Name: רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 1 s
Description: למדו לרכוש סרטי זמן-הקרנה של שמרים ולנתח דינמיקה של תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ומעקב אוטומטי אחרי שושלות תאים. שיטה זו מאפשרת חקר שינויים בשיעורי שעתוק לאורך מחזור התא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאמילי ג&#39;קסון, יהושע זיידמן, וניקולס רן להערות על התוכנה. עבודה זו מומנה על ידי GM95733 (לNM), 103,316 BBBE וקרנות הזנק (MIT לNM).

<ol><li>Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).</li>
<li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Regulation+at+the+Single-Cell+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene Regulation at the Single-Cell Level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling-mediated+bacterial+persister+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling-mediated bacterial persister formation.</a> Nature Chemical Biology. 8 (5), 431-433 (2012).</li>
<li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Observation+of+Transcription+Initiation+and+Elongation+on+an+Endogenous+Yeast+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li>
<li>Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+kinetics+of+gene+activity+in+individual+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria.</a> Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).</li>
<li>Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Genes+Are+Transcribed+with+Widely+Different+Bursting+Kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics.</a> Science. 332 (6028), 472-474 (2011).</li>
<li>Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-dependent+variations+in+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-dependent variations in protein concentration.</a> Nucleic Acids Research. 38 (8), 2676-2681 (2010).</li>
<li>Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+dependence+of+transcription+dominates+noise+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression.</a> , Submitted (2013).</li>
<li>Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+stochastic+switching+revealed+by+single-cell+genealogy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy.</a> PLoS Biology. 5 (9), e239(2007).</li>
<li>Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dynamics+of+single-cell+gene+expression+over+multiple+cell+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles.</a> Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024(2005).</li>
<li>Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK-mediated+bimodal+gene+expression+and+adaptive+gradient+sensing+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast.</a> Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).</li>
<li>Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+temporally+controlled+gene+expression+and+long-term+fluorescent+imaging+in+unperturbed+dividing+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells.</a> PloS One. 3 (1), e1468(2008).</li>
<li>Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+quantification+of+molecules+and+rates+using+open-source+microscope-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry.</a> Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Sys.+Man.+Cyber%22%5BJournal%5D)">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).</li>
<li>Goranov, A. I., Cook, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+cell+growth+is+governed+by+cell+cycle+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The rate of cell growth is governed by cell cycle stage.</a> Genes & Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).</li>
<li>To, T. -L., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+Can+Induce+Bimodality+in+Positive+Transcriptional+Feedback+Loops+Without+Bistability%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability.</a> Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).</li>
<li>O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+PHO4+nuclear+localization+by+the+PHO80-PHO85+cyclin-CDK+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex.</a> Science. 271 (5246), 209-212 (1996).</li>
<li>Raser, J. M., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+stochasticity+in+eukaryotic+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of stochasticity in eukaryotic gene expression.</a> Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הפרוטוקול לעיל מתאר שיטה פשוטה לקבל ולנתח את נתוני סדרת זמן הקרינה עם ניסיון מוגבל במיקרופלואידיקה או בפיתוח תוכנה. זה מאפשר לאדם להשיג סרטי הקרינה זמן לשגות של תאי שמרים בודדים; לחלץ גודל תא רלוונטי ומדידות ביטוי; מעקב כומר ומטלות שושלת, ולנתח את ההתנהגות של תאים שלמים לאורך זמן באמצעות מכשיר microfluidic תרבות זמין מסחרי ומשתמש גרפי תכליתי ממשק (GUI). בעוד ניסיוני, פילוח, ומעקב אחר צעדים כבר פנו בדרכים שונות בעבר 11,13,14, ההליך הנ&quot;ל נועד להפוך את הטכניקות הללו ל...

