ויזואליזציה של Craniofacial פיתוח בsox10: קאאד מהונדס דג הזברה הקו באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal
September 30th, 2013
ויזואליזציה של נתונים ניסיוניים הפכה מרכיב מרכזי בהצגת תוצאות לקהילה המדעית. דור של הקלטת הזמן לשגות חי של עוברים גובר תורם למצגת טובה יותר והבנה של תהליכים התפתחותיים מורכבים. פרוטוקול זה הוא מדריך צעד אחר צעד לתיוג תא באמצעות photoconversion חלבון קאאד של דג הזברה.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ליצור הקלטה חיה של נדידת תאי הפסגה העצבית על מנת להראות היווצרות של מבני פנים גולגולתיים מתפתחים. זה מושג על ידי הרכבה ראשונה של דג זברה טרנסגני SOX 10 KD מורדם באגרוז על מנת למזער את התנועה לאורך הניסוי. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, מתבצעת הפעלת צילום UV כדי להמיר KD מירוק לאדום בתאי פסגה עצבית.
לאחר מכן התמקדות בתאי הפסגה העצבית שהומרו בתמונה. זאק נוצר מהמבנה המתפתח לפני הקלטת סרטון זמן-lapse. מתקבלות תוצאות המראות התפתחות של תאי פסגה עצבית גולגולתית לחיך הראשוני של דג הזברה בעובר דג זברה SOX 10 KD טרנסגני.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הדמיה סטטית, הוא שניתן לדמיין בזמן אמת תהליכים התפתחותיים מורכבים כמו נדידת תאים. זה הופך את התוצאות לנגישות יותר לקהילה המדעית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית, כגון כיצד נוצרים מבנים שמקורם בתאי נוירו-קרסט, וכיצד גנים של PTO משפיעים על התפתחותם.
כדי להתכונן להרכבת עוברים, השתמש בבקבוק של 125 מיליליטר כדי לערבב E שלושה מים עם מיקרוגל אירוס עם נקודת התכה נמוכה כדי להמיס את התמיסה. לאחר מכן הוסיפו טריקה והניחו את הבקבוק באמבט מים של 50 מעלות צלזיוס כדי להתחמם ולקנן את הקשרים עוברי דגי זברה טרנסגניים סוין KD פלואורסצנטיים 60 שעות לאחר ההפריה. לאחר מכן העבירו כל אחד מהם לשקופית תא עם נייר טישו.
ספגו את עודפי המים E 3 ולאחר מכן השתמשו בתמיסת האגרו כדי לכסות את העובר. השתמש בקצה מעמיס מיקרו כדי למקם את העובר בצורה גבית מושלמת, ולהבטיח שהעוברים שקועים לחלוטין באגרו. לאחר הגדרת האגרו, השתמש ב-E שלוש 0.015% טריקה כדי למלא את שקופית החדר כדי לבצע המרת תמונות.
התחל בשימוש במטרת טבילה באוויר פי 20 להתמקדות בעובר. לאחר מכן לחץ על כפתור האור L 100 במיקרוסקופ ובחר ערוצים בתוכנה. פתח את הסמלים.
View פקדי רכישה הגדרות אחדות, ולחץ על כפתור ההגדרה הקונפוקלית. לאחר מכן, לחץ על אוטומטי ובחר DPI 4 88 ו-561.9 עבור ערוצים 1, 2, 3 בהתאמה לפני סגירת החלון שוב. לאחר מכן כבה את הערוצים הראשון והשלישי לפני לחיצה על כפתור הסרת הנעילה ולחיצה על כפתור הסריקה החל ממסגרת אחת לשנייה ו-HV 200.
התחילו להתמקד בתאים מעניינים. הגדלה הדרגתית של המסגרות לשנייה לאחת ל-32, והפחתת המתח ל-100 עד 120 בהתאם לרעשי הרקע. כאשר העובר נמצא בפוקוס, תפוס את השפה הירוקה בקצה הימני של המסך וכווץ אותה כך שתתאים לאזור להמרת תמונה לפני לחיצה ימנית עם העכבר.
שנה את הפריימים לשנייה לאחד ואת ה-HV ל-200 ולחץ על סריקה. תמונה מוגדלת של אזור המרת התמונות תהיה גלויה כעת. התמונה הבאה.
המר תאים על ידי הפעלת ערוץ ראשון לכל מקום בין חמש ל-60 שניות עד שאות ה-KD הירוק כמעט נעדר. לאחר מכן כבה את הערוץ המטופש. הפעל/י את הערוצים 2 ו-3 כדי לחזור להגדלה המקורית.
לחץ לחיצה ימנית על חלון הזום ובחר חזור לגודל המקורי כדי לבדוק אם התאים הרצויים הומרו כראוי. הגדר את גבולות ה-Zack על ידי בחירה בסמל Capture Z Series בשורת התפריטים. התאם את טבלאות בדיקת המידע או uts כדי להגדיר קיטועי זמן.
בחר את ממשק משתמש גרפי פשוט אחד תיבה וסמן את ההגדרות הבאות. אחד לכל 32 פריימים לשנייה. גודל 1024 וממוצע ארבע או שמונה x תלוי במספר ערימות Z שיש לקחת בלולאה אחת.
