המולקולה לאחר מכן הועברה לתא היעד שבו הוא זוהה על ידי חלבון קולטן ספציפי. כתוצאה מכך מורכבת קולט האותות גורם לתגובה תאית, אשרהוא הופסק על ידי הסרת האות, איון או הפחתת רגישות. שליחים תאיים lipophilic פורסם איתות לחדור את הקרום ולפעול על קולטני תאיות. בניגוד לכך, שליחים הידרופילי לא לחצות את קרום הפלזמה של התא להגיב, אבל לפעול כיגנד שנקשר לחלבוני פני שטח, הביעו הקולטן, אשר לאחר מכן להעביר את האות לסביבה תאית. שלוש משפחות עיקריות של חלבונים פני תא קולטן להשתתף בתהליך הזה: קשור יון ערוצים, אנזים צמוד וצמוד לחלבון G. מולקולת השליח שוחרר יכולה לפעול על הקולטנים של אותו התא (autocrine), על תאי המטרה בסמיכות (paracrine), או על תאי היעד רחוקים שדורשים מערכת הדם (האנדוקרינית). בסוגי תאים רבים, כולל קרנית האנדותל 28,29, ה-ATP הוא אחד הגורמים העיקריים paracrine הידרופילי, המניעים את ההתפשטות של אינטר Ca 2 + גלים 37-40. משךעיוות מכאנית ing, היפוקסיה, דלקת או גירוי על ידי סוכנים שונים, ניתן לשחרר ATP מהתאים בריאים 41-44 בתגובה למאמץ גזירה, מתיחה, או נפיחות האוסמוטי 44,45. מנגנוני ה-ATP-הפצה אחרות כבר הניחו, כולל exocytosis לפוחי 44 ושפע של מנגנוני הובלה, כגון ה-ATP מחייבים קלטות (ABC) מובילים, ערוצי אניון מתח התלויים plasmalemmal 46, P2X7 ערוצי קולט 47,48, כמו גם connexin hemichannels 49-52 וpannexin hemichannels 43,49,53. ATP תאי יכול להיות במהירות הידרוליזה לADP, AMP ואדנוזין 54,55 ידי ectonucleotidases שנמצאים בסביבה תאית. ה-ATP שפורסם extracellularly וADP המטבוליט שלה 56 תהיה להפיץ באמצעות דיפוזיה. האינטראקציה הבאה של נוקלאוטידים אלה עם קולטני purinergic בתאים השכנים הייתה מעורבת בעמ &#39;ropagation של אינטר Ca 2 + גלים 28,37,51. שני סוגים של קולטנים שונים purinergic נוכחים: אדנוזין הוא ליגנד הטבעי העיקרי לP1-purinoceptors, בעוד הן פורין (ATP, ADP) ופירימידין (UTP, UDP) נוקלאוטידים ביותר לפעול על P2-purinoceptors 57. תקשורת בין תאית יכולה להיחקר על ידי שיטות שונות כגון טעינה לגרד, העברת צבע, משחררות רפרוף מקומית של אגוניסטים כמו IP 3 וCa 2 +, גירוי מכאני, וכו &#39;. כאן אנו מתארים את המחקר של Ca 2 + התפשטות גל שהושרו על ידי גירוי מכאני של תא בודד. היתרון של לימוד 2 + התפשטות גל CA על ידי גירוי מכאני הוא שהיא מספקת כלי קל לכמת את התפשטות Ca 2 + גל לאורך זמן, והיא מאפשרת השוואת כמותית pretreatments של התאים שונים. באנדותל בקרנית, אלה Ca 2 + אינטר גלים לאפשר שיתוףתגובה מתואמת מmonolayer, מתנהגת בזאת כמנגנון הגנה אפשרי של האנדותל של הקרנית שאינם משובי עוזרים האנדותל לעמוד לחצים תאיים במהלך ניתוח תוך עיני, או בחשיפה למתווכים דלקתיים במהלך דחייה של מערכת חיסון או אובאיטיס 58,59.

