Name: בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: למדו שיטה לבידוד תאי אנדותל חדרית עובריים מעוברים טרנסגניים של עכברים באמצעות נוגדנים ומגנט. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מפורט של תאים ספציפיים לחקר התפתחות כלי הדם והלב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לאנדראה Portbury לקריאה ביקורתית של כתב היד, מעבדת השירות של מיקרוסקופ UNC לקבלת סיוע בזמן לשגות ההדמיה, ו-NIH (מענק # R01HL061656) לתמיכה במימון.

1. הכן את חרוזים נוגדנים מצומדות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני לנתיחה, לשלב את הנוגדן של בחירה עם Dynabeads המתאים (כגון חולדת Dynabeads IgG לנוגדנים גדלו בחולדה, 4 x 10 8 חרוזים / מ&quot;ל) להוראות היצרן. לנוגדן אנטי CD31 חולדת BD (0.5 מיקרוגרם / μl, המשמש לבודד תאי אנדותל), 3 נוגדן μl מתווסף לכל 25 חרוזים μl, לריכוז סופי של 1.5 מיקרוגרם נוגדן אנטי-CD31 ו1 x 10 7 / חרוזים 25 חיץ μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חרוזים ונוגדני לילה בשעה 4 ° C. </li></ol> 2. הכנת פלייט קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מבודדים יוצרים צינוריות במהירות רבות יותר כאשר גדלו על ג&#39;ל קולגן בניגוד לסתם צלחת קולגן מצופה. לכן, ג&#39;ל קולגן נעשים בלילה שלפני הניתוח, כפי שתואר ב6. על קרח במכסת מנוע בתרבית רקמה, לשלב את ריאגנטים הבאים (מספיק 19 בארות): 206.4 H סטרילי μl &lt;תת&gt; 2 O, 140.4 סוג קולגן μl אני (4.08 מ&quot;ג / מ&quot;ל), 38.4 M199 10x μl, ו1.15 μl 5 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה μl 20 של ג&#39;ל קולגן זה לתוך הבארות של צלחת תרבית רקמת 384 גם. מניחים את הצלחת 37 ° C תרבות רקמות חממה למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80 DMEM μl לכל היטב דגירה במשך 15 דקות ב 37 ° C. הסר את התרבות בינונית ולחזור פעמיים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה הסופית, להוסיף 80% 10 μl FBS / DMEM זה היטב דגירה הלילה בשעה 37 ° C. הסר את התרבות בינונית לפני הוספת התאים הבודדים. </li></ol> 3. בלו ולעכל לב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר מתוזמן בהריון ביום העוברי הרצוי באמצעות טכניקת המתת חסד מאושרת. כל הניסויים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת שימוש באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ&#39;אפל היל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם העכבר במצב שכיבה, בנדיבות לרסס את צד הגחון של הנקבה עם אתנול 70% לפנינתיחה. בעזרת מלקחיים כדי להרים את עור הבטן התחתון ושריר מהאיברים הפנימיים, לחתוך לפתוח חלל הבטן התחתונה של הנקבה כדי להמחיש את האיברים הפנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את צוואר הרחם עם מלקחיים, לחתוך בזהירות הזנב למלקחיים ולהתחיל להרים את קרן הרחם מחלל הבטן. תוך הרמת קרן הרחם, חתך את כל רקמת חיבור שמחזיקה את הקרן במקום. כדי לסיים מוציא את קרן הרחם, חתך את הצומת של קרן הרחם עם oviduct לשחרר את קרן הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קרן הרחם בצלחת פטרי שמכילה תמיסת מלח קר 1x פוספט שנאגרו (PBS) ולשטוף במידת הצורך. גזור לפתוח קרן הרחם דרך קו האמצע לחשוף את שקי העובריים המצורפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור לפתוח השק עוברי בצומת של השליה ואת העובר, כדי למנוע טעות חיתוך העובר ולאחזר עובר. הנח את העובר בצלחת פטרי שנייה עם PBS הקר. להחזיר את צלחת פטרי עם קרן הרחם לקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Decapitate העובר כדי לשפר את הגישה לקיר החזה. אם genotyping הוא צורך, לחתוך את הזנב כדי להסיר אותו ולשמור בצינור Eppendorf מונח על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם העובר על הגב שלה, לחתוך לפתוח את דופן בית החזה כדי להמחיש את הלב וריאות. כדי להימנע מחיתוך הלב, לעשות חתך אנכי בצד של כלוב הצלעות, ליד forelimb, ואחריו חתך אופקי לרוחב החלק התחתון של הצלעות, ולאחר מכן משוך בעדינות