רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי

אנו מציגים פרוטוקול פשוט להשיג סרטי הקרינה מיקרוסקופיה של תאי שמרים גדלו, וחבילת תוכנה מבוססת GUI כדי לחלץ את נתוני זמן סדרת תא בודד. הניתוח כולל שושלת אוטומטית והקצאת זמן החלוקה משולבת עם בדיקה חזותית ואוצרות ידני של נתונים מסומנים.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג סרטי פלואורסצנטיות של תאי שמרים בודדים הגדלים ולחלץ סדרות זמן של ביטוי מדווח עבור כל תא. זה מושג על ידי תרבית חד-שכבתית של תאים בתא מיקרופלואידי. השלב השני הוא ביצוע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בזמן-lapse עבור מדווח אחד או יותר.

לאחר מכן, הסרטים מעובדים באמצעות חבילת תוכנת השתל כדי לעקוב ולמדוד תאים לאורך זמן. השלב האחרון הוא לנתח את מדידות התאים והקצאות השושלת ולייצא סדרות זמן של ביטוי מדווח עבור כל תא שלם. בסופו של דבר, קצב שעתוק מיידי המוסק מסדרות זמן ביטוי משמש להצגת שינויים בשעתוק הן לאורך מחזור התא והן בתגובה לשינויים ברמות גורם השעתוק.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ויסות הגנים, כגון באיזו מהירות מגיבים מקדמים שונים להוספה פתאומית או חיסור כלשהו של גורם שעתוק פעיל. עד כמה משתנה התגובה הזו על פני אוכלוסיית תאים וכיצד מאפיינים תאיים שונים כולל מורפולוגיה ושלב מחזור התא משפיעים על התגובה? יתר על כן, שיטה זו יכולה לחקור את ההשפעות של תוספות וחיסורים מרובים של גורם שעתוק פעיל על ביטוי גנים.

הכן תאי שמרים הגדלים במצב יציב ועשיר בחומרים מזינים בצפיפות המתאימה להעמסה למכשיר המיקרופלואידי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן הכינו צלחת תרבית מיקרופלואידית Y אפס ארבע C מהתא ASIC על ידי שטיפת הבארות במים סטריליים לאחר הסרת תמיסת המשלוח באמצעות מערכת הזלוף אוניקס הזרימו מים דרך בארות אחת עד שש בשש PSI למשך חמש דקות כדי לשטוף את התעלות, ואז זרמו מבאר הטעינה שמונה בשש PSI למשך 10 שניות. הסר מים מכל הבארות והחלף ב-250 מיקרוליטר של מדיה SC בבארות כניסה, אחד עד שישה ו-50 מיקרוליטר מתרבית התאים המוכנה בהעמסת תאים.

באר שמונה אוטמים את סעפת האוניקס לצלחת ומתחילים להכין את התעלות ואת תא התרבות על ידי זרימה מבארות כניסה אחת עד שש בשש PSI למשך שתי דקות. עקוב אחר זה בזרימה רק מבאר הכניסה המחזיקה את אמצעי ההתחלה למשך חמש דקות לפחות. בשישה PSI זורמים זאת ברציפות עד ששלב המיקרוסקופ מדביק את הצלחת לתושבת הבמה כדי למנוע את תזוזתה לאורך כל הניסוי על מנת לשפר את מעקב התאים במהלך ניתוח הנתונים, לאחר הכנת המיקרוסקופ כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הניחו כמה טיפות של נוזל טבילה על המטרה והרכיבו את המכשיר המיקרופלואידי בצורה מאובטחת.

בשלב המיקרוסקופ ההפוך, התמקדו בשליש השמאלי ביותר של תא התרבות הראשון באמצעות אחד מסמני המיקום המוטבעים. כבה את הזרימה מבאר כניסת המדיה וזרם מטעינת תאים שמונה בשישה PSI בפרצי חמש שניות. הזיזו את הבמה כדי להסתכל סביב תא התרבית לאיתור תאים.

