Name: מטבולית תיוג של אוצין עשיר חזור קינאזות 1 ו -2 עם רדיואקטיבי פוספט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: חקור מתיוג מטבולי של קינאזות LRRK1 ו-LRRK2 באמצעות פוספט רדיואקטיבי. שיטה זו מאפשרת כימות רמות הפוספורילציה התאית הכוללת של חלבונים אלה, אפילו ללא נוגדנים ספציפיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים גם למייקל ג&#39;יי פוקס קרן תמיכה במחקר זה. אנו מודים לקרן המחקר - פלנדריה FWO (פרויקט FWO G.0666.09, מלגת חוקר בכירה לJMT), Neuro-TARGET פרויקט IWT SBO/80020, לובן KU (OT/08/052A וIOF-KP/07 / 001) על תמיכתם. מחקר זה נתמך גם בחלקו על ידי קרן Druwé-Eerdekens מנוהל על ידי קרן המלך בודואן לJMT.

<ol><li>Hanafusa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucine-rich+repeat+kinase+LRRK1+regulates+endosomal+trafficking+of+the+EGF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor.</a> Nat Commun. 2, 158(2011).</li>
<li>Titz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proximal+signaling+network+of+the+BCR-ABL1+oncogene+shows+a+modular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization.</a> Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).</li>
<li>Cookson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+leucine-rich+repeat+kinase+2+%28LRRK2%29+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease.</a> Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).</li>
<li>Taymans, J. M., Cookson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+dominant+parkinsonism%3B+the+toxic+triangle+of+LRRK2%2C+alpha-synuclein+and+tau%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau.</a> Bioessays. 32, 227-235 (2010).</li>
<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+ROCO+proteins+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The function of ROCO proteins in health and disease.</a> Biol Cell. 101, 183-191 (2009).</li>
<li>Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Roco+protein+family%3A+a+functional+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The Roco protein family: a functional perspective.</a> FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).</li>
<li>Marin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson+disease+gene+LRRK2%3A+evolutionary+and+structural+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Biol.Evol%22%5BJournal%5D)">The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights.</a> Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).</li>
<li>Marin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+origin+of+the+Parkinson+disease+gene+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Evol%22%5BJournal%5D)">Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2.</a> J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).</li>
<li>Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+LRRK2%3A+from+kinase+to+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate.</a> Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).</li>
<li>Gloeckner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphopeptide+Analysis+Reveals+Two+Discrete+Clusters+of+Phosphorylation+in+the+N-Terminus+and+the+Roc+Domain+of+the+Parkinson-Disease+Associated+Protein+Kinase+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2.</a> J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((14-3-3+binding+to+LRRK2+is+disrupted+by+multiple+Parkinson%27s+disease-associated+mutations+and+regulates+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430, 393-404 (2010).</li>
<li>Greggio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+LRRK2%2Fdardarin+associated+with+Parkinson+disease+are+more+toxic+than+equivalent+mutations+in+the+homologous+kinase+LRRK1%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurochem%22%5BJournal%5D)">Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1.</a> J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).</li>
<li>Taymans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+Kinase+Activity+Is+Dependent+on+LRRK2+GTP+Binding+Capacity+but+Independent+of+LRRK2+GTP+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding.</a> PLoS One. 6, 23207-23 (2011).</li>
<li>Daniëls, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+mode+of+action+of+the+LRRK2+Y1699C+pathogenic+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant.</a> J Neurochem. 116, 304-315 (2011).</li>
<li>Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+highly+purified+leucine-rich+repeat+kinases+1+and+2+demonstrates+formation+of+homodimers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers.</a> PLoS One. 7, e43472(2012).</li>
<li>Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+PINK1+and+LRRK2+in+rat+and+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurochem%22%5BJournal%5D)">Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain.</a> J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).</li>
<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+the+kinase+activity+of+LRRK2+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Lobbestael, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+detection+of+transgene+expression+in+the+brain+using+small+epitope+tags%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags.</a> BMC Biotechnol. 10, 16(2010).</li>
<li>Davies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Characterization+and+Optimization+of+Leucine+Rich+Repeat+Kinase+2+%28LRRK2%29+Monoclonal+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies.</a> Biochem J. , (2013).</li>
<li>West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease-associated+mutations+in+LRRK2+link+enhanced+GTP-binding+and+kinase+activities+to+neuronal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.Mol.Genet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity.</a> Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).</li>
<li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Sci Transl Med. 4, 164ra161(2012).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-dependent+14-3-3+binding+to+LRRK2+is+impaired+by+common+mutations+of+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease.</a> PLoS One. 6, e17153(2011).</li>
<li>Dzamko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+LRRK2+kinase+activity+leads+to+dephosphorylation+of+Ser%28910%29%2FSer%28935%29%2C+disruption+of+14-3-3+binding+and+altered+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).</li>
</ol>