את בית החזה ואת הדרך. דרך כ יום עוברי 13.5, קיר החזה הוא שקוף, בסיוע בהדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רם בזהירות את הלב באמצעות מלקחיים ולחתוך את כלי בהמשך. לאחר מכן, לחתוך מעל כלי הגדול כדי לשחרר את הלב. אם כלי ריאתי לא נחתכים, הריאות ניתן להסיר עם הלב. לפיכך, להסיר רקמות זרות, כמו הריאות, במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד ולהשליך את כלי הפרוזדורים וגדולים מהחדרים. בעזרת מספריים, ברר את החדרים לחתיכות קטנות (כ 1 מ&quot;מ 3 &lt;/ Sup&gt;) ומקום בכ -500 collagenase μl (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בPBS סטרילי). שמור דגימות על קרח עד שכל חדרי לב טחון והניח בcollagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרו על השלבים הקודמים עד שכבר נכרת מכל העוברים את החדרים, איסוף כל לב בצינור Eppendorf נפרד. אם יש לי כל העוברים באותו גנוטיפ, לב עשוי להיות נקווה בצינור Eppendorf אחת. מספר הדגימות שעובדו בכל פעם אחת עלול להיות מוגבל המבוסס על המגנט משמש לבידוד; DynaMag (123-21D) משמש כאן מחזיק מקסימום של 16 צינורות Eppendorf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את החדרים הטחונים ב 37 ° C עם הנדנדה למשך 45 דקות. בכל 15 דקות, להסיר בעדינות את הדגימות ו פיפטה מעלה ומטה כדי לנתק מכאני את התאים. </li></ol> 4. בידוד תאי האנדותל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את פתרון חדר-collagenase דרך 70 מיקרומטר סינון כדי להסיר גושים הנותרים של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 400 במשך 10 דקות. להשליךsupernatant, להחליף עם כ 200 FBS 10% μl בDMEM, ופיפטה מעלה ומטה כדי לנתק את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב הקודם ועונה אחת. צנטריפוגה התאים ב XG 400 במשך 10 דקות אחרי השני 10% לשטוף FBS / DMEM. Resuspend התאים 50 FBS 10% / DMEM μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך השלב הסופי צנטריפוגה, להכין את החרוזים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור Eppendorf המכיל נוגדנים וחרוזים על מגנט דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הצינור במקום על המגנט, להסיר את supernatant. הסר את הצינור מהמגנט ולהוסיף כ 100 FBS 10% / DMEM μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור על מגנט דקות 1. הסר את supernatant, ולשטוף שוב עם FBS 10% / DMEM. חזור על פעולה עבור סכום כולל של 3 שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי, resuspend את חרוזי נוגדנים מצומדות בFBS 10% / DMEM (5 μl לדגימה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל דגימה של תאים, מוסיף 5 μl של חרוזי נוגדנים מצומדות. מניחים את השעיות חרוז הסלולריים על 4 מעלות צלזיוס עם נדנדה עבורדקות R 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במכסת מנוע זרימה למינרית, למקם את צינורות Eppendorf המכילים תאים וחרוזים נוגדנים מצומדות על מגנט דקות 1. הסר את supernatant, הסר את הצינורות מהמגנט, ולשטוף עם FBS כ 100 μl 10% / DMEM. חזור על פעולה עבור 5 שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה האחרונה, מניח את הצינורות על מגנט דקות 1, להסיר את supernatant, והסר את הצינורות מהמגנט. הוסף כ 100 DMEM μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות על מגנט דקות 1, להסיר את supernatant, והסר את הצינורות מהמגנט. הוסף 100-200 μl prewarmed 0.25% טריפסין-EDTA. דגירה הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות על המגנט במשך 2 דקות. להעביר את supernatant המכיל תא בזהירות לצינורות Eppendorf טריים. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 400 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant. Resuspend התאים בינוני 80-100 μl צמיחה וצלחת ב96 - או 384 היטב צלחת תרבות מטופלים, בהתאם לתשואה הצפויה(כ 450-600 תאים מהחדרים של E14.5-E16.5 עוברים). לתאי אנדותל, השתמש במדיום תרבות צמיחת אנדותל (מוגדר להלן). </li></ol>

