Name: התמיינות של תאי העור של עכבר יילוד נגזר גזע לתאים דמוי נבט במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: למדו שיטה ליצירת תאים דמויי ביציות מתאי גזע עוריים של עכברים יילודים. השיטה כוללת בידוד, פירוק וגידול במדיום מוגדר ליצירת תאי רבייה, עם אימות באמצעות PCR זמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מע&quot;צ נתמכת על ידי מכון קנדי ​​לבריאות מחקר מלגה (CIHR) ומענק CIHR לג&#39;רלד קידר באוניברסיטה מערבית. המחבר גם רוצה להכיר Julang לי באוניברסיטת Guelph לעזרה בפיתוח של הפרוטוקול המובא כאן.

1. מדיה הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת 2-3 שעות מראש של שימוש ומקום עם כובע משוחרר בתא שבו תרבות חממת הניסוי יהיה מתרחש. מדיה בשימוש בפרוטוקול הנוכחי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן נובע מדיום סלולרי בהיקף של DMEM/F12 בתוספת 1 X B27, 40 ng / ml bFGF, ו20 ng / ml EGF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום התמיינות תאים נבט בהיקף של M199 בתוספת FSH 0.05 IU, 0.03 IU LH, 3 מ&quot;ג / מיליליטר BSA, 5, פירובט הנתרן 0.23 מ&quot;מ μl / מ&quot;ל, 1 מ&quot;ג / מיליליטר Fetuin, וng 1 / מיליליטר EGF. מדיום בסיס המורכב של כל התוספים אבל השמטת FSH, LH יכול להיות מוכן וEGF ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. </li></ol></li></ol> 2. גזע הכנת תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד תאי גזע מגורי עכבר יילוד כפי שתואר לעיל 12. לנצל את תאי גזע בחלוף 2-4 בהתמיינות תאי נבט מבחנה. היעילות שלהיווצרות של נקודתי טיסה קשורה באופן ישיר לאיכות של תאי הגזע מתחילים. עדיף להתחיל את הבידול בהקדם האוכלוסייה נראית נקי ובריא שהוא בדרך כלל בסביבות מעבר 2. culturing עוד 2 מעבר העבר בתאי גזע משפיע לרעה על יעילות היווצרות של נקודתי הטיסה (תוצאות לא פורסמו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 שעות לפני ייזום בידול תת תרבות תאי הגזע. הסר את כל המצרפים המושעים כדוריים הסלולריים והתקשורת בילתה ממנת התרבות, באמצעות פיפטה סרולוגיות ומניחה בשפופרת 15 מ&quot;ל. חשוב לאסוף רק המצרפים המושעים כדוריים של תאים ולא התאים המחוברים לתחתית הצלחת, כי הם באופן ספונטני מבדל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים ב XG 500 במשך 5 דקות., לבטל את supernatant, resuspend ב 500 μl של תקשורת תאי גזע טרי חימם עד 37 ° C. בעדינות פיפטה המצרפים לניתק באופן חלקי את התאים. לא באגרסיביות אל פיפטה תאים כמו זה יפחית כדאיות תא. לשטוף את התאים באופן חלקי ניתק לתוך 9.5 מ&quot;ל של מדיום תאי גזע מראש חימם טרי על צלחת נמוכה מצורף 10 ס&quot;מ תא תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את התאים ל37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בתרבית תאים באינקובטור במשך 48 שעות לפני תחילתו של הבידול. </li></ol> 3. בידול של נקודתי טיסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה סרולוגיות להסיר את תאי גזע ממנת התרבות והמקום בצינור 15 מ&quot;ל, להשאיר מאחור את כל תאים מחוברים אליו. גלולה התאים ב XG 500 ו resuspend ב 500 PBS סטרילי μl. פיפטה הנמרצת את התאים באמצעות רחב נשאו 1,000 קצה μl לתוך גושים לא גדולים יותר מ 10-20 תאים. מעת לעת להסיר כמות קטנה של תאים, בעת הניתוק, ולבדוק תחת מיקרוסקופ אור לבן כדי לאשר תאים מצטברים בגושים של 10-20 תאים בודדים. על ניתוק יגרום לכדאיויות תא מופחתת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9.5 מ&quot;ל PBS לתאים ניתק ולהוסיף 15 μl של השעיה תא זה לhemocytometer לספירת תאים. גלולה התאים ב XG 500 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את התאים בריכוז של 6 1.32X10 תאים / מ&quot;ל במדיום התמיינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת התאים על ידי הוספת 500 μl לכל גם לתחתית שטוחה 24 מנה השעיה היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת 24 גם לתוך תא תרבות חממה ב 37 ° C ב 5% CO 2 למשך 48 שעות. הסר 250 בינוניות μl מכל טוב ומקום בצינור שכותרתו 1.5 מ&quot;ל בהתאמה. הוסף 250 בינוני בידול טרי μl היטב כל אחד. צנטריפוגה את המדיום בילה בXG 500 במשך 5 דקות. וזורקים supernatant. Resuspend כל תאי pelleted ב50 בינוני בידול טרי μl ולחזור לתרבות המקבילה גם על צלחת הבידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל 48 שעות לשנות את המחצית בינונית עד 12 יום של בידול. </li></ol>