יש מחברים אין לחשוף.

מאמר זה מספק פרוטוקול בסיסי למנסה לאמוד רמת זירחון הכללית של LRRK1 וLRRK2 בשורות תאים באמצעות תיוג חילוף חומרים עם 32 P-orthophosphate. האסטרטגיה הכוללת היא פשוטה. זיקה מתויגת חלבוני LRRK באים לידי ביטוי בתאי HEK293T החשופים למדיום המכיל 32 P-orthophosphate. 32 P-orthophosphate נטמע על ידי התאים רק לאחר כמה שעות של דגירה וכל המולקולות בתא המכיל פוספטים מסומנים ובכך רדיואקטיבית. תג הזיקה (3xflag) לאחר מכן נעשה שימוש כדי לבודד את חלבוני LRRK ממרכיבים...

<html> קינאזות אוצין העשיר החוזרת 1 ו -2 (LRRK1 וLRRK2) הם paralogs multidomain אשר חולק ארגון תחום דומה. שני החלבונים לקודד רצף GTPase דומה למשפחת ראס של GTPases (ראס של חלבונים מורכבים, או ROC), כמו גם בטרמינל C-של תחום ROC (COR), ביעילות סיווג שני החלבונים למשפחת חלבוני Roco 5,6. N-מסוף של טנדם תחום ROC-COR, שני החלבונים לקודד תחום חוזר לאוצין עשיר, כמו גם תחום כמו ankyrin-, בעוד שרק LRRK2 מקודד ארמדיל נוסף domein 6-8. בטרמינל C-של ROC-COR, שני החלבונים לשתף תחום קינאז סרין-תראונין בעוד שרק LRRK2 מקודד תחום WD40 באזור טרמינל C-8. התפקידים הסלולריים המדויקים של LRRK1 וLRRK2 עדיין לא הובהר, עם זאת LRRK1 היה מעורב בקולטן טירוזין קינאז איתות 1,2, בעוד נקודות ראיות גנטיות לתפקיד לLRRK2 בפתוגנזה של מחלת פרקינסון 3,4. class = &quot;jove_content&quot;&gt; זירחון של חלבונים הוא מנגנון רגולציה משותף בתאים. לדוגמא, זרחון יכול להיות חיוני להפעלה של אנזימים או לגיוס של חלבונים מורכבים איתות. זירחון הסלולרי של LRRK2 התאפיין בהרחבה ומיפוי phosphosite הראה רוב אתרי זירחון הסלולרי להתרחש באשכול בין חוזר ankyrin ותחומים חוזרים עשירים לאוצין 9-11. למרות שאתרי זירחון הסלולרי LRRK1 עדיין לא ממופים, ראיות ממחקרים באמצעות מכתים phosphoprotein של כתמי חלבון LRRK1 immunoprecipitated של מתאי COS7 מצביעות על כך שחלבון LRRK1 פוספורילציה בתאים 12. מאמר זה מספק פרוטוקול בסיסי למנסה לאמוד רמת זירחון הכללית של LRRK1 וLRRK2 בשורות תאים באמצעות תיוג חילוף חומרים עם 32 P-orthophosphate. האסטרטגיה הכוללת היא פשוטה. זיקה מתויגת הגנה של מחזור LRRKתוספות באות לידי ביטוי בתאי HEK293T החשופים למדיום המכיל 32 P-orthophosphate. 32 P-orthophosphate נטמע על ידי התאים רק לאחר כמה שעות של דגירה וכל המולקולות בתא המכיל פוספטים מסומנים ובכך רדיואקטיבית. תג הזיקה (3xflag) לאחר מכן נעשה שימוש כדי לבודד את חלבוני LRRK ממרכיבים תאיים אחרים על ידי immunoprecipitation. Immunoprecipitates אז מופרדים באמצעות SDS-PAGE, מחק לממברנות PVDF וניתוח של פוספטים המשולבים מתבצע על ידי autoradiography (אות 32 P) וזיהוי מערבי (אות חלבון) של החלבונים בכתמים.

