התמיינות של תאי העור של עכבר יילוד נגזר גזע לתאים דמוי נבט

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא ליצור תאים דמוייוציט באמצעות תאי גזע סומטיים המופקים מעור. דבר זה מושג על ידי שימוש בתאי גזע לא מובחנים ונקיים המופקים מעור של עכבר ניו born. כשלב שני, תאי הגזע מופרדים (dissociated), מה שמעמיד אותם מוכנים לתהליך הבידול.

בשלב הבא, תאי הגזע נזרעים במצע דיפרנציאציה מוגדר. כדי להשרות היווצרות של תאי נבט, מתקבלות תוצאות המראות ביטוי של סמנים ספציפיים לאוציט על בסיס semi-quantitative real-time PCR. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה הרבייתית.

על ידי אספקת מערכת סגורה ללימוד תאי נבט, היווצרות והתפתחות eSight, יש להכין את כל המצעים הדרושים לפרוטוקול שעתיים עד שלוש שעות לפני השימוש ולהניחם עם פקק רפוי באינקובטור לתרביות תאים שבו יתבצע הניסוי. שני המצעים המשמשים כאן הם מצע לתאי גזע המורכב מ-D-M-A-M-F 12, בתוספת B 27 BFGF ו-EGF, ומצע לבידול תאי נבט המורכב מ-M1 99 בתוספת FSH LH B-S-A-I-T-S, סודיום פירובט, tuin ו-EGF לתאי גזע שבודדו מעכבר ניו born.

גורי חולדה משמשים להבחנה של תאי נבט in vitro במעברים שתיים עד ארבע. מכיוון שיעילות ההיווצרות של תאים דמויי ציט (cyte like cells) או OLC קשורה ישירות לאיכות תאי הגזע ההתחלתיים, מומלץ להתחיל את ההבחנה ברגע שהאוכלוסייה נראית נקייה ובריאה, בדרך כלל סביב מעבר 2. 48 שעות לפני תחילת ההבחנה, בצעו תתי-תרבית לתאי הגזע באמצעות פיפט סרולוגי; הסירו את כל מקבצי התאים הכדוריים התלויים ואת המצע המשומש מצלחת התרבית והעבירו אותם למבחנה בנפח 15 מיליליטר. חשוב לאסוף רק את מקבצי התאים הכדוריים התלויים ולא את התאים המודבקים לתחתית הצלחת שעוברים הבחנה ספונטנית.

שקעו את התאים ב-500 $\times$g למשך חמש דקות, השליכו את העילוי והשעיקו שוב את התאים ב-500 µL של מצע תרבית תאי גזע טרי. חממו ל-37 °C. העבירו את האגרגטים בעדינות באמצעות פ pipette כדי לפרק חלקית את התאים.

אין להעביר את התאים בפיפט בצורה אגרסיבית, שכן הדבר יפחית את חיוניות התאים. יש לשטוף את התאים שהופרדו חלקית ב-9.5 milliliters של מצע תרבית תאי גזע טרי ומחומם מראש, בתוך צלחת תרבית תאים של 10 centimeter בעלת היצמדות נמוכה. החזירו את התאים לאינקובטור תרביות תאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5%CO2 למשך 48 שעות.

כדי להתחיל את הליך הדיפרנציאציה של OLC, השתמשו בפיפט סרולוגי כדי להוציא את תאי הגזע מבתרבית ולהעבירם למבחנה של 15 milliliter. השאירו מאחור תאים שנדבקו למצע. השקיעו את התאים ב-500 ×g למשך חמש דקות, השליכו את הנוזל העליון ותלו את התאים מחדש ב-500 µL של PBS סטרילי; בצעו פיפטינג נמרץ של התאים באמצעות טיפ של 1000 µL בעל פיה רחבה כדי ליצור גושים שאינם עולים על 10 עד 20 תאים.

להצלחת פרוטוקול זה, קריטי לבדוק באופן קבוע את רמת הדיסוציאציה כדי להבטיח שהושגה הרמה הנכונה במהלך התהליך. הסירו מדי פעם כמות קטנה של תאים ובדקו תחת מיקרוסקופ באור לבן כדי לוודא שהתאים המצומצמים נמצאים בצברים של 10 עד 20 תאים בודדים. הימנעו מדיסוציאציה מופרזת של התאים, שכן הדבר יוביל לירידה בחיוניות התאים.