ניתוח תא בודד של ביטוי גנים שקדם את ההבנה של היבטים רבים של ויסות הגנים שלנו. תמונות סטטיות של ביטוי ניאון כתב באמצעות cytometry זרימה או מיקרוסקופיה לספק מידע שימושי על חלוקת ביטוי תא בודד, אבל חסרה את ההיסטוריה והאבולוציה של נתוני סדרת זמן הנדרשים כדי להודיע ​​ישירות דינמיקת ביטוי גנים. מיקרוסקופיה זמן לשגות הקרינה מציגה אמצעים כדי להשיג את שני מדידות תא בודדות ואת ההיסטוריה שלהם. ניסיוני בטכניקות ואנליטיות שונות פותחו כדי להשיג ולכמת סרטים של ביטוי ניאון כתב, ובכך הקניית תובנות תכונות ויסות הגנים (ראה 1 לביקורת), כגון תא אל תא וריאציה 2,3, היווצרות חיידקי persister 4, שעתוק ייזום והתארכות 5, תעתיק מתפוצץ 6,7, תלות מחזור תא 8,9, ותורשתיות 10. עם זאת, obtסדרת זמן הקרינה aining איכות תא בודד כרוכה באתגרים טכניים משמעותיים בculturing monolayer של תאים בסביבה לשליטה וכימות בתפוקה גבוהה של הקרינה בסרטים שנרכשו. כאן, אנו מתארים הליך להשיג ולנתח את סרטי הקרינה של ס &#39; cerevisiae ללא ניסיון הנדרש בייצור מכשיר תרבית תאים או בפיתוח תוכנה (איור 1). ראשית, אנו פירוט פרוטוקול דוגמה ליצירת סרטי סדרת זמן הקרינה לשמרי ניצנים הביעו אחד או יותר כתבי ניאון. למרות שכבר נבנו תאי microfluidic תרבות מותאמים אישית והועסקו בעבר בהצלחה 11-13, אנו משתמשים במכשיר microfluidic זמין מסחרי מCellAsic (הייוורד, קליפורניה). מערכת תאי הגבולות לצמיחה monolayer ומאפשר שליטה מתמדת של סביבת זלוף. פרוטוקול מיקרוסקופיה אנו מציגים הוא אמצעי פשוט להשיג fluorescסרטי ence של שמרי ניצנים, אלא כל פרוטוקול ניסויי שונה (מכשיר תרבות מותאם אישית תנאי מדיה חלופיים, וכו &#39;). מניבים נתונים סרט הקרינה דומים של תאי שמרים בודדים עשויים להיות תחליף. בשלב הבא, אנו מתארים את הניתוח של הסרטים באמצעות ממשק משתמש גרפי (GUI) מבוססת חבילת תוכנה בMATLAB (MathWorks, Natick, MA), המכונה GUI עבור ניתוח מהיר של סדרות עתיות הקרינה (שתלים), כדי לחלץ נתונים זמן סדרה לתאים בודדים. יש שתלי תכונות דומות לתוכנת 14 צדדי, הקוד פתוח חבילה נייד-ID בפילוח ומעקב אחר תאים וחילוץ בעוצמת הקרינה ומידע גיאומטרי. עם זאת, שתלים מספק תכונות חשובות נוספות. ראשית, היא מציעה עריכה אינטראקטיבית קלה של פילוח ותוצאות מעקב כדי לוודא דיוק הנתונים, ולא רק gating הסטטיסטי של עקבות אזור outlier לאחר ניתוח. יתר על כן, הוא מרחיב את הניתוח לautomaticallשושלת המיועדת y ונקודות מחזור תא עניין של שמרי ניצנים. קביעה כאשר האם והבת מתחלקות ליצירת שני אזורים סלולריים עצמאיים היא חיונית לקביעת תא כולו (אם לרבות כל ניצן מחובר) מדידות לאורך כל מחזור 8 התאים. החבילה מורכבת משלושה מודולים כדי לבצע משימות אלה. האזורים הסלולריים הקטעים הראשונים המבוססים על הניגוד בין תמונות שדה בהירות ממוקדות ולא ממוקדות, ומאפשר למשתמש להגדיר ולבחון את פרמטרים חזותי פילוח. המסילה השנייה (. באמצעות בלייר והיישום של Dufresne MATLAB של אל שגרת קרוקר et IDL, זמינה בכתובת: <a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/" target="_blank">http://physics.georgetown.edu/MATLAB/)</a> ומודדת אזורים סלולריים דרך זמן; מקצה אוטומטית שושלות, ומאפשרת בדיקה ויזואלית ותיקון שגיאות. GUI זומם פשוט כלול לנכסי תא בודד השאילתה. המודול השלישי מייחס ניצן הופעה והחלוקה TIMES, ומוציא כפלט את כל נתוני תא סדרת הזמן, כמו גם נגזרים בפעם הראשונה והשנייה שלהם (כפי שנדון ב9). מודול ניתוח פלטי את הנתונים כקובץ טקסט מופרדי רווחים למחקר שלאחר מכן בתוכנה הסטטיסטית של בחירה. לפיכך, החבילה מאפשרת למשתמש לחלץ נתוני סדרת זמן באיכות גבוהות באמצעות ממשק גרפי. יש לנו להשתמש בשיטה זו כדי להעריך שיעורי שעתוק בזמן אמת בתאי שמרי ניצנים בודדים כפונקציה של מחזור התא 9. בעוד שמודולים שעברו אופטימיזציה עבור שמרי ניצנים, הפרמטרים או, במידת צורך, הקוד זמין באופן חופשי יכול להיות מותאם לאורגניזמים אחרים וסוגי תמונות. פילוח, מעקב, ושושלת אלגוריתמי הקצאה עשויים להיות ספציפיים לסוגי הדמיה הוקצתה ואורגניזם בשאלה. את האלגוריתמים הקיימים יכולים להיות מוחלפים, אבל עדיין שומרים על ממשק GUI המאפשר מעקב שגיאות שתמיד occu בדיקה ותיקון של פילוח חזותי ידידותית למשתמש וR עם כל אלגוריתם.