<table><tbody><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של ארל (EBSS)</td><td>בדיקות Invitrogen-Gibco-Molecular (קרלסרוהה, גרמניה)</td><td>14155-048</td><td></td></tr><tr><td>יוד</td><td>סיגמא-אולדריץ' (Deisenhofen, גרמניה)</td><td>38060-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>בדיקות Invitrogen-Gibco-Molecular (קרלסרוהה, גרמניה)</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין (Glutamax)</td><td>בדיקות Invitrogen-Gibco-Molecular (קרלסרוהה, גרמניה)</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin-B</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, גרמניה)</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>תערובת אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית</td><td>בדיקות Invitrogen-Gibco-Molecular (קרלסרוהה, גרמניה)</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr>בדיקות<td>Trypsin</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular (קרלסרוהה, גרמניה)</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccoבדיקות PBS</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular (קרלסרוהה, גרמניה)</td><td>14190-091</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>בדיקות Invitrogen-Gibco-Molecular (קרלסרוהה, גרמניה)</td><td>F14217</td><td></td></tr><tr><td>ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) </td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, גרמניה)</td><td>A265</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase VI</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, גרמניה)</td><td>A6410</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase VII</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, גרמניה)</td> <td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td> <td>סינתזת</td><td></td><td></td>פפטידים מותאמת אישית</tr><tr><td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td> <td>סינתזת</td><td></td><td></td>פפטידים מותאמת אישית</tr><tr><td>פפטיד בקרת פפטיד (SRGGEKNVFIV)</td> <td>סינתזת</td><td></td><td></td>פפטידים מותאמת אישית</tr><tr><td>siRNA1 Cx43 (חוש: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td><td>siRNA מחוסל נרכש ב Eurogentec (Luik, בלגיה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA2 Cx43 (חוש: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td><td>siRNA מחוסל נרכש ב-Eurogentec (Luik, בלגיה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA ערבול: רצף מקושקש של siCx43-1 (חוש: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) </td><td>siRNA מחוסל נרכש ב-Eurogentec (Luik, בלגיה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAT-L2 (TAT-DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td><td>Thermo Electron (Ulm, גרמניה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK</td><td>) תרמו אלקטרון (אולם, גרמניה)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שתי שקופיות זכוכית תאיות</td><td>Laboratory-Tek Nunc (רוסקילדה, דנמרק)</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי </td><td>Carl Zeiss Meditec (Jena, גרמניה)</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>Piez&#8211; ננו-פוזיונר קריסטל לקטרי (Piezo Flexure NanoPositioner)</td><td>PI Polytech (קרלסרוהה, גרמניה)</td><td>מגבר P-280</td><td></td></tr><tr><td>HVPZT</td><td>PI Polytech (קרלסרוהה, גרמניה)</td><td>E463 מגבר</td><td></td>HVPZT</tr><tr><td>צינורות זכוכית (החלפת זכוכית 3.5 ננו-ליטר)</td><td>World Precision Instruments, Inc. סרסוטה, פלורידה, ארה"ב</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>Micr&#8211; Lectrode </td><td>puller Zeitz Instrumente (מינכן, גרמניה)</td><td>WZ DMZ-חולץ</td><td></td> אוניברסלי</tr></tbody></table>