<ol><li>Landecker, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLandecker%2C+H+%22Culturing+Life%3A+How+Cells+Became+Technologies%22">Culturing Life: How Cells Became Technologies</a>. , Presidents and Fellows of Harvard College. (2007).</li>
<li>Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+dysfunction+and+cytoskeletal+changes+associated+with+repression+of+p16%28INK4a%29+during+immortalization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization.</a> Oncogene. , (2012).</li>
<li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+endothelium%3A+an+emphasis+on+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Thromb.+Hemost%22%5BJournal%5D)">Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity.</a> Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).</li>
<li>Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).</li>
<li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li>
<li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels%3A+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li>
<li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+angiogenesis%3A+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).</li>
<li>Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+kidney+fibrosis+emerge+via+endothelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology+%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).</li>
<li>Chang, L., Noseda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+vascular+smooth+muscle+cells+from+local+precursors+during+embryonic+and+adult+arteriogenesis+requires+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling.</a> PNAS. 109, 5993-6998 (2012).</li>
<li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).</li>
<li>Frauli, M., Ludwig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+a+culture+of+human+endometrial+stromal+cells+using+a+medium+containing+D-valine%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Gynecology+and+Obstetrics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).</li>
<li>Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+L-valine+reduced+selective+media%5BTitle%5D)+AND+%22Research+communications+in+chemical+pathology+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media.</a> Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).</li>
<li>Arima, S., Nishiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

עבודה עם תאים עובריים ראשוניים מאפשרת ניסויים חדשניים לטיפול בשלבים קריטיים של פיתוח במבחנה. עם זאת, הליך הבידוד הוא לא טריוויאלי. שלבים קריטיים לבידוד כל סוג של תאים כוללים הבטחה כי התאים מופרדים היטב על עיכול collagenase ולאחר מכן שהם הושעו גם במהלך השלבים לשטוף. נתיחה מכאנית על ידי pipetting מאוד עוזרת להפריד את התאים במהלך שלב collagenase, וצעד הסינון מסיר גושים של תאים. צעדים אלה ישפרו את הטוהר האוכלוסייה ואת התשואה. <p class="jove_content" style=";text-...