הגדל את זמן זרימת הטעינה והלחץ עד להשגת צפיפות התאים הרצויה, אך הימנע מעומס יתר וסתימת המחסום השמאלי ביותר שבו מדיה טרייה נכנסת לתא. התחל לזרום מבאר כניסת המדיה המכילה את אמצעי ההתחלה בשישה PSI. במטמורף או בתוכנת אוטומציה ובקרה אחרת של מיקרוסקופיה.

הגדר רכישה רב-ממדית כדי לצלם תמונות מרובות במיקומי במה מרובים לאורך זמן. הגדר את מספר נקודות הזמן ואת המרווח ביניהן. לאחר מכן בחר מספר מיקומי שלב עם כ-10 תאים. כל.

הגדר את הרכישה כך שבכל מיקום שלב ובכל נקודת זמן, התוכנית תתמקד בתמונת שדה האור המועבר באמצעות שיטת פוקוס אוטומטי מובנית של מטמורפות, תוך יישום המיקוד האוטומטי כיומן כתוב מותאם אישית בתחילת כל שלב. המיקום מספק שליטה רבה יותר על דיוק המיקוד. כמו כן, הגדר את התוכנית לרכוש את תמונת השדה הבהיר בתוספת מיקרון אחד למישור המוקד ולרכוש תמונת שדה בהיר מחוץ למיקוד במינוס ארבעה מיקרון למישור המוקד.

השתמש ביומנים כתובים מותאמים אישית כדי לשנות את המיקוד כנדרש בין תמונות. לבסוף, הגדר את התוכנית. רכוש תמונה אחת בקנה מידה אפור עבור כל מדווח פלואורסצנטי במישור המוקד.

שימוש בהגדרות ממוטבות לרכישה מהירה עם הלבנת תמונות מינימלית. הכן את תוכנית הזרימה לניסוי בתוכנת בקרת האוניקס. לאחר מכן התחל במקביל את תוכנית הרכישה ב-Metamorph ואת תוכנית הזרימה בתוכנת הבקרה Onyx.

הפעל את קובץ נתוני הפורמט M ב-MATLAB כדי לפתוח את ממשק המשתמש הגרפי של קלט הנתונים או ממשק המשתמש הגרפי. בחלק העליון, ציין או דפדף לתיקיה המכילה את קבצי התמונה כדי להגדיר את ספריית הנתונים ולאחר מכן השתמש בדביק כדי לציין את סוגי הנתונים וקבצי התמונה שהוקלטו בניסוי. המשך לבחירת פרמטרי הפילוח כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

בחירת הפרמטרים המתאימים לפילוח תמונות שדה בהיר יכולה להיות קשה ויש לה השפעה משמעותית על איכות הנתונים של סדרות הזמן המתקבלות. אנו מתמקדים בזיהוי כל אזורי התא עם עדיפות לפילוח יתר ולא לאזורי סגמנטציה. במהלך בדיקת נתונים חזותיים, ניתן למזג אזורים מפולחים, ליצירת אזורי תאים שלמים, אך לא ניתן לפצל אזורים מפולחים מאוחר יותר.

הגדר את פרמטרי הפילוח השונים ובדוק את איכות הפילוח על ידי לחיצה על בדוק בהצלחה. אזורים מפולחים יהיו ירוקים עם גבולות מג'נטה. הקפד להשתמש במחוון כדי לבדוק נקודות זמן מרובות בסרט כאשר הפילוח משביע רצון.

בחר בוצע כדי להחזיר את פרמטרי הפילוח לממשק המשתמש הגרפי של נתוני הפורמט. לאחר בחירת פרמטרי הצבע כמתואר בטקסט, לחץ על לחצן הסף האוטומטי כדי לקבוע אוטומטית את הסף. בשיטה של tzu, התמונה תדגיש את האזורים שהשתמרו מעל הסף.

ניתן לכוונן את הסף באופן ידני באמצעות תיבת העריכה. השתמש בפס הגלילה כדי לאשר שהסף מתאים לכל נקודות הזמן. כשאתה מרוצה, לחץ על הביצוע.