הרבייה מכאנית מושרה גירוי סיד גל בmonolayers הסלולרי: דוגמה לתאי אנדותל קרני שור

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

תקשורת בין תאית היא חיונית לתיאום של תהליכים פיסיולוגיים בין תאים במגוון רחב של איברים ורקמות, ובכלל זה המוח, הכבד, הרשתית, השבלול וכלי הדם. בהגדרות ניסוי, אינטר Ca 2 + גלים יכול להיות שהושרו על ידי יישום גירוי מכאני לתא בודד. זה מוביל לשחרור של מולקולות האיתות תאיות IP 3 ו Ca 2 + שיזמו את ההתפשטות של Ca 2 + גל מעגלי מתא מגורה מכאני לתאים השכנים. את המסלולים המולקולריים המרכזיים השולטים 2 התפשטות אינטר + גל Ca מסופקים על ידי ערוצי צומת פער עד להעברה הישירה של 3-IP ועל ידי hemichannels דרך שחרורו של ה-ATP. זיהוי והאפיון של המאפיינים והרגולציה של connexin שונה וisoforms pannexin כערוצי צומת גאפ וhemichannels מותר על ידי quantification של התפשטות Ca אינטר 2 + גל, siRNA, ושימוש במעכבים של ערוצי צומת גאפ וhemichannels. כאן, אנו מתארים שיטה למדידה אינטר Ca 2 + גל בmonolayers של תאי האנדותל בקרנית עיקריים עמוסים Fluo4-AM בתגובה לגירוי מכאני מבוקר ומקומי עורר על ידי עיוות חריפה, קצר טווח של התא כתוצאה נגיעה של קרום התא עם micropipette זכוכית micromanipulator שליטה בקוטר קצה מיקרומטר פחות מ 1. אנו גם מתארים את הבידוד של תאים ראשוניים שור קרנית האנדותל והשימוש בו כמערכת מודל להערכת פעילות Cx43-hemichannel ככוח מונע לאינטר Ca 2 + גלים דרך שחרורו של ה-ATP. לבסוף, אנו דנים בשימוש, יתרונות, מגבלות וחלופות של שיטה זו בהקשר של ערוץ צומת פער ומחקר hemichannel.

כל הניסויים מבוצעים בעמידה בכל ההנחיות הרלוונטיות, תקנות וגופים הרגולטוריים ואת הפרוטוקול שמפגינים מבוצע תחת הדרכתו ואישורו של הטיפול בבעלי החיים ועדת שימוש בלובן KU. בתאי אנדותל בקרנית שור (BCEC), צמתים פער תפקודיים באים לידי ביטוי וגם תקשורת בין תאית junctional פער ותקשורת בין תאית paracrine לתרום באופן משמעותי לתקשורת בין תאית באופן אינטראקטיבית, אבל המסלול העיקרי הוכח להיות מסלול תקשורת בין תאית paracrine מתו...

Ca אינטר<sup&gt; 2 +</sup&gt; גלים מונעים על ידי ערוצי צומת גאפ וhemichannels. כאן, אנו מתארים שיטה למדידת Ca אינטר<sup&gt; 2 +</sup&gt; גלים בmonolayers הסלולרי בתגובה לגירוי מכאני מתא בודד מקומי והיישום שלה כדי לחקור את המאפיינים והרגולציה של ערוצי צומת גאפ וhemichannels.