כניסתו של שורות תאים הנציחו יש מהפכה ביולוגיה של תא בסיסית 1. שורות התאים הקיימים כיום נגזרות ממגוון רחב של איברים ולהקיף את כל סוגי התאים העיקריים. עם זאת, יש לי שורות תאים הוקמו כמה מגבלות. תהליך ההנצחה ברור שמשנה את אופן הפעולה של התאים, במיוחד ביחס לתוחלת חיים והתפשטות, אלא גם יכול להשפיע על הביטוי של חלבונים בלתי צפויים, כגון חלבוני cytoskeletal 2. בנוסף, למרות ששורות תאים רבות ושונות זמינות, יש גיוון משמעותי בקרב אפילו סוג תא בודד בתוך כל אורגניזם. תאי אנדותל בהתנהגויות מגוונות מופע מסוימות המבוססים על אם הם קו עורקים או ורידים ואיזה סוג של זרימה הוא הווה בכלי 3. ועוד יותר דחוף מבחינה התפתחותית, לעומת זאת, הוא שהרוב המכריע של שורות התאים הזמינות נגזרים מרקמות בוגרת (ראה, למשל tהוא אוסף זמין דרך ATCC). שורות תאי בוגרים אלה עשויים לא לשחזר את האופי הדינמי של המבשרים העובריים שלהם. את דפוסי ביטוי גנים spatiotemporal המשתנים במהירות שנצפו במהלך פיתוח גם מצביעים על כך שתא האנדותל מאיבר אחד בכל שלב התפתחותי נתון לא יכול להתנהג באותה הצורה כמו תא האנדותל מאותו איבר בשלב התפתחותי שונה. כחלופה לשימוש בשורות תאים הנציחו זמינות מסחרי, ניתן לבודד תאים ראשוניים מהרקמה הספציפית של עניין. בין היתרונות של טכניקה זו, ניתן לבודד תאים הראשוניים אלה מאיבר מסוים או אפילו חלק מאיבר בכל שלב התפתחותי מסוים. יתר על כן, ניתן לבודד תאים הראשוניים אלה ממגוון הרחב של בעלי חיים מהונדסים זמינים, המאפשרים במחקר במבחנה של נוקאאוט הגן ודפיקה ב, תוך הימנעות בעיות אחרות כגון יעילות transfection. באופן לא מפתיע, רביםטכניקות כבר פורסם מפרטות כיצד לבודד סוגי תאים מסוימים 4,5. באופן כללי, טכניקות אלה כרוכים באיסוף באזור של עניין, dissociating תאים, תיוג סוג התא המסוים של עניין, ומבודד את התאים הללו לניתוח נוסף. ללמוד אוכלוסייה עוברית מוקדמת של תאי האנדותל הכליליים, אנו scaled למטה 4 טכניקה שפורסמו בעבר לשימוש עם איבר קטן יותר. עם הליך מוקטן זה, אנו יכולים לבודד את תאי האנדותל הכליליים מהלב העוברי בשלבים עובריים ספציפיים. תאים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש במבחני אנדותל מסורתיים, כגון ניתוחי הגירה. עד שורות תאים עובריים מוקדמות הפכו נפוצות יותר, עבודה עם התאים הראשוניים היא טכניקה לא יסולא בפז.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>ריאגנטים</עכברים</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>חזקים>בהריון מתוזמן</td><td>לניתוח בשלב העניין העוברי</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD31</td><td>BD Bioscience</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>עכברוש IgG Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>110-35</td><td></td></tr><tr><td>קולגן</td><td>BD Bioscience</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז, סוג I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>מדיום גידול תאי אנדותל</td> <td>(מיוצר במעבדה כמתואר בהערות)</td><td></td> <td>DMEM המכיל 20% FBS, 5 &mu; M &#946;-mercapt&#8211; תנול, 50 ומו; גרם/מ"ל א.ק.ג, ו-1x פניצילין/סטרפטומיצין</td></tr><tr><td>&#946;-mercapt&#8211; תנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>א.ק.ג'י</td><td>טכנולוגיות ביו-רפואיות, בע"מ</td><td>BT-203</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית 384 בארות</td><td>Greiner</td><td>T-3037-6</td><td>Plate הוכן עם ג'ל קולגן דק, כמתואר ב6; שטח פנים עבודה 10 מ"מ2קולגן</td></tr> <tr><td>סוג I</td><td>BD</td><td></td><td>354236 לשימוש סופי ריכוז של 1.5 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>M199, 10x</td><td>Invitrogen</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Syto-16</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td>בשימוש לפי ההוראות ב-13 </td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ציוד</מיקרוסקופ ></td></tr><tr><td>סטריאוסקופי</td><td>חזק Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>חממת תרבית תאים</td><td>Thermo</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית</td><td>תרמו</td><td>75002430</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