<table><tbody><tr><td>זרחן-32 רדיונוקליד, 1 mCi, חוצץ דיסודיום-פוספט ב-1 מ"ל מים</td><td>פרקין אלמר</td><td>NEX011001MC</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s מדיום נשר שונה (D-MEM) (1X), נוזלי (גלוקוז גבוה)</td> <td>Invitrogen</td><td>11971-025</td><td>מדיום זה אינו מכיל פוספטים</td></tr><tr><td>Anti Flag M2 affiinty gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>למוצר שווה ערך עם ג'ל בצבע אדום (שימושי להמחשת החרוזים ביתר קלות), השתמש בחתול. מס' F2426.</td></tr><tr><td>פילטר ספיגה עבה במיוחד</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S Solution</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td></td></tr></tbody></table>

מטבולית תיוג של אוצין עשיר חזור קינאזות 1 ו -2 עם רדיואקטיבי פוספט

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

קינאזות אוצין החוזרת עשיר 1 ו -2 (LRRK1 וLRRK2) הם paralogs אשר חולק ארגון תחום דומה, לרבות תחום קינאז סרין-תראונין, ראס של תחום חלבונים מורכב (ROC), C-מסוף של תחום ROC (COR), ולאוצין עשיר וחוזר כמו ankyrin-בN-הסופית. התפקידים הסלולריים המדויקים של LRRK1 וLRRK2 עדיין לא הובהר, עם זאת LRRK1 היה מעורב בקולטן טירוזין קינאז איתות 1,2, בעוד LRRK2 הוא מעורב בפתוגנזה של מחלת פרקינסון 3,4. בדו&quot;ח זה, אנו מציגים פרוטוקול לתייג חלבוני LRRK1 וLRRK2 בתאים עם 32 orthophosphate P, ובכך לספק אמצעים כדי למדוד את רמות זירחון הכוללות של 2 החלבונים האלה בתאים. בקיצור, זיקה מתויגת חלבוני LRRK באים לידי ביטוי בתאי HEK293T החשופים למדיום המכיל 32 P-orthophosphate. 32 P-orthophosphate נטמע על ידי התאים רק לאחר כמהשעות של דגירה וכל המולקולות בתא המכיל פוספטים מסומנות ובכך רדיואקטיבית. באמצעות תג הזיקה (3xflag) חלבוני LRRK מבודדים ממרכיבים תאיים אחרים על ידי immunoprecipitation. Immunoprecipitates אז מופרדים באמצעות SDS-PAGE, מחק לממברנות PVDF וניתוח של פוספטים המשולבים מתבצע על ידי autoradiography (אות 32 P) וזיהוי מערבי (אות חלבון) של החלבונים בכתמים. הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם כדי לפקח זירחון של כל חלבון אחר שיכול לבוא לידי ביטוי בתאים ומבודד על ידי immunoprecipitation.