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לחקור תקשורת בין-תאית באמצעות תעלות gap junction ותעלות HEMI, על ידי כימות התפשטות גל הסידן הבין-תאי שמעורר על ידי גרייה מכנית בשכבות מונו-שכבה (monolayers) של תאי אנדותליאל קרנאליים ראשוניים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי בידוד תאי אנדותליאל קרנאליים ראשוניים מעיני בקר טריות. כשלב שני, יומיים עד שלושה ימים לאחר הזריעה בلامיסות עם תאים (chambered slides), טוענת המונו-שכבה של התאים עם הצבע הפלואורסצנטי הרגיש לסידן flu O 4:00 AM. לאחר מכן, אנו מפעילים גירוי מכני מבוקר וממוקד על תא בודד במונו-שכבה כדי לעורר גל סידן בין-תאי, אשר ויזואליזציה שלו מתבצעת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.התוצאות מראות את התפשטות גל הסידן הבין-תאי. בסופו של דבר, נעשה שימוש בעכבה של תעלות צומת פער (gap junction) ותעלות HEMI כדי לפענח את התכונות והבקרה של איזופורמים שונים של Conex ו-panex המרכיבים תעלות צומת פער ותעלות HEMI. היתרון העיקרי של התפשטות גלי סידן בין-תאיים המושרים על ידי גרייה מכנית הוא שהיא מספקת שיטה פשוטה ואמינה לבחינת התרומה והתכונות של תעלות מקשרות ותעלות axing באופן לא פולשני.יתר על כן, השיטה נשענת על מולקולות איתות פיזיולוגיות ומסלולי העברה (cascades) הנמצאים במערכות התאיות הנחקרות. לבסוף, היא ניתנת להתאמה בקלות למגוון מערכות תאים, כולל תאים ראשוניים ומודלים תאיים המבטאים באופן אקטופי איסופורמים מסוימים של connexin או PanIN. שיטות אלו יכולות לספק תובנות לגבי התפקוד והבנייה הדינמית של תעלות צומת פערים (gap junction channels) ותעלות HEMI המבוססות על connexin ו-PanIN, באמצעות השתקת (knockdown) איסופורמים אנדוגניים של connexin או panics באמצעות siRNA, ובאמצעות שימוש במעכבים סלקטיביים של תעלות צומת פערים ותעלות HEMI.מערכת זו אינה מוגבלת בהחלט לתאי אנדותל של הקרנית בלבד. היא ניתנת להתאמה כמעט לכל סוג של תא וכן לרקמות מורכבות יותר. פרוצדורה זו משתמשת בעין עם גרעין טרי מפרה שאינה עולה על גיל 18 חודשים, וזאת עד חמש דקות לאחר המוות.זה הועבר למעבדה בתמיסת מלח מאוזנת של Earl (EBSS) ובתמיסת יוד 1% בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. ראשית, העבירו את העין לצלחת פטרי של 100 מילימטר על 20 מילימטר. לאחר מכן, שטפו את העין ב-EBSS המכיל 1%iodine.מעתה ואילך, עקרו זאת באמצעות תמיסה המכילה 70% ethanol. עבדו תחת מ𒌟 סטרילית. דלקקו בזהירות את הקרנית מהעין והניחו אותה בצלחת פטרי של 35 מילימטר על 10 מילימטר המכילה EBSS, כאשר שכבת התאים האפיתליאליים פונה כלפי מעלה.הסר בזהירות כל שארית של רקמת קשתית שעדיין מחוברת לקרנית. במידת הצורך, העבר את הקרנית לצלוחית אחרת עם EBSS כאשר שכבת התאי האנדותליים פונה כלפי מעלה, ולאחר מכן שטוף פעמיים עם EBSS. לאחר מכן, הנח את הקרנית כאשר השכבה האנדותליאלית פונה כלפי מעלה לתוך כלי בצורת שעון חול וכסה במצע גידול.לשטיפה, הסירו את המצע באמצעות פיפטת ואקום. מרחו 300 µL של תמיסת tripsin בריכוז 0.5 g/L על השכבה האנדותליאלית של הקרנית. הניחו את השעון החולית המכיל את הקרנית בתוך צלחת פטרי מכוסה והעבירו לאינקובטור למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2.לאחר הוצאת שעון החול, גרדו בעדינות את התאי האנדותל מהקרנית באמצעות פיפטת זכוכית בעלת קצה מעוקל שעברה ליטוש באש. שאבו את התמיסה המכילה את תאי האנדותל והוסיפו אותה לבקבוק תרבית מרובע של 25 סנטימטר המכיל ארבעה מיליליטר של מצע גידול. לאחר מכן, גרשו 300 µL של מצע גידול אל הקרנית.חזור על פעולת הגרידה והוסף את התמיסה המכילה את התאי האנדותלליים לבקבוק התרבית. חזור על שלב זה פעם נוספת, ולאחר מכן הנח את בקבוקי התרבית המכילים את תאי האנדותל של הקרנית בתוך מדיום גידול באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide. לאחר יומיים, הוסף 6 mL של מדיום תרבית ורענן את מדיום הגידול מדי יומיים.התאים צריכים להגיע למצב של התכנסות (confluence) בתוך שבעה עד 10 ימים מהבידוד ועד למעבר (passage). ראשית, שאבו את מצע הגידול ולאחר מכן שטפו פעמיים עם EBSS. לאחר מכן, הוסיפו לתאים שני מיליליטר trips in solution והניחו את הבקבוק באינקובטור למשך שלוש עד ארבע דקות.