<ol><li>van den Hurk, R., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+mammalian+oocytes+and+their+growth%2C+differentiation+and+maturation+within+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles.</a> Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).</li>
<li>Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+analysis+of+living+mouse+germ+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration.</a> Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).</li>
<li>Lawson, K. A., Hage, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+the+origin+of+primordial+germ+cells+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba+Found+Symp%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse.</a> Ciba Found Symp. 182, 68-91 (1994).</li>
<li>Ginsburg, M., Snow, M. H., McLaren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+germ+cells+in+the+mouse+embryo+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation.</a> Development. 110, 521-528 (1990).</li>
<li>Hubner, K., Fuhrmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+oocytes+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells.</a> Science. 300, 1251-1256 (2003).</li>
<li>Toyooka, Y., Tsunekawa, N., Akasu, R., Noce, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+can+form+germ+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells can form germ cells in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11457-11462 (2003).</li>
<li>Wang, L., Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-like+Cells+Induced+from+Mouse+Spermatogonial+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">Oocyte-like Cells Induced from Mouse Spermatogonial Stem Cells.</a> Cell Biosci. 2, 27(2012).</li>
<li>Dyce, P. W., Wen, L., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+germline+potential+of+stem+cells+derived+from+fetal+porcine+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin.</a> Nat. Cell Biol. 8, 384-390 (2006).</li>
<li>Danner, S., Kajahn, J., Geismann, C., Klink, E., Kruse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+oocyte-like+cells+from+a+clonal+pancreatic+stem+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line.</a> Mol. Hum. Reprod. 13, 11-20 (2007).</li>
<li>Cheng, X., Chen, S., Yu, X., Zheng, P., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP15+gene+is+activated+during+human+amniotic+fluid+stem+cell+differentiation+into+oocyte-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">BMP15 gene is activated during human amniotic fluid stem cell differentiation into oocyte-like cells.</a> DNA Cell Biol. 31, 1198-1204 (2012).</li>
<li>Song, S. H., Kumar, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+porcine+multipotent+stem%2Fstromal+cells+derived+from+skin%2C+adipose%2C+and+ovarian+tissues+and+their+differentiation+in+vitro+into+putative+oocyte-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells.</a> Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).</li>
<li>Dyce, P. W., Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+germ+line+potential+of+stem+cells+derived+from+newborn+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin.</a> PLoS One. 6, e20339(2011).</li>
<li>Linher, K., Dyce, P., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+germ+cell-like+cells+differentiated+in+vitro+from+skin-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells.</a> PLoS One. 4, e8263(2009).</li>
<li>Hayashi, K., Ogushi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Offspring+from+Oocytes+Derived+from+in+Vitro+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice.</a> Science. , (2012).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

עד כה OLCs הפונקציונלי לא פותחו באמצעות לחלוטין בassay חוץ גופית. לאחרונה מחקר על ידי הייאשי et al. היה מסוגל לייצר צאצאים מדמויים PGC תאים שנוצרו במבחנה והועברו in vivo להמשך פיתוח 14. החל עם תאי גזע עובריים או תאי pluripotent מושרה הם הצליחו ליצור תאים PGC כמו אשר, כאשר התאוששו בעקבות in vivo ההשתלה היו מסוגלים להיות התבגר, מופרה, ומשמש ליצירת צאצאים 14. זה מוכיח כי תאי גזע ממקורות שונים שיש לו את הפוטנציאל, בתנא...