בשלב הבא, הוסיפו 9.5 milliliters של PBS לתאים המופרדים והעבירו 15 microliters של ת сусפנזיה של התאים להמוסייטומטר (hemo cytometer) לצורך ספירת תאים. שקיעו את התאים ב-500 times G למשך חמש דקות. לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), השעיקו מחדש את התאים במדיום בידול לריכוז של 1.32 times 10⁶ תאים למילליליטר.

פרוס את התאים על ידי הוספת 500 µL לכל באר בתוך צלחת תרבית לתאים עם 24 באערים בעלת תחתית שטוחה לתאי התהייה. הכנס את צלחת 24 הבאערים לאינקובטור לתרביות תאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 למשך 48 שעות. לאחר 48 שעות, הוצא 250 µL של מצע מכל באר והעבר למבחנה מסומנת תואמת בנפח 1.5 mL.

הוסיפו 250 µL של מצע הפרדה טרי לכל באר, סנטריפוגו את המצע המשומש ב-500 ×g למשך חמש דקות, השליכו את העילוי ותלו את התאים ששקעו ב-50 µL של מצע הפרדה טרי. החזירו את תרחיף התאים לבאר התרבית המתאימה בלוח ההפרדה. בכל 48 שעות עד ליום ה-12 של ההפרדה, החליפו חצי מכמות המצע באותו אופן.

במהלך שלבי הבידול המוקדמים, התאים ייצמדו לתחתית כלי התרבית ויתפשטו. תמונה מייצגת זו מראה תאים בטווח של 42 עד 72 שעות לאחר תחילת הבידול, החיוביים ל-OCT four. סמן לתאי גזע לא מובדלים מסומן בירוק, והגרעינים נצבעו ב-hirst ומסומנים בכחול.

ככל שהדיפרנציאציה מתקדמת, ניתן יהיה לראות חלק ממצברי התאים עם תאים חיוביים ל-OCT four המסומנים בירוק, המוקפים בתאים שליליים ל-OCT four. סרגל המقياس בתמונה זו הוא 100 microns. איור זה מציג תמונת אור לבן של מבנה דמוי זקיק לאחר ניתוק ממשטח התרבית, סרגל המقياس מייצג 40 microns.

עם המשך הטיפוח, ה-LCS יגדלו עד שיגיעו לקוטר של כ-45 microns. סרגל המقياس בתמונה זו מייצג 10 microns. ניתן לראות תאי lcs גדולים חיוביים ל-OCT four, כאשר הם מוקפים בתאים או נמצאים כיחידים בתוך התרבית.

ניתן לאסוף LCS אלו עם תאי תמיכה או באמצעות טריפסינציה כדי לקבל LCS ללא תאים אחרים צמודים אליהם. כדי לאשר שה-LCS ביטאו טרנסקריפטים דומים לאלו של אתרים טבעיים, נאספו ה-LCS ונבדקה בהם הביטוי של סממני OO site נפוצים כגון Z-P-C-S-C-P three CMOs, T four BMP 15, ו-vasa. איור זה מציג את רמות הטרנסקריפטים של סממנים אלו ב-10 lcs ביחס ל-10 newborn mouse cytes.

התוצאות מראות כי תאי ה-LCS מביעים פחות ZPC מאשר תאי cytes. מכיוון ש-ZPC הוא מרכיב של מבנה ממברנת ה-zop lucidum הספציפי ל-CYTE, הדבר עשוי להסביר את טבעם השביר ואת ממברנת ה-zita הדקה יותר של תאי lcs. הביטוי של SCP three המיוזי גבוה יותר ב-LCS בהשוואה לתאי cytes טבעיים.

עם זאת, סמן מייוזה שונה, CMOs, מובע ברמה נמוכה יותר. פער זה ברמות הביטוי עשוי להסביר באופן חלקי את הכישלון הנוכחי של LCS להשלים את המייוזה. סמנים אחרים, כגון BMP 15 ו-vasa, אינם שונים באופן משמעותי בין אתרי lcs ואתרי O.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי בריאותן של תאי הגזע ההתחלתיים היא קריטית להצלחתה.