כדי להחזיר את הסף לממשק המשתמש הגרפי של נתוני הפורמט, לחץ על הוסף ופלח. ליצירת מסיכת הצבע, הקישו על נתוני תבנית כדי לקרוא את קובצי התמונה, לעבד את הנתונים וליצור קובץ dot mat בתיקייה שצוינה. קובץ זה ישמש כקלט לממשק המשתמש של סדרת זמן התהליך.

הפעל את קובץ M של סדרת זמן התהליך ב-MATLAB כדי לפתוח את ממשק המשתמש המעקב. לאחר פתיחת הממשק הגרפי הגדר תחילה את גובה החדר. זה מציין את גובה החדר בו לכודים התאים.

הוא משמש כאילוץ בקירוב נפח התא כאליפסואיד תלת מימדי המבוסס על הציר הראשי והמינורי של אזור התא. לאחר מכן הגדר מיקרומטרים לפיקסל. זהו גורם ההמרה המשמש לכיול מרחק פיקסל למיקרומטר בתמונות כך שניתן יהיה לכייל את שטח החתך והנפח במיקרומטר רבוע ומיקרומטר מעוקב בהתאמה.

לאחר מכן, השתמש בחלונית המסננים כדי להגדיר את הפרמטרים המינימליים והמקסימליים לסינון אזורי זבל במסיכה. האזור הוא אזור האזור בפיקסלים. ECC הוא גורם האקסצנטריות, שהוא מעגלי יותר ככל שהערך מתקרב לאפס.

ו-SF הוא גורם הצורה, שהוא מעגלי יותר ככל שהערך מתקרב בלחיצה אחת, טען תמונות בלוח פלט קלט הקובץ ובחר את קובץ הנתונים של מחצלת הנקודה של פלט מעניין על ידי ממשק הנתונים של הפורמט. מסיכת האזור תוחל על כל ערוץ צבע ויבוצעו מספר מדידות שונות. לאחר מכן, קובץ הנתונים נשמר לאחר בחירת הפרמטר מעקב אחר תאים כמתואר בטקסט.

לחץ על תאי מעקב כדי לעקוב אחר אזורים ממסגרת אחת לאחרת באמצעות מזהי האזור כדי להקצות שושלות לניצנים חדשים שהופיעו וכדי לשמור את הנתונים, שנה את הפרמטרים בחלונות הקופצים לפי הצורך. שושלות מוקצות אוטומטית על ידי מזעור המרחקים בין ניצנים משוערים לאמהות פוטנציאליות. בכל פריים.

לחץ על הכפתור מעל לוח המידע של התא שנבחר ואצור אזורים מפולחים בצורה גרועה וטעויות בהקצאות מזהה או שושלת באמצעות הכלים הדביקים השונים או מקשי הקיצור המתוארים בפרוטוקול הטקסט כדי לאצור כראוי את הנתונים. מזג את כל האזורים המפולחים, מחק את כל האזורים שאינם לוכדים את כל התא וודא שיחסי ניצני האם מוקצים כהלכה. כמו כן, הסר את כל המזהים הירוקים על ידי מיזוג אזורים.

תיקון תעודת זהות, הקצאת האזור לאם, הקצאת אם או מחיקת האזור. מכיוון שנתוני הניצנים יתווספו לאלה של האם במהלך הניתוח הסופי והסופי. אין למזג אזור ניצן לאמו.

בדוק חזותית נתונים עבור כל פריים עד למועד האחרון של העניין. זה לא נדרש מכל סדרת הזמן. אם אינך משתמש במסגרות המאוחרות יותר, הקפד לשמור שינויים לאחר שכל אזורי התא נבדקו לאורך טווח הזמן של נתוני העניין עבור כל ערוצי הקרינה וכיצד הם משתנים לאורך זמן מוכנים לפלט.