במהלך העובר בשלב מוקדם, gametogenesis מתרחש דרך סדרה של שלבים, כולל תא חיידק קדמוני (PGC) היווצרות, הגירה, ולבסוף קולוניזציה של רכסי האשכים. במהלך תקופה זו עובר PGCs ריבוי והתמיינות לתאי מין יותר ויותר בוגרים יותר 1. העובדה שPGCs נודד מהבסיס של allantois לעובר במעי האחורי ולבסוף לאורך הקיר הגבי סופו של דבר ליישב את רכסי האשכים הופכת אותם קשה מאוד ללמוד 2. למרות התקדמות בתחום, מחקרים המנסים להבין את היווצרות והתמיינות PGC כבר הקשו על ידי המספר המוגבל שלהם, מיקום ואופי נדידת 3,4. בשנים האחרונות הוכחו בתאי גזע עובריים יש פוטנציאל ליצירת תאי הנבט במבחנה 5,6. כמו כן, כמה תאי גזע הסומטיים יש גם הוכחו כבעלי הפוטנציאל ליצירת תאי הנבט Follבשל בגידול חוץ 7-11. לאחרונה תאי גזע שבודדו מעור עכבר יילוד היו מובחן במבחנה לתאים דמויי חיידק וביציות בשלבים מוקדמים 12. במהלך בידול תת הקבוצה של תאי הגזע המבטאים Oct4 גדלה ומתחמים המזכירים מבני קומולוס-ביצית נוצרו. הביצית דמויות התאים (OLCs) ניתן לאסוף מהתרבויות ובהשוואה לביציות טבעיות. שימוש בשיטה זו התרבות OLCs מדידת 40-45 מיקרומטר מתקבלים כי סמנים דומים מפורשים לביציות כגון Gdf9b, ושה, וDAZL. עד כה את OLCs התוצאה יישאר מסוגל להתבגר או להיות מופרה 12. למרות OLCs יישאר מסוגל לתפקד פרוטוקול המשמש ליצירת OLCs אלה ייתכן שעדיין יש שירות כassay ללמוד היווצרות וההתפתחות של תאי הנבט בשלבים מוקדמים יותר בתוך מערכת סגורה במבחנה. הפרסום המקורי שדן בהיווצרות של OLCs מכךתאי גזע matic מנוצלים עור עוברי חזירי כמקור תאי גזע 8. הרחבת על מחקר שהתאים דמויי PGC נוצרו מוקדם במהלך התמיינות מושרה הוצגו להיות מבשרי לסמנים כאלה PGC מפורש OLCs וכOct4, ושה, סטלה, C-KIT, וDAZL 13. נתונים אלו תומך בפוטנציאל של ניצול מערכת זו כדי ללמוד היווצרות חיידק והתמיינות של תאים במבחנה. הפרוטוקול מנוצל כדי ליצור OLCs מעור עכבר יילוד יהיה הפגין במאמר זה וידאו. פרוטוקול זה מציע במודל חוץ גופית ללמוד פיתוח תא חיידק שעשוי לספק אמצעי על מנת להבהיר גורמים חשובים להתפשטות וההתמיינות שלהם.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12500</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0266</td><td></td></tr><tr><td>ITS</td><td>Invitrogen</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Fetuin</td><td>Sigma</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sioux Biochemicals</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>LH</td><td>Sioux Biochemicals</td><td>925</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Invitrogen</td><td>31100-035</td><td></td></tr><tr><td>24 צלחות</td><td>באר Nunc</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>10 ס"מ כלים</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות</td><td>BD</td><td>352095</td><td></td></tr></tbody></table>