לאחר מכן, הוסיפו 12 milliliters של מצע גידול ובצעו פיפטינג של המצע שלוש פעמים פנימה והחוצה כדי לפזר את התאים. לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר או סופר תאים אוטומטי. הוסיפו 165,000 תאים לשתי שקופיות תרבית בעלות בארות.בשלב הבא, הכינו בקבוקי תרבית ריבועיים של 75 סנטימטר רבוע למעבר חדש בצפיפות של 6,250 תאים לסנטימטר רבוע, הוסיפו מצע תרבית טרי עד לנפח כולל של 25 milliliters והכניסו את הבקבוקים ואת שקופיות התא (chamber slides) לאינקובטור. יש להחליף את המצע מדי יומיים, והשכבה התאית אמורה להגיע למצב של confluence תוך שלושה עד ארבעה ימים. ראשית, טענו את התאים בשקופית התא עם 10 micromolar fluo-4 AM ב-phosphate buffered saline למשך 30 דקות ב-37 degrees Celsius תוך써 ניעור עדין. בזמן שהתאים מדגגים ב-fluo-4 AM, חברו מיקרו-פיפטת זכוכית עם קוטר קצה של פחות מ-1 micrometer ל-piso electro crystals nano positioner, וחברו אותה למגבר המותקן על מיקרו-מניפולטור.כוון את המתח של הננו-מיקמיטור (nano positioner) לטווח שבין 0.2 ל-1.5 וולט. הסר את תמיסת ה-4:00 AM. לאחר מכן, שטוף את התאים חמש פעמים עם phosphate buffered saline, והדגש את התאים ב-PBS למשך חמש דקות לפחות בטמפרטורת החדר לפני המדידה.עוררו באורך גל של 488 nanometers באמצעות לייזר ארגון והשתמשו במפליט קרן HFT 48. אספו את הפליטה הפלורסצנטית באורך גל של 530 nanometers באמצעות מסנן פליטה למעבר ארוך, LP 5 0 5, כאשר ה-pinhole מכוון למינימום; במקרה זה נעשה שימוש בעדשה שמנתית (oil immersion) של 40 x. הניחו את תג הchamber על בסיס המיקרוסקופ הקונפוקאלי ואתרו אזור של תאים בהסנכרון (confluence).בשלב הבא, הזז את המיקרו-מניפולטור כדי למקם את המיקרו-פיפט מזכוכית כך שייגע בממברנת התא בזווית של 45 מעלות. הפעל את המיקרו-מניפולטור כדי לגעת קצרות בפחות מ-1% מממברנת התא הבודד באמצעות המיקרו-פיפט מזכוכית, ובכך עורר גירוי מכני למשך שנייה אחת בתא. לאחר מכן, מדוד שינויים מרחביים בריכוז יוני סידן בעקבות הגירוי המכני באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, ואסוף ושמור את התמונות.לבסוף, שרטטו אזור עניין פוליגוני כדי להגדיר את שטח הפנים הכולל של התאים המגיבים באמצעות התוכנה של מיקרוסקופ הקונפוקל. תנודות סידן המושרות על ידי גירוי מכני מוצגות בנקודות זמן שונות בתנאי ביקורת בתאי אנדותל של קרנית בקר באמצעות תמונות פלואורסצנציה ממסכות בצבעי פסאודו; עשמתי הפלואורסצנציה לפני הגירוי מוצגות בתמונה הראשונה. החץ הלבן בתמונה השנייה מסמן את התא שעבר גירוי מכני.גל הסידן מתפשט לשש שכבות תאים שכנות, כאשר השטח הכולל של התאים שהגיע אליהם הגל נותן שטח פעיל של 62, 870 micrometers squared. הגרף הקווי מציג את מהלך הזמן של ערך הפלואורסצנציה הנורמליזציה או NF בתא שעבר גרייה מכנית המסומן כ-ms, ואת ערך ה-NF הממוצע בשכבות התאים השכנות אחת עד חמש המסומנות בגרף כ-MB אחת עד MB חמש. תמונות אלו מראות שינויים משמעותיים בהתפשטות של גלי סידן בין-תאיים לאחר טיפול בנוקלאוטידים אקסוגניים בגרף שמשמאל ולאחר טיפול במעכבי ecto nucleotide aase בגרף שמימין; בפירוט רב יותר, הגרף שמשמאל מראה ירידה משמעותית בשטח הפעיל לאחר טיפול של תאי אנדותל של קרנית בקר עם ה-Aras Aase six ו-Aase seven האקסוגניים, אשר הידרוליזו ATP ו-ADP ובכך עיכבו את נתיב התקשורת הבין-תאית הפריקרינית.הכוכבית מסמנת ערך P של פחות מ-0.001 בנוכחות לעומת היעדר של ace. הגרף מימין מראה עלייה משמעותית בשטח הפעיל לאחר טיפול ב-BCEC באמצעות מעכב אקטו-נוקלאוטיד סלקטיבי, A RL 6 7 1 56, ובכך הגברת נתיב התקשורת הבין-תאית הפריקרינית. הכוכבית מסמנת ערך P של פחות מ-0.001 בנוכחות לעומת היעדר של a RL לאחר שליטה מלאה בטכניקה.ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש עד 10 דקות עבור ניסוי אחד בתנאי אחד, כאשר היא מבוצעת כראוי. ביצוע סדרה שלמה של ניסויים המאפשרים להשוות בין תנאים שונים אורך יום אחד עד להסקת מסקנות סטטיסטיות. יש להשתמש בניסויים עצמאיים שבוצעו בימים שונים וממנות שונות של תאים מבודדים.מדידה וכימות של התפשטות גלי סידן תוך-תאיים מאפשרים את הזיהוי והאפיון של הוויסות הביולוגי-תאי של איזופורמים שונים של קשרים, כגון תעלות gap junction ותעלות HEMI. כמו כן, ברצוני להדגיש ששיטה זו אינה עומדת בפני עצמה, אלא צריכה להשלים גישות מולקולריות ופונקציונליות אחרות, החל מהעברה של דיאט ועד לשחרור TP ואלקטרופיזיולוגיה.