<table><tbody><tr><td>Y04C צלחת זלוף שמרים</td><td>CellAsic</td><td>Y04C-02</td><td></td></tr><tr><td>ONIX פלטפורמת זלוף מיקרופלואידית</td><td>CellAsic</td><td>EV-262</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63x/1.40 שמן DIC אובייקט</td><td>Zeiss</td><td>440762-9904-000</td><td></td></tr><tr><td>אשד II EMCCD מצלמה</td><td>פוטומטרית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מנורת קשת מתכת-הליד לומן 200</td><td>PRIOR מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קוביית מסנן דיכרואית משולשת וסט מסנני עירור ופליטה</td> סט <td>Chroma Technology Corp</td><td>#89006</td><td>משמש עבור YFP (Venus / Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry / tdTomato)</td></tr> <tr><td>בקר MAC 5000 וגלגלי מסנן</td><td>Ludl Electronic Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2011a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>גירסת 64 סיביות מטפלת בקבצי נתונים גדולים בצורה טובה יותר מגירסת 32 סיביות</td></tr></tbody></table>

רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח dynamics תא בודד באמצעות שתלי

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

מיקרוסקופיה זמן לשגות הקרינה הפכה לכלי רב עוצמה בחקר תהליכים ביולוגיים רבים ברמת התא בודד. בפרט, סרטים המתארים את התלות הזמנית של ביטוי גנים לספק תובנות לגבי הדינמיקה של הרגולציה שלה, עם זאת, ישנם אתגרים טכניים רבים לקבלת וניתוח של סרטי הקרינה של תאים בודדים. אנו מתארים כאן פרוטוקול פשוט באמצעות מכשיר microfluidic תרבות זמין מסחרי כדי להפיק נתונים כאלה, וממשק מבוסס MATLAB, משתמש גרפי (GUI) מבוססת חבילת תוכנה לכמת את תמונות הקרינה. מגזרי התוכנה ותאי מסלולים, מאפשרים למשתמש לאצור חזותי טעויות בנתונים, ומקצים באופן אוטומטי שושלת וזמני החלוקה. GUI נוסף מנתח את סדרת הזמן לייצר כל עקבות סלולריים, כמו גם נגזרות בפעם הראשונה והשנייה שלהם. בעוד התוכנה תוכננה עבור ס cerevisiae, מודולריות והרבגוניות שלו צריכה לאפשר לו לאo לשמש כפלטפורמה ללימוד סוגי תאים אחרים עם כמה שינויים.

ניסוי בוצע בהצלחה וניתח יניבו סדרת זמן מתמשכת בעיקר לתאים שלמים יחידים עם הופעת ניצן שהוקצה מציאותי ופעמי חטיבה. כדוגמה, ביצענו פרוטוקול לעיל עם זן שמרי הפלואידים להביע עותק משולב של חלבון פלואורסצנטי Cerulean (CFP) מונע על ידי האמרגן המכונן ADH1 כדי לבחון כיצד צמיחה וביטוי העולמי עשויות להשתנות לאורך זמן בתאים בודדים (לוח 4, Y47 ). רצנו ניתוח סדרת הזמן לקבל תא כולו (איור 7 א) מדידות לאורך זמן, ותלות במחזור התא עולה לנפח וגם ביטו...