התמיינות של תאי העור של עכבר יילוד נגזר גזע לתאים דמוי נבט<em&gt; במבחנה</em

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

לומד היווצרות תאי נבט ובידול באופן מסורתי היה קשה מאוד עקב מספרים סלולריים נמוכים ומיקומם העמוק בתוך עוברים מתפתחים. הזמינות של &quot;סגור&quot; במערכת מבוססת מבחנה יכולה להוכיח לא יסולא בפז להבנה של gametogenesis שלנו. היווצרות של ביצית דמויות תאים (OLCs) מתאי גזע סומטיים, שבודדו מעור עכבר יילוד, הודגמה ויכולה להיות דמיינו בפרוטוקול בסרטון זה. את OLCs כתוצאה להביע סמנים שונים בקנה אחד עם ביציות כגון Oct4, ושה, Bmp15, וScp3. עם זאת, הם נשארים מסוגלים לעבור התבגרות או הפריה בשל אי השלמת המיוזה. פרוטוקול זה יספק מערכת שהיא שימושית לחקר היווצרות השלב מוקדם והתמיינות של תאי הנבט לתוך תאי מין בוגרים יותר. במהלך ההתמיינות מוקדמת במספר התאים המבטאים Oct4 (כמו תאי חיידק פוטנציאליים) מגיע ל ~ 5%, עם זאת בשלב זה Formation של OLCs נותר בלתי יעיל יחסית. הפרוטוקול הוא יחסית ישר קדימה אם כי יש לנקוט זהירות מיוחדת על מנת להבטיח את אוכלוסיית התאים בריאה ומתחיל במעבר מוקדם.

בתחילה את התאים לצרף לתחתית צלחת התרבות ונפרשו. ב42-72 שעות להתמיינות תאי Oct4 חיוביים קטנים מושעים להיוצר ולהתרבות (איור 1 א). זמן קצר לאחר ההדמיה של תאים אלה הרוב ייעלם והתאים המצורפים יהוו אגרגטים מושבה צפופים בתחתית התרבות. בעקבות כמה ימי אגרגטים אלה להתנתק ממשטח התרבות. בחלק מאגרגטים אלה ניתן לראות תאים גדולים (איור 1b ו1 ג&#39;). על ההדמיה ראשונית התאים יהיו ~ 35 מיקרומטר בקוטר. עם תרבות המשך את OLCs יגדל להגיע ~ 45 מיקרומטר בקוטר. אלה הם OL...

בשנים האחרונות להיווצרות של תאי הנבט המשתמשים בשיטות תרבות במבחנה הודגמה תוך שימוש בסוגים שונים של תאי גזע סומטיים. מאמר זה יציג חזותי התמיינות של תאי גזע שמקורם יילוד עכבר לתאים דמויי ביצית מוקדמות.