דחוף ניתוח סדרות זמנים כדי לנתח את סדרות הזמנים עבור תאים שלמים לאורך זמן. חשב מידע על מחזור התא וקח נגזרות. ייפתח חלון המאפשר בחירת מדידות העניין והקלט של פרמטרי הניתוח הזן את נקודת הזמן האחרונה שנאספה בדביק.

פרמטרי ברירת המחדל של החלקה והקצאת מחזור תא עובדים היטב עבור זני האפלו ודיפלואידים המצולמים במרווחים של חמש דקות, אך ייתכן שיהיה צורך לגוון אותם לקבלת התוצאות הטובות ביותר. כאשר כל הפרמטרים מוגדרים, בחר לנתח כדי לייצא נתוני סדרות זמן של תא בודד כמתואר בפרוטוקול הטקסט, ניסוי שבוצע ונותח בהצלחה יניב בעיקר סדרות זמן רציפות עבור תאים שלמים בודדים עם זמני הופעה וחלוקה שהוקצו באופן מציאותי אך הופעה וחלוקה עבור זן שמרי הילה המבטא עותק משולב של חלבון פלואורסצנטי של איאן או CFP המונע על ידי המרכיב של מקדם DH אחד. מדידות תאים שלמים לאורך זמן התקבלו מניתוח סדרות הזמן.

תמונות השדה הבהיר מראות את תא האם המפולח בכחול ואת הניצנים שלו בירוק. כאשר התא השלם הרציף מתואר באדום, נוצרת תלות במחזור התא הן לנפח והן לביטוי. כאן, אזורים מגוררים מראים מתי התא נמצא ב-SG 2 M ויש לו ניצן שמתחיל במעבר G אחד ל-S מלבן לאפור.

הצללה וחלוקת תאים מתרחשים במעבר M ל-G אחד מהצללה אפורה ללבנה לאחר היווצרות ניצנים. הנפח המשולב הכולל גדל מהר יותר מבעבר, אך מופיע בעוד שריכוז החלבון או העוצמה הממוצעת יורדים מעט. העלייה בחלבון משולב משולב מואצת גם לאחר ניצנים בהשוואה לאזור האם בלבד.

תוצאות אלו מדגימות את החשיבות של שילוב נכון של תרומות הניצנים למדידת התא כולו ומדגישות את הצורך בהיווצרות ניצנים נכונה והקצאות זמן חלוקה. ניתן להשתמש בסדרות הזמן המובחנות כדי לחשב רמת mRNA יחסית מיידית וקצב שעתוק, ששניהם גדלים גם לאחר ניצני היכולת לייצר זמן יציב. נגזרות של סדרות זמן מדידה מועילות גם למחקרים קינטיים המשתמשים במערכת הביטוי הניתנת להחלפה המתוארת בפרוטוקול הטקסט.

ניתוח סדרות זמן מראה מתי גורם השעתוק ממוקם לגרעין ומתי גן המטרה מתחיל ומפסיק. התמלול המוצג כאן הם מיקרוגרפים מארבעת ערוצי הרכישה המצוינים עבור תא עם מפעיל טרנס PHO ארבעה Tet R מותך YFP הניתן להחלפה. מפעיל הטרנס מתמקם בגרעין המסומן RFP בתגובה לפוספט נמוך ומניע ביטוי של מדווח CFP של מקדם X Tet O.

קצב השעתוק המוסק משתנה עם לוקליזציה בממוצע וברמת התא הבודד. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ניתוחים אחרים של נתוני סדרות הזמן הרב-ממדיות של תא בודד על מנת לענות על שאלות נוספות, כולל כיצד הביטוי משתנה בין האוכלוסייה לאורך זמן? האם ההשפעות של תנודות חיצוניות עוברות בתורשה על פני מספר דורות?

האם קינטיקה של הפעלת גנים משתנה עם הפעלה מחדש? האם מחזור התא משחק תפקיד ושאלות רבות אחרות הדורשות ביטוי גנים, גדילה ומסלולי שושלת של תאים בודדים.