אנו מציגים פרוטוקול פשוט להשיג סרטי הקרינה מיקרוסקופיה של תאי שמרים גדלו, וחבילת תוכנה מבוססת GUI כדי לחלץ את נתוני זמן סדרת תא בודד. הניתוח כולל שושלת אוטומטית והקצאת זמן החלוקה משולבת עם בדיקה חזותית ואוצרות ידני של נתונים מסומנים.

רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להשיג סרטי פלואורסצנציה של תאי שמרים בודדים הגדלים, ולהוציא סדרות זמן של ביטוי חלבון רפורטר עבור כל תא. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול שכבה אחת (monolayer) של תאים בתא מיקרופלואידי. השלב השני הוא ביצוע מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בשיטת time-lapse עבור רפורטר אחד או יותר.בשלב הבא, הסרטונים מעובדים באמצעות חבילת התוכנה graft כדי לעקוב אחר תאים ולמדוד אותם לאורך זמן. השלב הסופי הוא ניתוח מדידות התאים והקצאות השושלות, וייצוא של סדרות זמן של ביטוי רפורטר עבור כל תא שלם. בסופו של דבר, קצב תעתוק רגעי המופק מסדרות הזמן של הביטוי משמש להצגת שינויים בתעתוק הן לאורך מחזור התא והן בתגובה לרמות משתנות של גורמי תעתוק.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הבקרה הגנטית, כגון במהירות תגובתם של מקדמים (promoters) שונים להוספה פתאומית או להסרה של גורם שעתוק פעיל. עד כמה תגובה זו משתנה באוכלוסיית תאים, וכיצד מאפיינים תאיים שונים, כולל מורפולוגיה ושלב במחזור התא, משפיעים על התגובה? יתרה מכך, שיטה זו יכולה לבחון את ההשפעות של מספר הוספות והסרות של גורם שעתוק פעיל על ביטוי גנים.הכינו תאי שמרים הגדלים במצב יציב (steady state) עשיר בחומרים מזינים, בצפיפות המתאימה לטעינה אל תוך ההתקן המיקרופלואידי כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, הכינו פלטת תרבית מיקרופלואידית Y04C של cell ASIC על ידי שטיפת הבארות במים סטריליים לאחר הסרת תמיסת השילוח; באמצעות מערכת perfusion onyx, הזרימו מים דרך בארות 1 עד 6 בלחץ של 6 PSI למשך חמש דקות כדי לשטוף את התעלות, ולאחר מכן הזרימו מבאר הטעינה 8 בלחץ של 6 PSI למשך 10 שניות. הסירו את המים מכל הבארות והחליפו אותם ב-250 µL של מצע SC בבארות הכניסה 1 עד 6 וב-50 µL של תרבית התאים שהוכנה בבאר טעינת התאים.אטמו היטב את סבון האוניקס (onyx manifold) ללוח והחלו בהכשרת התעלות ותא התרבית על ידי זרימה מבארות הכניסה 1 עד 6 בלחץ של 6 PSI למשך שתי דקות. לאחר מכן, בצעו זרימה אך ורק מבאר הכניסה המכילה את מצע הגידול ההתחלתי למשך חמש דקות לפחות. המשיכו בזרימה רציפה בלחץ של 6 PSI עד לשלב המיקרוסקופ. הדביקו את הלוח למעמד הבמה באמצעות סרט דביק כדי למנוע את תזוזתו במהלך הניסוי ובכך לשפר את מעקב התאים במהלך ניתוח הנתונים. לאחר הכנת המיקרוסקופ כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, הניחו מספר טיפות של נוזל טבילה על העדשה והרכיבו את ההתקן המיקרופלואידי בצורה מאובטחת.בבמה של המיקרוסקופ ההפוך, התמקדו בשליש השמאלי ביותר של תא התרבית הראשון באמצעות אחד מסמני המיקום המובנים. הפסיקו את הזרימה מבור כניסת המצע ואת הזרימה מבור טעינת התאים שמונה בלחץ של 6 PSI בפולסים של חמש שניות. הזז את הבמה כדי לחפש תאים מסביב לתא התרבית.