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא ליצור תאים דמוייוציט באמצעות תאי גזע סומטיים המופקים מעור. דבר זה מושג על ידי שימוש בתאי גזע לא מובחנים ונקיים המופקים מעור של עכבר ניו born. כשלב שני, תאי הגזע מופרדים (dissociated), מה שמעמיד אותם מוכנים לתהליך הבידול.בשלב הבא, תאי הגזע נזרעים במצע דיפרנציאציה מוגדר. כדי להשרות היווצרות של תאי נבט, מתקבלות תוצאות המראות ביטוי של סמנים ספציפיים לאוציט על בסיס semi-quantitative real-time PCR. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה הרבייתית.על ידי אספקת מערכת סגורה ללימוד תאי נבט, היווצרות והתפתחות eSight, יש להכין את כל המצעים הדרושים לפרוטוקול שעתיים עד שלוש שעות לפני השימוש ולהניחם עם פקק רפוי באינקובטור לתרביות תאים שבו יתבצע הניסוי. שני המצעים המשמשים כאן הם מצע לתאי גזע המורכב מ-D-M-A-M-F 12, בתוספת B 27 BFGF ו-EGF, ומצע לבידול תאי נבט המורכב מ-M1 99 בתוספת FSH LH B-S-A-I-T-S, סודיום פירובט, tuin ו-EGF לתאי גזע שבודדו מעכבר ניו born.גורי חולדה משמשים להבחנה של תאי נבט in vitro במעברים שתיים עד ארבע. מכיוון שיעילות ההיווצרות של תאים דמויי ציט (cyte like cells) או OLC קשורה ישירות לאיכות תאי הגזע ההתחלתיים, מומלץ להתחיל את ההבחנה ברגע שהאוכלוסייה נראית נקייה ובריאה, בדרך כלל סביב מעבר 2. 48 שעות לפני תחילת ההבחנה, בצעו תתי-תרבית לתאי הגזע באמצעות פיפט סרולוגי; הסירו את כל מקבצי התאים הכדוריים התלויים ואת המצע המשומש מצלחת התרבית והעבירו אותם למבחנה בנפח 15 מיליליטר. חשוב לאסוף רק את מקבצי התאים הכדוריים התלויים ולא את התאים המודבקים לתחתית הצלחת שעוברים הבחנה ספונטנית.שקעו את התאים ב-500 $\times$g למשך חמש דקות, השליכו את העילוי והשעיקו שוב את התאים ב-500 µL של מצע תרבית תאי גזע טרי. חממו ל-37 °C. העבירו את האגרגטים בעדינות באמצעות פ pipette כדי לפרק חלקית את התאים.אין להעביר את התאים בפיפט בצורה אגרסיבית, שכן הדבר יפחית את חיוניות התאים. יש לשטוף את התאים שהופרדו חלקית ב-9.5 milliliters של מצע תרבית תאי גזע טרי ומחומם מראש, בתוך צלחת תרבית תאים של 10 centimeter בעלת היצמדות נמוכה. החזירו את התאים לאינקובטור תרביות תאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5%CO2 למשך 48 שעות.כדי להתחיל את הליך הדיפרנציאציה של OLC, השתמשו בפיפט סרולוגי כדי להוציא את תאי הגזע מבתרבית ולהעבירם למבחנה של 15 milliliter. השאירו מאחור תאים שנדבקו למצע. השקיעו את התאים ב-500 ×g למשך חמש דקות, השליכו את הנוזל העליון ותלו את התאים מחדש ב-500 µL של PBS סטרילי; בצעו פיפטינג נמרץ של התאים באמצעות טיפ של 1000 µL בעל פיה רחבה כדי ליצור גושים שאינם עולים על 10 עד 20 תאים.להצלחת פרוטוקול זה, קריטי לבדוק באופן קבוע את רמת הדיסוציאציה כדי להבטיח שהושגה הרמה הנכונה במהלך התהליך. הסירו מדי פעם כמות קטנה של תאים ובדקו תחת מיקרוסקופ באור לבן כדי לוודא שהתאים המצומצמים נמצאים בצברים של 10 עד 20 תאים בודדים. הימנעו מדיסוציאציה מופרזת של התאים, שכן הדבר יוביל לירידה בחיוניות התאים.