הרבייה מכאנית מושרה גירוי סיד גל בmonolayers הסלולרי: דוגמה לתאי אנדותל קרני שור

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לחקור תקשורת בין-תאית באמצעות תעלות gap junction ותעלות HEMI, על ידי כימות התפשטות גל הסידן הבין-תאי שמעורר על ידי גרייה מכנית בשכבות מונו-שכבה (monolayers) של תאי אנדותליאל קרנאליים ראשוניים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי בידוד תאי אנדותליאל קרנאליים ראשוניים מעיני בקר טריות. כשלב שני, יומיים עד שלושה ימים לאחר הזריעה בلامיסות עם תאים (chambered slides), טוענת המונו-שכבה של התאים עם הצבע הפלואורסצנטי הרגיש לסידן flu O 4:00 AM. לאחר מכן, אנו מפעילים גירוי מכני מבוקר וממוקד על תא בודד במונו-שכבה כדי לעורר גל סידן בין-תאי, אשר ויזואליזציה שלו מתבצעת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

התוצאות מראות את התפשטות גל הסידן הבין-תאי. בסופו של דבר, נעשה שימוש בעכבה של תעלות צומת פער (gap junction) ותעלות HEMI כדי לפענח את התכונות והבקרה של איזופורמים שונים של Conex ו-panex המרכיבים תעלות צומת פער ותעלות HEMI. היתרון העיקרי של התפשטות גלי סידן בין-תאיים המושרים על ידי גרייה מכנית הוא שהיא מספקת שיטה פשוטה ואמינה לבחינת התרומה והתכונות של תעלות מקשרות ותעלות axing באופן לא פולשני.

יתר על כן, השיטה נשענת על מולקולות איתות פיזיולוגיות ומסלולי העברה (cascades) הנמצאים במערכות התאיות הנחקרות. לבסוף, היא ניתנת להתאמה בקלות למגוון מערכות תאים, כולל תאים ראשוניים ומודלים תאיים המבטאים באופן אקטופי איסופורמים מסוימים של connexin או PanIN. שיטות אלו יכולות לספק תובנות לגבי התפקוד והבנייה הדינמית של תעלות צומת פערים (gap junction channels) ותעלות HEMI המבוססות על connexin ו-PanIN, באמצעות השתקת (knockdown) איסופורמים אנדוגניים של connexin או panics באמצעות siRNA, ובאמצעות שימוש במעכבים סלקטיביים של תעלות צומת פערים ותעלות HEMI.

מערכת זו אינה מוגבלת בהחלט לתאי אנדותל של הקרנית בלבד. היא ניתנת להתאמה כמעט לכל סוג של תא וכן לרקמות מורכבות יותר. פרוצדורה זו משתמשת בעין עם גרעין טרי מפרה שאינה עולה על גיל 18 חודשים, וזאת עד חמש דקות לאחר המוות.

זה הועבר למעבדה בתמיסת מלח מאוזנת של Earl (EBSS) ובתמיסת יוד 1% בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. ראשית, העבירו את העין לצלחת פטרי של 100 מילימטר על 20 מילימטר. לאחר מכן, שטפו את העין ב-EBSS המכיל 1%iodine.

מעתה ואילך, עקרו זאת באמצעות תמיסה המכילה 70% ethanol. עבדו תחת מ𒌟 סטרילית. דלקקו בזהירות את הקרנית מהעין והניחו אותה בצלחת פטרי של 35 מילימטר על 10 מילימטר המכילה EBSS, כאשר שכבת התאים האפיתליאליים פונה כלפי מעלה.

הסר בזהירות כל שארית של רקמת קשתית שעדיין מחוברת לקרנית. במידת הצורך, העבר את הקרנית לצלוחית אחרת עם EBSS כאשר שכבת התאי האנדותליים פונה כלפי מעלה, ולאחר מכן שטוף פעמיים עם EBSS. לאחר מכן, הנח את הקרנית כאשר השכבה האנדותליאלית פונה כלפי מעלה לתוך כלי בצורת שעון חול וכסה במצע גידול.