תרבית תאים שיפרה באופן משמעותי את היכולת שלנו להעריך אוכלוסיות בודדות של תאים בתנאי התרבות עצום. בעוד שורות תאים הנציחו מציעות יתרונות משמעותיים לנוחות השימוש שלהם, שורות תאים אלה אינן זמינות לכל סוגי התאים הפוטנציאליים. על ידי בידוד תאים ראשוניים מאזור מסוים של עניין, במיוחד מעכבר מהונדס, ניתן לבצע מחקרים מורכבים יותר. הטכניקה הבסיסית כרוכה לנתח איבר או איברים חלקיים של עניין (למשל לב או באזור מסוים של הלב) וdissociating האיברים לתאים בודדים. תאים אלה מודגרת מכן עם חרוזים מגנטיים מצומדות לנוגדן שמזהה את סוג התא של עניין. התאים של עניין אז יכולים להיות מבודדים עם השימוש במגנט, עם דגירה קצרה טריפסין dissociating תאים מאת החרוזים. אז יכולים להיות מתורבתים תאים מבודדים אלה וניתח המועדפים. טכניקה זו תוכננה במקור עבור איבר עכבר בוגראבל ים וניתן לשנות בקלות את לשימוש עם איברים עובריים, כפי שמודגם במסמך זה. כי האינטרס שלנו הוא בכלי הדם כליליים פיתוח, אנחנו רוצים ללמוד אוכלוסייה של תאים זה בשלבים עובריים ספציפיים. לפיכך, פרוטוקול המקורי היה צריך להיות שונה כדי להיות תואם עם הגודל הקטן של החדרים העובריים והתשואה הפוטנציאלית הנמוכה של תאי האנדותל בשלבי התפתחותיים אלה. ניצול גישה מוקטנת זה, יש לנו להעריך שיפוץ מקלעת כלילית בתאי אנדותל חדריות עובריים מהונדסים.

באמצעות נוגדן ספציפי לאנדותל שמכיר CD31, תאי האנדותל בודדו מהחדרים של (E) 13.5 (איור 1 א) ו 18.5 (איורים 1 ב-1D) עוברים עובריים. כאשר גדלו על צלחת תרבות מטופל, התאים אלה יישארו מעוגלים והיינו ליצור דפוס מרוצף אם מחוברות קרובים (איור 1 א). קולגן לדלל שימש גם למעייל הבארות, ואילו תאי אנדותל ידבק אליו (איור 1), הם יוצרים פחות מאשר כאשר שרשרות מצופים בג&#39;ל קולגן (1C 1D ואיורים). תאי האנדותל גדלו הב...

תרבית תאים העיקרית היא טכניקה שימושית לניתוח אוכלוסיות מסוימות של תאים, במיוחד מעוברי עכבר מהונדסים בשלבי התפתחות ספציפיים. בזאת, חדרי לב עובריים הם גזורים וניתקו, וחרוזים נוגדנים מצומדות לזהות ולהפריד את תאי האנדותל לניתוח נוסף.