הגדילו את זמן זרימת הטעינה ואת הלחץ עד להשגת צפיפות התאים הרצויה, אך הימנעו מעומס יתר ומסתימה של המחסום השמאלי ביותר, שדרכו נכנס המצע הטרי לתא. התחילו את הזרימה מבאר כניסת המצע המכילה את מצע ההתחלה בלחץ של six PSI. בתוכנת Metamorph או בתוכנה אחרת לאוטומציה ובקרת מיקרוסקופיה.הגדירו רכישת נתונים רב-ממדית לצילום של מספר תמונות במיקומים שונים של הבמה לאורך זמן. הגדירו את מספר נקודות הזמן ואת המרווח ביניהן. לאחר מכן, בחרו מספר מיקומי במה המכילים כ-10 תאים בכל מיקום.הגדירו את הרכישה כך שבכל מיקום של הבמה ובכל נקודת זמן, התוכנה תבצע מיקוד של תמונת שדה בהיר באור תבניית (transmitted light) באמצעות שיטת המיקוד האוטומטי המובנית של Metamorphs, תוך יישום המיקוד האוטומטי כיומן (journal) שנכתב באופן מותאם אישית בתחילת כל שלב של הבמה. הגדרה לפי מיקום מאפשרת שליטה רבה יותר בדיוק המיקוד. כמו כן, הגדירו את התוכנה לרכוש את תמונת השדה הבהיר בתוספת של 1 µm למישור המיקוד, ולרכוש תמונת שדה בהיר מחוץ למיקוד במינוס 4 µm למישור המיקוד.השתמשו ביומנים (journals) שנכתבו במיוחד כדי לשנות את המוקד בין התמונות לפי הצורך. לבסוף, הגדירו את התוכנית. רכשו תמונת סקאלה של גווני אפור אחת עבור כל רפורטר פלואורסצנטי במישור המוקד.השתמש בהגדרות שעברו אופטימיזציה לרכישה מהירה עם מינימום פוטו-בליצ'ינג (photo bleaching). הכן את תוכנית הזרימה עבור הניסוי בתוכנת הבקרה onyx. לאחר מכן, התחל בו-זמנית את תוכנית הרכישה ב-Metamorph ואת תוכנית הזרימה בתוכנת הבקרה Onyx.הריצו את קובץ ה-M בשם format data ב-MATLAB כדי לפתוח את ממשק המשתמש הגרפי (GUI) להזנת נתונים. בחלק העליון, הגדירו או דפדפו אל התיקייה המכילה את קובצי התמונות כדי לקבוע את ספריית הנתונים, ולאחר מכן השתמשו ב-GUI כדי להגדיר את סוגי הנתונים ואת קובצי התמונות שהוקלטו בניסוי. המשיכו בבחירת פרמטרי הסגמנטציה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.בחירת הפרמטרים המתאימים לסגמנטציה של תמונות בשדה בהיר (brightfield) עלולה להיות קשה, והיא משפיעה באופן משמעותי על איכות נתוני סדרת הזמן המתקבלים. אנו מתמקדים בזיהוי כל אזורי התאים, כאשר העדפה ניתנת לסגמנטציה יתר (over-segmenting) על פני סגמנטציה חסרה (under-segmenting) של האזורים. במהלך בדיקה חזותית של הנתונים, ניתן למזג אזורים שעברו סגמנטציה יתר כדי ליצור אזורי תא שלמים, אך לא ניתן לפצל מאוחר יותר אזורים שעברו סגמנטציה חסרה.הגדירו את פרמטרי הסגמנטציה השונים ובחנו את איכות הסגמנטציה על ידי לחיצה על test. אזורים שסומנמו בהצלחה יופיעו בירוק עם גבולים במגנטה. ודאו שאתם משתמשים בסרגל הגלילה כדי לבדוק נקודות זמן מרובות בסרטון כדי לוודא שהסגמנטציה מספקת.בחר ב-done כדי להחזיר את פרמטרי הסגמנטציה לממשק הגרפי של נתוני הפורמט. לאחר בחירת פרמטרי הצבע כפי שמתואר בטקסט, לחץ על כפתור ה-auto threshold כדי לקבוע את הסף באופן אוטומטי. באמצעות שיטת tzu, התמונה תדגיש את האזורים שנשמרו מעל הסף.