לשטיפה, הסירו את המצע באמצעות פיפטת ואקום. מרחו 300 µL של תמיסת tripsin בריכוז 0.5 g/L על השכבה האנדותליאלית של הקרנית. הניחו את השעון החולית המכיל את הקרנית בתוך צלחת פטרי מכוסה והעבירו לאינקובטור למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2.

לאחר הוצאת שעון החול, גרדו בעדינות את התאי האנדותל מהקרנית באמצעות פיפטת זכוכית בעלת קצה מעוקל שעברה ליטוש באש. שאבו את התמיסה המכילה את תאי האנדותל והוסיפו אותה לבקבוק תרבית מרובע של 25 סנטימטר המכיל ארבעה מיליליטר של מצע גידול. לאחר מכן, גרשו 300 µL של מצע גידול אל הקרנית.

חזור על פעולת הגרידה והוסף את התמיסה המכילה את התאי האנדותלליים לבקבוק התרבית. חזור על שלב זה פעם נוספת, ולאחר מכן הנח את בקבוקי התרבית המכילים את תאי האנדותל של הקרנית בתוך מדיום גידול באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide. לאחר יומיים, הוסף 6 mL של מדיום תרבית ורענן את מדיום הגידול מדי יומיים.

התאים צריכים להגיע למצב של התכנסות (confluence) בתוך שבעה עד 10 ימים מהבידוד ועד למעבר (passage). ראשית, שאבו את מצע הגידול ולאחר מכן שטפו פעמיים עם EBSS. לאחר מכן, הוסיפו לתאים שני מיליליטר trips in solution והניחו את הבקבוק באינקובטור למשך שלוש עד ארבע דקות.

לאחר מכן, הוסיפו 12 milliliters של מצע גידול ובצעו פיפטינג של המצע שלוש פעמים פנימה והחוצה כדי לפזר את התאים. לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר או סופר תאים אוטומטי. הוסיפו 165,000 תאים לשתי שקופיות תרבית בעלות בארות.

בשלב הבא, הכינו בקבוקי תרבית ריבועיים של 75 סנטימטר רבוע למעבר חדש בצפיפות של 6,250 תאים לסנטימטר רבוע, הוסיפו מצע תרבית טרי עד לנפח כולל של 25 milliliters והכניסו את הבקבוקים ואת שקופיות התא (chamber slides) לאינקובטור. יש להחליף את המצע מדי יומיים, והשכבה התאית אמורה להגיע למצב של confluence תוך שלושה עד ארבעה ימים. ראשית, טענו את התאים בשקופית התא עם 10 micromolar fluo-4 AM ב-phosphate buffered saline למשך 30 דקות ב-37 degrees Celsius תוך써 ניעור עדין. בזמן שהתאים מדגגים ב-fluo-4 AM, חברו מיקרו-פיפטת זכוכית עם קוטר קצה של פחות מ-1 micrometer ל-piso electro crystals nano positioner, וחברו אותה למגבר המותקן על מיקרו-מניפולטור.

כוון את המתח של הננו-מיקמיטור (nano positioner) לטווח שבין 0.2 ל-1.5 וולט. הסר את תמיסת ה-4:00 AM. לאחר מכן, שטוף את התאים חמש פעמים עם phosphate buffered saline, והדגש את התאים ב-PBS למשך חמש דקות לפחות בטמפרטורת החדר לפני המדידה.

עוררו באורך גל של 488 nanometers באמצעות לייזר ארגון והשתמשו במפליט קרן HFT 48. אספו את הפליטה הפלורסצנטית באורך גל של 530 nanometers באמצעות מסנן פליטה למעבר ארוך, LP 5 0 5, כאשר ה-pinhole מכוון למינימום; במקרה זה נעשה שימוש בעדשה שמנתית (oil immersion) של 40 x. הניחו את תג הchamber על בסיס המיקרוסקופ הקונפוקאלי ואתרו אזור של תאים בהסנכרון (confluence).