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי אנדותל ונטריקולריים עובריים. הדבר מתבצע תחילה על ידי השגת עובר לצורך דיסקציה, ולאחר מכן חוצת הלב.מסירים את העליות ואת הפרוסות של החדרים מעבירים לתמיסת קולגן. לאחר מכן מדגריים את תרחיף התאים הבודדים עם נוגדן המזהה תאי אנדותל. ולבסוף, משתמשים במגנט כדי לבודד את תאי האנדותל הקשורים לנוגדן.בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות היווצרות של שרשראות אנדותליאליות באמצעות מיקרוסקופיה בשדה בהיר. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ההתפתחות הקרדיווסקולרית, כגון אילו גורמים מקדמים נדידה של אנדותל כלי הדם העליליים. אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התנהגות תאי אנדותל, ניתן להחיל אותה גם על סוגי תאים אחרים, כגון מיוציטים ופיברובלסטים. ביום שלפני ביצוע הניתוח, בעבודה תחת מנדף לתרביות רקמה, ערבבו את הנוגדן הנבחר עם ה-dyna beads המתאימים, בהתאם להוראות היצרן עבור הנוגדן rat anti CD 31 שנעשה בו שימוש כאן.מוסיפים 3 µL של נוגדן ל-25 µL של חרו지를 לריכוז סופי של 1.5 µg ל-10⁷ חרוזים. מדגירים את החרוזים בנוגדן למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. להכנת ג'לי קולגן ליצירה מהירה של שפופיות (tubules) מתאים תאים מבודדים, עובדים בתוך מנדף תרביות רקמה על קרח. מערבבים קולגן מסוג I, מים סטריליים, 10X M199 ו-5 M סודיום הידרוקסיד. בהתאם לפרוטוקול הכתוב, מטרפלים 20 µL של ג'ל הקולגן אל תוך הבארות של פלטת תרבית רקמה בעלת 384 בארות.הנח את הפלטה בתוך אינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. הוסף 80 µL של DMM לכל באר והדגר למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 °C. הסר את מצע התרבית וחזור על השטיפה פעמיים נוספות; לאחר השטיפה האחרונה, הוסף 80 µL של 10% FBS DM לכל באר והדגר למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C.לאחר ביצוע הרדמה וקטיל (euthanasia) לעכברה בהריון ביום העוברי הרצוי, ובהתאם לטכניקה מאושרת ולהסרת קרן הרחם לפי הפרוטוקול הכתוב, הנח אותה בצלחת פטרי עם XPBS אחת ושטוף אותה. לאחר חשיפת שקי העובריים באמצעות חתך בקו האמצע בחיבור שבין השליה לעובר, חתוך שק עוברי אחד והוצא ממנו את העובר.העבירו את העובר לצלחת פטרי שנייה עם PBS קר והחזירו את קרן הרחם לקרח כדי לשפר את הגישה לדופן בית החזה לצורך ביצוע דקפיטציה (ניתוק ראש) לעובר. ובמידה ומבצעים גנוטיפינג, גזרו את הזנב ושמרו אותו במבחנה על קרח. כאשר העובר מונח על גבו, בצעו חיתוך.פתחו את דופן בית החזה כדי לחשוף את הלב והריאות ולהימנע מחיתוך של הלב. בצעו חיתוך אנכי לאורך דופן כלוב הצלעות סמוך לגפה אחת, ולאחריו חיתוך אופקי לרוחב החלק התחתון של הצלעות. לאחר מכן, משכו בעדינות את דופן בית החזה כלפי מעלה ומחוץ לנתיב, עד ליום עוברי 13.5 בקירוב.דופן בית החזה שקופה, דבר המסייע בהדמיה. בעזרת פינצטה, הרימו בזהירות את הלב וגזרו את כלי הדם שמתחתיו. במידת הצורך, העבירו את הלב לצלוחית נקייה כדי להפרידו מהריאות, על ידי גזירה מעל כלי הדם הגדולים.בשלב הבא, הפרה והסר את העליות ואת כלי הדם הגדולים מהחדרים. לאחר מכן, בעזרת מספריים, קצץ את החדרים לחתיכות קטנות והעבר אותם לכ-500 microliters של collagenase על קרח. הוצא ועבד את החדרים משאר העוברים, כאשר כל לב נאסף לשפופרת נפרדת.