ניתן להתאים את סף הרגישות באופן ידני באמצעות תיבת העריכה. השתמשו בסרגל הגלילה כדי לוודא שסף הרגישות מתאים לכל נקודות הזמן. לאחר מכן, לחצו על "סיום" (done).כדי להחזיר את הסף לממשק הגרפי של עיצוב הנתונים (format data gui), לחצו על add ולאחר מכן על segment. כדי ליצור את מסכת הצבע, לחצו על format data כדי לקרוא את קבצי התמונה, לעבד את הנתונים וליצור קובץ dot mat בתיקייה המוגדרת. קובץ זה ישמש כקלט לממשק הגרפי של עיבוד סדרות עתיות (process time series gui).הפעל את קובץ ה-M של סדרות הזמן של התהליך ב-MATLAB כדי לפתוח את ממשק המשתמש (GUI) למעקב. לאחר פתיחת ממשק המשתמש, הגדר תחילה את גובה התא. ערך זה מציין את גובה התא שבו התאים כלואים.זה משמש כמגבלה בקירוב נפח התא כאלליפסואיד תלת-ממדי בהתבסס על הציר הראשי והציר המשני של אזור התא. לאחר מכן הגדירו מיקרומטרים לפי פיקסל. זהו מקדם ההמרה המשמש לכיול המרחק מפיקסל למיקרומטר בתמונות, כך שניתן יהיה לכייל את שטח החתך ואת הנפח במיקרומטרים רבועים ובמיקרומטרים מעוקבים, בהתאמה.בשלב הבא, השתמש בפאנל המסננים כדי להגדיר את הפרמטרים המינימליים והמקסימליים לצורך סינון אזורים לא רלוונטיים ("junk regions") במסכה. Area הוא שטח האזור בפיקסלים. ECC הוא מקדם האקסצנטריות, כאשר ככל שהערך קרוב יותר לאפס, הצורה היא מעגלית יותר.ו-SF הוא מקדם הצורה (shape factor), שערכו שואף לאחד ככל שהצורה מעגלית יותר. לחצו על טעינת תמונות (load images) בפאנל הקלט/פלט (input output panel) ובחרו את קובץ הנתונים מסוג dot mat הרלוונטי שהופק על ידי ממשק משתמש עיבוד הנתונים (format data gui). מסכת האזור (region mask) תיושם על כל ערוץ צבע ויבוצעו מספר מדידות שונות. קובץ הנתונים יישמר לאחר בחירה בפרמטר מעקב אחר תאים (track cells) כפי שמתואר בטקסט.לחצו על תאי מעקב כדי לעקוב אחר אזורים מפריים אחד למשנהו באמצעות ה-OIDs של האזורים כדי להקצות שושלות עבור ניצנים המופיעים מחדש, וכדי לשמור את הנתונים, שנו את הפרמטרים בחלונות הקופצים לפי הצורך. שושלות מוקצות באופן אוטומטי על ידי מזעור המרחקים בין ניצנים משוערים לבין אימהות פוטנציאליות בכל פריים.לחצו על הכפתור שמעל פאנל המידע של התא שנבחר, ובצעו קורציה (curation) לאזורים שסומנו באופן לקוי ולטעויות בהקצאת מזהים (ID) או שושלות (lineage), באמצעות כלי ה-gooey השונים או מקשי הקיצור המתוארים בפרוטוקול הטקסט, כדי לאתר ולתקן את הנתונים כראוי. מזגו אזורים שסומנו באופן יתר (over segmented), מחקו אזורים שאינם תופסים את התא כולו, וודאו כי מערכות היחסים בין התא האם לניצן (mother bud) הוקצו כראוי. כמו כן, הסירו מזהים ירוקים על ידי מיזוג אזורים.תיקון המזהה (id), שיוך האזור לאם, הגדרה ללא אם או מחיקת האזור. מאחר שנתוני ניצנים יתווספו לאלו של האם במהלך הניתוח הסופי והסופי ביותר. אין למזג אזור ניצן עם האם שלו.בצע בדיקה ויזואלית של הנתונים עבור כל פריים עד לנקודת הזמן האחרונה הרלוונטית. אין צורך לבצע זאת עבור כל סדרת הזמנים. במידה ולא נעשה שימוש בפריימים המאוחרים יותר, ודא שאתה שומר את השינויים לאחר שבדיקת כל אזורי התאים בוצעה לאורך טווח הזמנים הרלוונטי, כאשר הנתונים עבור כל ערוצי הפלואורסצנציה ואופן שינויים לאורך הזמן מוכנים להוצאה (output).