בשלב הבא, הזז את המיקרו-מניפולטור כדי למקם את המיקרו-פיפט מזכוכית כך שייגע בממברנת התא בזווית של 45 מעלות. הפעל את המיקרו-מניפולטור כדי לגעת קצרות בפחות מ-1% מממברנת התא הבודד באמצעות המיקרו-פיפט מזכוכית, ובכך עורר גירוי מכני למשך שנייה אחת בתא. לאחר מכן, מדוד שינויים מרחביים בריכוז יוני סידן בעקבות הגירוי המכני באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, ואסוף ושמור את התמונות.

לבסוף, שרטטו אזור עניין פוליגוני כדי להגדיר את שטח הפנים הכולל של התאים המגיבים באמצעות התוכנה של מיקרוסקופ הקונפוקל. תנודות סידן המושרות על ידי גירוי מכני מוצגות בנקודות זמן שונות בתנאי ביקורת בתאי אנדותל של קרנית בקר באמצעות תמונות פלואורסצנציה ממסכות בצבעי פסאודו; עשמתי הפלואורסצנציה לפני הגירוי מוצגות בתמונה הראשונה. החץ הלבן בתמונה השנייה מסמן את התא שעבר גירוי מכני.

גל הסידן מתפשט לשש שכבות תאים שכנות, כאשר השטח הכולל של התאים שהגיע אליהם הגל נותן שטח פעיל של 62, 870 micrometers squared. הגרף הקווי מציג את מהלך הזמן של ערך הפלואורסצנציה הנורמליזציה או NF בתא שעבר גרייה מכנית המסומן כ-ms, ואת ערך ה-NF הממוצע בשכבות התאים השכנות אחת עד חמש המסומנות בגרף כ-MB אחת עד MB חמש. תמונות אלו מראות שינויים משמעותיים בהתפשטות של גלי סידן בין-תאיים לאחר טיפול בנוקלאוטידים אקסוגניים בגרף שמשמאל ולאחר טיפול במעכבי ecto nucleotide aase בגרף שמימין; בפירוט רב יותר, הגרף שמשמאל מראה ירידה משמעותית בשטח הפעיל לאחר טיפול של תאי אנדותל של קרנית בקר עם ה-Aras Aase six ו-Aase seven האקסוגניים, אשר הידרוליזו ATP ו-ADP ובכך עיכבו את נתיב התקשורת הבין-תאית הפריקרינית.

הכוכבית מסמנת ערך P של פחות מ-0.001 בנוכחות לעומת היעדר של ace. הגרף מימין מראה עלייה משמעותית בשטח הפעיל לאחר טיפול ב-BCEC באמצעות מעכב אקטו-נוקלאוטיד סלקטיבי, A RL 6 7 1 56, ובכך הגברת נתיב התקשורת הבין-תאית הפריקרינית. הכוכבית מסמנת ערך P של פחות מ-0.001 בנוכחות לעומת היעדר של a RL לאחר שליטה מלאה בטכניקה.

ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש עד 10 דקות עבור ניסוי אחד בתנאי אחד, כאשר היא מבוצעת כראוי. ביצוע סדרה שלמה של ניסויים המאפשרים להשוות בין תנאים שונים אורך יום אחד עד להסקת מסקנות סטטיסטיות. יש להשתמש בניסויים עצמאיים שבוצעו בימים שונים וממנות שונות של תאים מבודדים.

מדידה וכימות של התפשטות גלי סידן תוך-תאיים מאפשרים את הזיהוי והאפיון של הוויסות הביולוגי-תאי של איזופורמים שונים של קשרים, כגון תעלות gap junction ותעלות HEMI. כמו כן, ברצוני להדגיש ששיטה זו אינה עומדת בפני עצמה, אלא צריכה להשלים גישות מולקולריות ופונקציונליות אחרות, החל מהעברה של דיאט ועד לשחרור TP ואלקטרופיזיולוגיה.