הנח את חלקי החדרים הקצוצים בטמפרטורה של 37 °C עם נדנוד למשך 45 דקות. בכל 15 דקות, הוצא בעדינות את הדגימות ובצע פיפטינג (שאיבה ושחרור) כדי לפרק את התאים באופן מכני. לאחר האינקובציה, העבר את תמיסת הקולגנאז של החדרים דרך מסנן של 70 µm כדי להסיר גושי תאים שנותרו, סנטריפוג את התאים ב-400 ×g למשך 10 דקות, השלך את הנוזל העליון והחלף אותו בכ-200 µL של 10% FBS ב-DMEM. בצע פיפטינג כדי לתלה מחדש את התאים, סנטריפוג את התאים שוב, ולאחר שטיפה וסנטריפוגה שנייה, תלה מחדש את התאים ב-50 µL של 10% FBS ב-DMEM.בשלב הבא, הכין את החרוצים על ידי הנחת מבחנה המכילה נוגדנים וחרוצים על מגנט למשך דקה אחת, ושאיבת הנוזל העליון (supernatant). לאחר מכן, הסר את המבחנה מהמגנט והוסף כ-100 µL של 10% FBS ב-dmm. החזר את המבחנה למגנט למשך דקה אחת, ולאחר מכן הסר את הנוזל העליון.חזור על השטיפה סה"כ שלוש פעמים לאחר השטיפה האחרונה. השהה מחדש את החרוזים המצומדים לנוגדן ב-10%FBS ב-DMM לכל דגימת תאים, והוסף חמישה µL של החרוזים המצומדים לנוגדן. הנח את תרחיפי החרוזים והתאים בטמפרטורה של 4 °C תחת נדנוד למשך 30 דקות במנדף זרימה למינרית, הנח את הדגימות על המגנט למשך דקה אחת, ושאב את העלייה.הוצא את המבחנות מהמגנט ושטוף עם כ-100 µL של 10% FPS ו-dm. חזור על הפעולה עד לביצוע חמישה שטיפות בסך הכל לאחר השטיפה האחרונה. השהה את החרו지를 בתוך כ-100 µL של DMEM.הנח את המבחנות על המגנט למשך דקה אחת. הסר את המצע, לאחר מכן הוסף 100 עד 200 µL של trypsin ב-EDTA 0.25% שחומם מראש, והדגר את הדגימות ב-37 °C וב-5% CO2 למשך חמש דקות. הנח את המבחנות על המגנט למשך שתי דקות.לאחר מכן, העבירו בזהירות את התאים המכילים את העלייה למבחנות חדשות וסובבו אותם בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-400 G. לבסוף, לאחר הסרת העלייה, השעיו את התאים ב-80 עד 100 µL של מצע גידול אנדותלס וזרוע אותם בצלחת תרבית מטופלת של 96 או 384 בארות, בהתאם לתשואה הצפויה. כל זוג חדרים מעוברי E 14.5 עד E 16.5 מניב בדרך כלל 450 עד 600 תאים, כפי שהודגם כאן באמצעות נוגדן ספציפי לאנדותלס המזהה CD 31. תאי אנדותלס בודדו מחדרי עוברי יום E 13.5.כאשר הן גדלות בצלחת תרבית לא מטופלת, תאים אלו נשארים עגולים ויוצרים תבנית של "cobblestone" (ריצוף אבנים) כאשר הם קרובים למצב של התמזגות (confluence). למרות שהתאים נצמדים לפלטות מצופות בקולגן מדולל, תאים אלו, שבודדו מחדרים (ventricles) של עובר ביום E 18.5, יוצרים פחות שרשראות מאשר כאשר הם מצופים על ג'ל קולגן. בנוסף, התאים יוצרים אינטראקציות בין-תאיות ושרשראות במהירות רבה יותר על ג'ל הקולגן לעומת הפלטה המצופה בקולגן, וזאת כאישור לזהותם.התאים באיור זה מסומנים באופן חיובי עם הסמן האנדותלי ISO selectin. בנוסף, כפי שמוצג כאן, תאי אנדותל שבודדו מחדרי לב ביום E 18.5 סומנו באופן חיובי עם הסמנים האנדותליים PAM ו-flick one. איור זה מציג תאי אנדותל שבודדו מחדרי לב של עובר ביום E 14.5 וסומנו בצבע הספציפי לאנדותל cyto.16 תאים מבודדים שורדים עד שבוע אחד בתרבית, אך הם עמידים ל-ization ולכן מתאימים ביותר לניסויים סופיים. לאחר שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בערך תוך שלוש שעות וחצי אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות אחרות כגון בדיקות יצירת צינורות (tube forming assays) ובדיקות נדידה ב-transwell כדי לקבוע כיצד תאים מבודדים אלו מתנהגים in vitro.