לחץ על time series analysis כדי לנתח את סדרות הזמן עבור תאים שלמים לאורך זמן. חשב נתונים על מחזור התא והפק נגזרות. ייפתח חלון שיאפשר בחירה של המדידות הרלוונטיות והזנה של פרמטרי הניתוח. הזן את נקודת הזמן האחרונה שעובדה ב-gooey.פרמטרי ההחלקה והשיוך למחזור התא כברירת מחדל עובדים היטב עבור זנים הפלואידיים ודיפלואידיים שצולמו במרווחי זמן של חמש דקות, אך ייתכן שיהיה צורך לשנותם כדי להגיע לתוצאות מיטביות. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, יש לבחור ב-analyze כדי לייצא נתוני סדרות זמן של תאים בודדים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. ניסוי שבוצע ונותח בהצלחה יניב סדרות זמן רציפות ברובן עבור תאים שלמים בודדים עם זמני הופעה וחלוקה שהוקצו באופן ריאליסטי עבור זן שמרים הפלואידי המבטא עותק אינטגרטיבי של חלבון פלואורסצנטי Ian או CFP המונע על ידי פרומוטור DH1 קונסטיטוטיבי. מדידות של תאים שלמים לאורך זמן התקבלו מניתוח סדרות הזמן.תמונות השדה המואר מציגות את תא האם המפולח בכחול ואת הניצנים שלו בירוק. כאשר התא השלם הרציף מוקף בקו אדום, עולה תלות במחזור התא הן עבור הנפח והן עבור הביטוי. כאן, אזורים מוצללים מראים כאשר התא נמצא ב-SG two M ויש לו ניצן; תהליך הניצון מתחיל במעבר מ-G one ל-S, מלבן לאפור.ההצללה וחלוקת התאים מתרחשות במעבר מ-M ל-G1, עם מעבר מהצללה אפורה ללבנה לאחר היווצרות הניצן. הנפח המשולב הכולל עולה במהירות רבה יותר מאשר קודם לכן, אך בזמן ההופעה ריכוז החלבון או העוצמה הממוצעת יורדים מעט. העלייה בחלבון האינטגרלי המשולב מואצת אף היא לאחר הניצון בהשוואה לאזור האם לבדו.תוצאות אלו מדגימות את החשיבות של שילוב נכון של תרומות הניצן למדידת התא השלם, ומדגישות את הצורך בהקצאה נכונה של זמני היווצרות הניצן והחלוקה. ניתן להשתמש בסדרות הזמנים המובחנות כדי לחשב רמה יחסית רגעית של mRNA וקצב תעתוק, ששניהם עולים גם הם לאחר הניצון, ובכך להגביר את היכולת ליצור זמן יציב. נגזרות של סדרות זמני המדידה יתרומו גם למחקרים קינטיים המשתמשים במערכת הביטוי הניתנת למיתוג המתוארת בפרוטוקול הטקסט.ניתוח סדרות עיתים מראה מתי גורם השעתוק ממוקם בגרעין ומתי הגן המטרה מתחיל ומסיים את ביטויו. השעתוק המוצג כאן הוא מיקרוגרפים מארבעת ערוצי הרכישה המצוינים עבור תא עם PHO four Tet R trans activator המחובר ל-YFP שניתן להחלפה. ה-trans activator ממוקם בגרעין המסומן ב-RFP בתגובה לרמות פוספט נמוכות ומניע ביטוי של reporter CFP עם פרומוטר seven X Tet O.קצב התעתוק המושמע משתנה בהתאם ללוקליזציה בממוצע וברמת התא הבודד. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע ניתוחים נוספים של נתוני סדרות הזמן הרב-ממדיות של התא הבודד כדי לענות על שאלות נוספות, כולל כיצד משתנה הביטוי באוכלוסייה לאורך זמן? האם השפעות של תנודות חיצוניות עוברות בירושה לאורך מספר דורות?האם קינטיקת הפעלת הגנים משתנה בעת הפעלה מחדש? האם למחזור התא יש תפקיד, ושאלות רבות אחרות הדורשות ניתוח של צמיחת ביטוי גנים ומסלולי שושלות של תאים בודדים.