בשלב הבא, הוסיפו 9.5 milliliters של PBS לתאים המופרדים והעבירו 15 microliters של ת сусפנזיה של התאים להמוסייטומטר (hemo cytometer) לצורך ספירת תאים. שקיעו את התאים ב-500 times G למשך חמש דקות. לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), השעיקו מחדש את התאים במדיום בידול לריכוז של 1.32 times 10⁶ תאים למילליליטר.פרוס את התאים על ידי הוספת 500 µL לכל באר בתוך צלחת תרבית לתאים עם 24 באערים בעלת תחתית שטוחה לתאי התהייה. הכנס את צלחת 24 הבאערים לאינקובטור לתרביות תאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 למשך 48 שעות. לאחר 48 שעות, הוצא 250 µL של מצע מכל באר והעבר למבחנה מסומנת תואמת בנפח 1.5 mL.הוסיפו 250 µL של מצע הפרדה טרי לכל באר, סנטריפוגו את המצע המשומש ב-500 ×g למשך חמש דקות, השליכו את העילוי ותלו את התאים ששקעו ב-50 µL של מצע הפרדה טרי. החזירו את תרחיף התאים לבאר התרבית המתאימה בלוח ההפרדה. בכל 48 שעות עד ליום ה-12 של ההפרדה, החליפו חצי מכמות המצע באותו אופן.במהלך שלבי הבידול המוקדמים, התאים ייצמדו לתחתית כלי התרבית ויתפשטו. תמונה מייצגת זו מראה תאים בטווח של 42 עד 72 שעות לאחר תחילת הבידול, החיוביים ל-OCT four. סמן לתאי גזע לא מובדלים מסומן בירוק, והגרעינים נצבעו ב-hirst ומסומנים בכחול.ככל שהדיפרנציאציה מתקדמת, ניתן יהיה לראות חלק ממצברי התאים עם תאים חיוביים ל-OCT four המסומנים בירוק, המוקפים בתאים שליליים ל-OCT four. סרגל המقياس בתמונה זו הוא 100 microns. איור זה מציג תמונת אור לבן של מבנה דמוי זקיק לאחר ניתוק ממשטח התרבית, סרגל המقياس מייצג 40 microns.עם המשך הטיפוח, ה-LCS יגדלו עד שיגיעו לקוטר של כ-45 microns. סרגל המقياس בתמונה זו מייצג 10 microns. ניתן לראות תאי lcs גדולים חיוביים ל-OCT four, כאשר הם מוקפים בתאים או נמצאים כיחידים בתוך התרבית.ניתן לאסוף LCS אלו עם תאי תמיכה או באמצעות טריפסינציה כדי לקבל LCS ללא תאים אחרים צמודים אליהם. כדי לאשר שה-LCS ביטאו טרנסקריפטים דומים לאלו של אתרים טבעיים, נאספו ה-LCS ונבדקה בהם הביטוי של סממני OO site נפוצים כגון Z-P-C-S-C-P three CMOs, T four BMP 15, ו-vasa. איור זה מציג את רמות הטרנסקריפטים של סממנים אלו ב-10 lcs ביחס ל-10 newborn mouse cytes.התוצאות מראות כי תאי ה-LCS מביעים פחות ZPC מאשר תאי cytes. מכיוון ש-ZPC הוא מרכיב של מבנה ממברנת ה-zop lucidum הספציפי ל-CYTE, הדבר עשוי להסביר את טבעם השביר ואת ממברנת ה-zita הדקה יותר של תאי lcs. הביטוי של SCP three המיוזי גבוה יותר ב-LCS בהשוואה לתאי cytes טבעיים.עם זאת, סמן מייוזה שונה, CMOs, מובע ברמה נמוכה יותר. פער זה ברמות הביטוי עשוי להסביר באופן חלקי את הכישלון הנוכחי של LCS להשלים את המייוזה. סמנים אחרים, כגון BMP 15 ו-vasa, אינם שונים באופן משמעותי בין אתרי lcs ואתרי O.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי בריאותן של תאי הגזע ההתחלתיים היא קריטית להצלחתה.