mechanical-stimulation-induced-calcium-wave-propagation-cell

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר את הטכניקה המשמשת לביצוע מיפוי אופטי דו-ערוצי בחד-שכבות חד-שכבתיות של תאי פרוזדורים HL-1. פרוטוקול ייחודי זה מאפשר הדמיה בו-זמנית של פעילות סידן (Ca) ומתח (Vm) באותו אזור לזיהוי וניתוח מפורט של תכונות אלקטרופיזיולוגיות של תרבית חד-שכבתית.

מתח וסידן ערוץ כפול אופטי מיפוי של תרבית HL-1 פרוזדורים Myocyte חד שכבתי

באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC), תצפית vivo לשעבר של המכות של cilia ependymal ניע ממוקם בתוך החדרים במוח העכבר באה לידי ביטוי בחי הדמיה. הטכניקה מאפשרת הקלטה של ​​תדר מכות הריסים הייחודי וזווית מכות וכן נכסי צעדה תנודת סידן תוך תאי שלהם.

הדמיה חיה של צילה Ependymal בחדרים לרוחב של מוח העכבר

ערוצי mechanosensitive חיידקים יכולים לשמש כמתמר mechanoelectrical במכשירי biomolecular. bilayers אגל הממשק (דיבס), אבני בניין בהשראת תא למכשירים כאלה, מייצג פלטפורמות חדשות לשלב ולעורר ערוצי mechanosensitive. הנה, אנחנו מדגימים שיטה מבוססת micropipette חדש של יוצרי דיבס, המאפשר הלימוד של ערוצי mechanosensitive תחת גירוי מכאני.