<html> על מנת להשוות רמות זירחון הכוללות של LRRK1 וLRRK2 בתאים, 3xflag מתויג LRRK1 וLRRK2 בא לידי ביטוי בתאי HEK293T 15. תאים בתרבית 6 צלחות היטב ומסומן עם 32 P ונותחו כפי שתוארו לעיל בטקסט הפרוטוקול. איור 1 מציג תוצאות נציג לתיוג המטבולית של LRRK1 וLRRK2 בתאי HEK293T. התאגדות פוספט רדיואקטיבי הוא ציינה עבור שתי LRRK1 וLRRK2. על כימות של הרמות מנורמלות לרמות החלבון, כפי שנמדד על ידי ניתוח densitometric של immunodetection עם נוגדן אנטי דגל <sup...

קינאזות אוצין העשיר החוזרת 1 ו -2 (LRRK1 וLRRK2) הם חלבוני multidomain אשר לקודד שני GTPase ותחומים קינאז ואשר פוספורילציה בתאים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתייג LRRK1 וLRRK2 בתאים עם 32 orthophosphate P, ובכך לספק אמצעים כדי למדוד את רמות phophorylation הסלולרי הכוללות שלהם.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לתייג את החלבונים המעניינים בפוספטים רדיואקטיביים על מנת לכמת את החלבונים, רמות הזרחן התאי. זה מושג על ידי תרבית תאים בנוכחות זרחן 32 כדי לסמן רדיואקטיבית את שינויי הפוספט של חלבונים המתבטאים בתאים. כשלב שני, תאים מסומנים עוברים ליזה וליזטים מודגרים עם חרוזי זיקה לטיהור חיסוני של החלבונים שיש לנתח.דגימות הבאות של חלבונים מסומנים ומטוהרים מופעלות על סולפט התפלת נתרן דו, אלקטרופורזה של ג'ל פולי אקרילאמיד ומוכתמות לממברנות פלואוריד פולי אולאין. על מנת לזהות שילוב פוספט רדיואקטיבי ורמות חלבון, מתקבלות תוצאות המראות קינאזות חוזרות עשירות בלאוצין 1 ו-2, בקיצור L rrk 1 ו-L rrk 2 זרחנים בתאים לרמות דומות על סמך רדיוגרפיה אוטומטית וזיהוי חיסוני. יתרון עיקרי של טכניקת התיוג המטבולי בהשוואה לטכניקות אחרות כגון פוספו, ספיגה חיסונית, הוא שטכניקה זו מאפשרת קביעת רמות זרחון תאיות כוללות של חלבונים, כולל עבור חלבונים שעבורם אין נוגדנים לפוספו.היתרון העיקרי השני של טכניקה זו הוא שניתן לבצע השוואות כמותיות בין חלבונים שונים ברמות הזרחן התאיות הכוללות שלהם. מדגים את ההליך יהיה F gao, טכנאי מהמעבדה שלנו להתחיל בתרבית קווי תאי HEC 2 93 T בהתאם לתנאי תרבית סטנדרטיים בנשר, מדיום או DMM ששונו DCOS עם 8% עגל עוברי, סרום וגנטמיצין. הרחב את הצלחת והביע דגל משולש המתויג L rrk שנ

metabolic-labeling-leucine-rich-repeat-kinases-1-2-with-radioactive

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

קינאז leucine חזור ריץ' 2 הוא קינאז multidomain גדול, מוטציות שהן הגורם הגנטי השכיח ביותר של מחלת פרקינסון. ניתוח של פעילות קינאז של החלבון הזה הוכיחה להיות כלי חיוני בהבנת הביולוגיה תפקוד של חלבון זה. במאמר...

Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

13 C-איזוטופ תיוג היא טכניקה יעילה לקביעת מטבוליזם התא מרכזי בסוגים שונים של מיקרואורגניזמים. אחרי תאים בתרבית כבר עם מצע שכותרתו ספציפיים, GC-MS המדידה יכול לחשוף מסלולים מטבוליים פונקציונלי המבוסס על דפוסי תיוג ייחודי חומצות אמינו proteinogenic.

מסלול אישור דיסקברי מטבולית ודרך 13 C-תיוג של חומצות אמינו Proteinogenic

Phosphoinositides מאותת שומנים שיחסית שפע במהירות משתנה בתגובה לגירויים שונים. מאמר זה מתאר שיטה למדידת השפע של phosphoinositides ידי תאים מטבולית תיוג עם -inositol מיו 3 H-, ואחרי חילוץ וdeacylation. glycero-inositides חולץ אז מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים ולכמת ידי זרימת נצנץ.

Radiolabeling וכימות של רמות סלולריות של Phosphoinositides ידי נצנץ זרימה מצמיד כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים

אנו מתארים כאן שיטה לזיהוי זרחונים מרובים של חלבון לא מסודר באופן מהותי על ידי ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR), תוך שימוש בחלבון טאו כמקרה מבחן. טאו רקומביננטי מועשר איזוטופית ושונה במבחנה על ידי קינאז לפני איסוף הנתונים וניתוחם.

ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של Phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים

קינאזות חלבון מתפתחות מאוד אנזימים איתות פיגומים קריטיים עבור התמרה אות בין תאיים בין תאיים. אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות קינאז באמצעות שימוש ב- triposphate אדנוזין רדיולאבל ([γ- 32 P] ATP), שיטה אמינה לסיוע בהבהרת רגולציה של אותות סלולריים.

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

מבחני תחרות פפטיד נמצאים בשימוש נרחב במגוון של ניסויים מולקולריים וחיסונית. מאמר זה מתאר שיטה מפורטת עבור המבחנה oligopeptide- מתחרה assay קינאז ואת הליכי אימות הקשורים, אשר עשוי להיות שימושי כדי למצוא אתרי זרחן ספציפיים.

Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

המחקר הנוכחי מתאר שיטה פשוטה של גילוי רמות אנדוגני של זרחון Rab10 על ידי לאוצין-עשיר אני חוזר קינאז 2.

Rab10 זיהוי זרחון על-ידי פעילות LRRK2 באמצעות מרחביות-דף עם תג מחייב פוספט

אנו מאופיינים חלבון קינאז חדש באמצעות גישות ביוכימיים חזקים: ניתוח כתמי אבן מערבית עם נוגדן ספציפי ייעודי על קווי תאים שונים ורקמות, אינטראקציות על ידי ניסויים coimmunoprecipitation, הפעילות של קינאז שזוהו על ידי המערב כתם באמצעות נוגדן ספציפי פוספהו ועל ידי γ [32P] ATP תיוג.

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

פרוטוקול זה מתאר תסה לא רדיואקטיבית כדי למדוד פעילות קינאז של קינאז פולינוקלאוטיד (PNKs) על מצעי DNA ו RNA קטנים.

תרגום לא רדיואקטיבי למדוד פוספורילציה פולינוקלאוטיד של מצעי נוקלאוטיד קטנים

וידאו זה מציג טכניקות תיוג של אדם בתאי גזע עובריים ותאי גזע mesenchymal עם צבעי ניאון. טכניקה זו יכולה לשמש in vivo מעקב בתאי גזע המושתלים עם הדמיה אופטית עבור מתאמים histopathological עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

חקור מתיוג מטבולי של קינאזות LRRK1 ו-LRRK2 באמצעות פוספט רדיואקטיבי. שיטה זו מאפשרת כימות רמות הפוספורילציה התאית הכוללת של חלבונים אלה, אפילו ללא נוגדנים ספציפיים.

מטבולית תיוג של אוצין עשיר חזור קינאזות 1 ו -2 עם רדיואקטיבי פוספט

גלה סרטונים נוספים