acquiring-fluorescence-time-lapse-movies-budding-yeast-analyzing

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

המחיקה ין overexpression חלבון שיטות משותף ללימוד פונקציות של חלבונים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח התפתחות פנוטיפ כפונקציה של ריכוז החלבון על האוכלוסייה תא בודד...

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

אנו מספקים שיטה בסיסית הניתנת לשחזור למיקרוסקופיה ארוכת טווח של מחזור החיים המיני של שמרי ביקוע. עם התאמות קלות שתוארו, הפרוטוקול המוצג מאפשר התמקדות מחקרית בשלבים שונים של תהליך הרבייה.

מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני

כימות מדויק של אירועי סחר בשלפוחית מספק לעתים קרובות תובנות מפתח לגבי תפקידים של חלבונים ספציפיים והשפעות של מוטציות. מאמר זה מציג שיטות לשימוש ב-pHluorin סופר-אקליפטי, וריאנט GFP רגיש ל-pH, ככלי לכימות אירועים אנדוציטיים בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותי וציטומטריית זרימה.

יישומים של pHluorin עבור כמותי, קינטי וניתוח תפוקה גבוהה של אנדוציטוזה שמרים הנצה

מאמר זה מציג פרוטוקול מותאם לייצור שבבי microfluidic ואת ההתקנה של ניסויים microfluidic כדי למדוד את אורך החיים פנוטיפים הסלולר של תאי שמרים בודד.

באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד

ניצני שמרים הוא מודל יתרון לחקר הדינמיקה microtubule in vivo עקב גנטיקה חזקה שלה ואת הפשטות של שלד התא microtubule שלה. הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להפוך ותאי שמרי התרבות, לרכוש תמונות מיקרוסקופיה confocal, וגם כמותית לנתח דינמיקת microtubule בתאים חיים שמרים.

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

פרוטוקול זה מתאר את הניתוח של מסומן בתוך התאים התאיים בתוך שמרים באמצעות מרובת צבעים 4d (זמן הפקיעה 3d) קונפוקלית מיקרוסקופ. הפרמטרים הדמיה נבחרים כדי ללכוד אותות הולמים תוך הגבלת photodamage. תוספים מותאמים אישית של ImageJ מאפשרים מבנים עם תוויות למעקב וניתוח כימות.

4D מיקרוסקופ של שמרים

כאן, אנו מציגים הדמיה תא חי שהיא שיטת מיקרוסקופ לא רעיל המאפשר לחוקרים ללמוד התנהגות החלבון הדינמיקה הגרעינית בתוך חי ביקוע תאים שמרים במהלך מיטוזיס ו meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

שמרי ביקוע משמשים כאן כפונדקאי הטרולוגי לביטוי חלבוני שלד ציטו-שלד חיידקיים כגון FtsZ ו-MreB כחלבוני היתוך תרגומיים עם GFP כדי להמחיש את הפילמור שלהם. כמו כן, תרכובות המשפיעות על פילמור מזוהות על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

שמרי ביקוע כפלטפורמה למסכי תרופות אנטיבקטריאליים המכוונים לחלבוני שלד ציטו-בקטריאלי

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות לעצירת מחזור תאי שמרים ושחרור אופציונלי, ומרחיב על השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית לחקר תהליכים תלויי מחזור תא ב-S. cerevisiae.

מניפולציה וניתוח של תהליכים תלויי מחזור התא בשמרים ניצנים

למדו לרכוש סרטי זמן-הקרנה של שמרים ולנתח דינמיקה של תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ומעקב אוטומטי אחרי שושלות תאים. שיטה זו מאפשרת חקר שינויים בשיעורי שעתוק לאורך מחזור התא.

רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי

גלה סרטונים נוספים