רב תכליתיים, Micropipette מבוסס שיטה להתאגדות וגירוי של ערוצים בקטריאלי Mechanosensitive יון בbilayers ממשק אגל

תרבות עיקרית של תאי אנדותל קרניים שור שמשה לחקור את המנגנון של מעבר אנדותל-mesenchymal הקרני. יתר על כן, מודל cryoinjury האנדותל עכברוש הקרני שמש להפגין מעבר אנדותל-mesenchymal קרני in vivo.

במבחנה מודלים Vivo ללמוד קרנית האנדותל-mesenchymal מעבר

המודגמות כאן הם פרוטוקולים לבידוד (1) טרי שלם מוחי אנדותל "צינורות" ומדידות (2) בו זמנית הסידן אנדותל של קרומית אפשרית במהלך אנדותל, נגזר hyperpolarization. עוד, שיטות אלה מאפשרים כוונון תרופתי של תאי אנדותל סידן, איתות חשמלי כמשתנים ניסיוני בודדים או אינטראקטיביות.

מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתק את תאי הקרניות של הקרנית (CEC) מהקרום של האישה (DM) באמצעות "YAG" (בלייזר) של ממברנה הvivo לשעבר של המחלה של keratopathy בולולס (BK).

פיתוח של מודל פולשני, בסיוע לייזר של הקרנית הפסד של תא אנדותל

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הקריטיים הנדרשים כדי ליצור ולגדל תרביות תאים של הקרנית מפני הצמח של רקמת האדם או הכבשים. שיטה לתאי הקרנית משנית של תאים אנדותל על קרומי ביוארילים מוצג גם.

צמיחת הקרנית של האדם והכבשים שכבות של תאי-על ביומטריה

פרוטוקול זה מתאר את השימוש nanowires סיליקון עבור ביו-אפנון אופטי תאי של תא בשיטה פשוטה וקלה לביצוע. הטכניקה ניתנת להתאמה גבוהה לסוגי תאים מגוונים ותוכל לשמש במבחנה, כמו גם ביישומים vivo.

ננו-חוטי סיליקון וגירוי אופטי לחקירות של צימוד חשמלי פנים-תאי

תותבות רשתית יש את היכולת ליצור תפיסות חזותיות. כדי לקדם את הפיתוח של תותבות חדשות, יש צורך בשיטות ex vivo כדי לבדוק מכשירים לפני ההשתלה. מאמר זה מספק פרוטוקול מקיף לחקר פעילות הסידן בשכבת תאי גנגליון הרשתית כאשר הוא נתון לגירוי חשמלי.

הדמיית סידן ברשתית שטוחה עם גירוי חשמלי

מאמר זה מציג שיטה לניטור כמותי בזמן אמת של ריכוזי יוני סידן (Ca2+) בתאים באמצעות הדמיה חד-תאית Ca2+ עם צבע Fura-2/AM. טכניקה זו מאפשרת העמסת צבע יעילה וחישוב מדויק של רמות Ca2+ באמצעות יחסי עוצמת פלואורסצנטיות, מה שהופך אותה לגישה פשוטה ומהירה ליישומי מחקר.

דימות סידן חד-תאי לחקר הפעלת תעלות יוני סידן

השימוש באור לשליטה בתאי הלב והרקמות מאפשר גירוי ללא מגע, ובכך שומר על המצב והתפקוד הטבעיים של התאים, מה שהופך אותו לגישה בעלת ערך הן למחקר בסיסי והן ליישומים טיפוליים.

מערכת מיקרופיזיולוגית לבבית לחקר התפשטות Ca2+ באמצעות גירוי אופטי לא גנטי

חקור תקשורת בין-תאית באמצעות גלי סידן מכאניים בתאי אנדותל קרני שור. השיטה משתמשת בצביעה פלואורסצנטית ומיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לכמת את התפשטות הגלים ולחקור תעלות מפרץ וחצי-תעלות.

הרבייה מכאנית מושרה גירוי סיד גל בmonolayers הסלולרי: דוגמה לתאי אנדותל קרני שור

גלה סרטונים נוספים