isolation-of-embryonic-ventricular-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זה פרוטוקול וידאו ממחישה את הבידוד של התרבות האנושית וריד הטבור בתאי האנדותל (HUVEC) מ חבל הטבור האדם. לאחר מבודד את התאים האלה יכול לשמש ב מבחני חוץ גופית אנגיוגנזה כמו Assay אופטימליים הפיברין ביד ג'ל הוכיח גם על ידי המעבדה יוז.

בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (HUVEC)

אנו מספקים שיטה בידוד אוכלוסיות culturing טהור של שסתום הלב תאים אנדותל (VEC). VEC יכול להיות מבודד צדי סף או העלעל ומיד הבאה, תא ביניים הבסיסית (ויק) בידוד היא פשוטה.

בידוד של תאים אנדותל valvular

מאמר זה יספק שיטה בידוד שליו culturing או עוף...

בידוד והתרבות של תאים עובריים העופות אבי valvular

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד והתרבות של Murine לתאי אנדותל ריאתי. שיטה זו כוללת מכונאי דיסוציאציה האנזימטית רקמת הריאות, כמו גם תהליך צעד 2-טיהור באמצעות אנטי PECAM-1 ואנטי ICAM-2 נוגדנים מצומדות כדי חרוזים מגנטיים, אשר מייצר אוכלוסיה טהור תא האנדותל של כלי הדם בעיקר מקור.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

וידאו זה מדגים אסטרטגיה קלה ואמינה להכנת תרבויות טהורות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי העוברי בתוך 10-12 ימים ויהיה שימושי עבור מחקר התמקד בהיבטים רבים של אנגיוגנזה מוחין.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

היכולת לבודד תאי אנדותל של מסתמי הלב (VECs) היא קריטית להבנת מנגנוני התפתחות, תחזוקה ומחלות של מסתמים.  כאן אנו מתארים את הבידוד של VECs מעכברי Tie2-GFP עובריים ובוגרים באמצעות FACS שיאפשר מחקרים הקובעים את תרומתם של VECs בתהליכי התפתחות ומחלות.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

גזע אבות היווצרות הדם תאים (HSPC) נובעים מתאי אנדותל מיוחדים (hemogenic) במהלך הפיתוח, עדיין מעט מאוד ידוע על התהליך שבו כמה תאי אנדותל לציין להפוך להרכיב דם. אנו מדגימים שיטה המבוססת זרימת cytometry המאפשרת בידוד סימולטני של תאי hemogenic האנדותל HSPC מרקמות עובריות בעכברים.

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

המטרה של פרוטוקול זה נועד לבודד ובתאים אנדותל של דם טבורי. חלק מהיישומים כוללות שימוש תאים אלה כמו סמן לזיהוי חולים עם הסיכון למחלות לב, במחלות איסכמי, ובונה יצירת שסתום כלי הדם והלב רקמות מהונדסים.

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

אנו מציגים פרוטוקול עבור בידוד של אנדוקקרודיאל ותאי הכליליים כלילית מלבבות חולדה באמצעות עיכול הרקמה הסדרתית במאגר העיכול, איסוף תא מחזורי צנטריפוגה חוזרים, וטיהור תאים באמצעות anti-rat CD31 microbeads.

בידוד של תאי כלילית ותאים כליליים מהקיר החופשי של לב החולדה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בידוד חריף של תאי שריר לב וכלי דם חלקים בני קיימא מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים (Danio rerio), המתאימים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים.

בידוד תאי שריר חלק לבביים וכלי דם מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים

למרות שהוא מאתגר, הבידוד של תאי אנדותל ריאתיים חיוני למחקרים על דלקת ריאות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך לבידוד בעל תפוקה גבוהה וטוהר גבוה של תאי אנדותל מקרו-וסקולריים ומיקרו-וסקולריים.

בידוד וטיהור תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ומקרו-וסקולריים מדגימות שמקורן בריאה

למדו שיטה לבידוד תאי אנדותל חדרית עובריים מעוברים טרנסגניים של עכברים באמצעות נוגדנים ומגנט. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מפורט של תאים ספציפיים לחקר התפתחות כלי הדם והלב.

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

גלה סרטונים נוספים