differentiation-newborn-mouse-skin-derived-stem-cells-into-germ-like

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

היכולת של תאים עובריים נבטי להתמיין לתאי נבטי קדמוני בשלבי הפיתוח המוקדמים הוא מודל מושלם לכתובת ההשערה שלנו לגבי סרטן פוריות. פרוטוקול זה מראה כיצד לבודד תאים נבטי קדמוני של בלוטות המין המתפתחות 10.5-11.5 ימים coitum עוברים לפרסם העכבר.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת תאי אב עצביים (NPCs) במבחנה מתאי גזע עובריים של עכברים (mESCs). mESCs מתורבתים בתרחיף ליצירת גופים עובריים (EBs), אשר מונחים לאחר מכן להתמיין NPCs באמצעות טיפול בחומצה רטינואית בתרבית דבקה.

טכניקה ליצירת תאי אב עצביים מתאי גזע עובריים של עכברים

אנו מתארים את הנתיחה וvivo התרבות לשעבר של עור העוברי של עכבר. מערכת התרבות שומרת על ממשק אוויר נוזלי על פני השטח של הרקמות ומאפשרת הדמיה במיקרוסקופ הפוכה. Melanoblasts, רכיב של העור מתפתח, שכותרתו fluorescently המאפשרת את התנהגותם כדי להיות שנצפתה באמצעות מיקרוסקופ confocal.

אקס תרבות Vivo של עור העכבר עוברי וLive-הדמיה של הגירת Melanoblast

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את השיטה ליצירת אבות עצביים מתאי גזע עובריים בשיטה חד-שכבתית נטולת סרום. ניתן להשתמש באבות אלה כדי לגזור סוגי תאים עצביים בוגרים או לחקור את תהליך המפרט העצבי והם ניתנים לקנה מידה של פורמט מרובה בארות עבור סינון מורכב.

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

אפידרמיס keratinocytes טופס מחסום עור פונקציונלי ממוקמים בקו הקדמי של ההגנה המארחת נגד עלבונות סביבתיים חיצוניים. כאן אנו מתארים שיטות לבידוד ואת התרבות העיקרית של keratinocytes אפידרמיס עור ניאונטלי ומבוגר העכבר, אינדוקציה של בידול מסוף ותגובה דלקתית מופעלת UVB מ keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

מאמר זה מתאר פרוטוקול ביעילות להפיק, תרבות pluripotent שורות תאי גזע מעוברים עכבר בשלב הבלסטוציסט.

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת interneuron קורטיקלית אבות ו מבשרי פוסט-mitotic interneuron של תאי גזע עובריים בעכבר בשיטה שונה embryoid גוף-כדי-טפט. אלה אבות/מבשרי יכולים להיות בשימוש במבחנה או fluorescently מיון מושתלים לתוך קליפת neonatal ללמוד קביעת גורל, או שימוש ביישומים טיפולית.

התמיינות של תאי גזע עובריים בעכבר לתוך Interneuron קורטיקלית מבשרי

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד keratinocytes עוריות מן העור העורבי של עכברים מבוגרים עבור מגוון של יישומים במורד הזרם כגון ביולוגיה מולקולרית, ביוכימיה, מיון תא מופעל פלואורסצנטית, ו העיקרי בשימוש בלתי מתורבת (למשל, clonogenic keratinocytes).

בידוד של העכבר Keratinocytes באפידרמיס ושלהם בתרבות הclonogenic של מבחנה

כאן, הקמנו שיטה זולה וקלה לתפעול המכוונת בידול מהיר ויעיל מתאי גזע עובריים לנוירונים. שיטה זו מתאימה לפופולאריזציה בקרב מעבדות ויכולה להיות כלי שימושי למחקר נוירולוגי.

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

אנו מתארים את ההליך של הבחנה במבחנה של תאי גזע עובריים עכבר לתאים עצביים באמצעות שיטת טיפה תלויה. יתר על כן, אנו מבצעים ניתוח פנוטיפי מקיף באמצעות RT-qPCR, אימונופלואורסצנטיות, RNA-seq, וציטומטריית זרימה.

בידול ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר

דו"ח זה מתאר פרוטוקול לבידוד בו זמנית של preadipocytes חום ולבן ראשוני מעכברים שזה עתה נולדו. תאים מבודדים ניתן לגדל בתרבות המושרה להבדיל לתוך adipocytes לבן וחום בוגר לחלוטין. השיטה מאפשרת אפיון גנטי, מולקולרי ותפקודי של תאי שומן ראשוניים בתרבות.

בידוד ובידול של Preadipocytes לבן וחום ראשוני מעכברים שזה עתה נולדו

למדו שיטה ליצירת תאים דמויי ביציות מתאי גזע עוריים של עכברים יילודים. השיטה כוללת בידוד, פירוק וגידול במדיום מוגדר ליצירת תאי רבייה, עם אימות באמצעות PCR זמן אמת.

התמיינות של תאי העור של עכבר יילוד נגזר גזע לתאים דמוי נבט

גלה סרטונים נוספים