לאחר מכן, עבור אל הצג בקרות רכישה רכישת רצף ND והגדר את מסגרת הזמן. לאחר מכן לחץ על רציף ולאחר מכן על Zack. קבע את הגבולות כפי שהודגם קודם לכן.
התחל את הסרט, הוסף תמיסת E three 0.015% trica לתא, החלק לאורך כל היום ומלא את החדר לחלוטין להדמיה למשך הלילה. לאחר השלמת ההדמיה, צור וידאו באיכות גבוהה מקובץ ההדמיה על-ידי לחיצה על הצג הקרנה בעוצמה מרבית. לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על התמונה וצור מסמך חדש.
מחק מסגרות מיותרות והתאם את האותיות. בסרט זה המציג את Palato Genesis בדג הזברה, הקו הטרנסגני SOX 10 K משמש למעקב אחר תאי פסגה עצבית גולגולתית כשהם מתפתחים ליצירת החיך הראשוני. התאים הקדמיים ביותר של החך הנוצר מומרים מירוק לאדום 60 שעות לאחר ההפריה.
כאשר הטרבקולה הזוגית נפגשה ליצירת החך הראשוני, עוקבים אחר תאים אלה עד שהם מגיעים ליעדם הסופי. סרט זה מדגים התפתחות מופרעת של החך המובילה להיווצרות שסע אורו-פנים, בתיווך מורינו של כתם. קילוגרם אחד, גן המעורב בשסע פנים אלכסוני משמש כדוגמה.
ב-60 HPF המרת צילום חד צדדית של תאי הצלחת האתמואידית הקדמית ביותר מראה תפליט כשל בין תאי הצלחת האתמואידית החציונית לרוחב. פגם זה דומה לפתוגנזה של התפתחות שסע פנים אלכסוני בבני אדם שבו מתרחשת תפליט כשל בין תהליך האף הצדדי לבליטה מקסילרית. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית לחקור את התפתחות תאי הנוירו-קרסט בדג הזברה.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בשיטה זו כדי ללכוד את תהליך ההתפתחות המעניין שלך.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
פרוטוקול זה מתאר שיטה לויזואליזציה של הגירת תאי רכס עצבי בעוברי דגי זברה באמצעות הקלטות טיים-לפס בזמן אמת. על ידי שימוש בפוטוקונברסיה של חלבון ה-kaede, חוקרים יכולים להבין טוב יותר את התפתחות מבני הפנים הגולגולתיים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- ביולוגיה התפתחותית
- אמבריולוגיה
רקע
- ויזואליזציה של נתונים ניסיוניים היא חיונית לתקשורת מדעית.
- הקלטות טיים-לפס משפרות את ההבנה של תהליכים התפתחותיים מורכבים.
- מודלי דגי זברה טרנסגניים הם בעלי ערך לחקר הדינמיקה של תאי רכס עצבי.
- טכניקות פוטוקונברסיה מאפשרות מעקב מדויק אחר שינויים תאיים.
מטרת המחקר
- ליצור הקלטות טיים-לפס בזמן אמת של הגירת תאי רכס עצבי.
- להמחיש את היווצרות מבני הפנים הגולגולתיים בדגי זברה.
- להשתמש בפוטוקונברסיה לצורך ויזואליזציה משופרת של תהליכים תאיים.
שיטות בהן נעשה שימוש
- הרכבת דגי זברה טרנסגניים אנסתטיים SOX 10 KD בתוך אגרוז.
- ביצוע הפעלה פוטו אולטרה סגול להמרת חלבון ה-kaede מירוק לאדום.
- התמקדות בתאי רכס עצבי שעברו פוטוקונברסיה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.
- הקלטת סרטוני טיים-לפס ללכידת התפתחות מבני הגולגולת.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של הגירת תאי רכס עצבי בדגי זברה.
- המחשה של תאי רכס עצבי גולגולתיים המתפתחים לחיך הראשי.
- יצירת סרט טיים-לפס המציג את הדינמיקה התאית.
- תובנות לגבי התפקיד של SOX 10 בהתפתחות גולגולת-פנים.
מסקנות
- הפרוטוקול מדגים ביעילות את התנהגות תאי רכס עצבי in vivo.
- פוטוקונברסיה היא כלי רב עוצמה לחקר תהליכים התפתחותיים.
- הממצאים תורמים להבנת ההתפתחות הגולגולת-פנים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Visualizing cranial neural crest cell dynamics in zebrafish provides a predictive model for mechanistic de-risking in craniofacial target validation. The sox10:kaede transgenic system enables high-resolution temporal tracking of migration and differentiation events relevant to human facial morphogenesis. This approach supports early discovery by linking genetic perturbations to phenotypic outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by tracing cranial neural crest contributions to maxillary and mandibular elements.
- Operational Value: Enables precise lineage restriction via photoconvertible kaede reporter, reducing labeling ambiguity compared to dye injection.
- Predictive Value: Supports phenotypic screening of craniofacial mutants to assess target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative spatiotemporal data on cell migration and tissue convergence for assay standardization.
- Operational Value: Produces reproducible time-lapse outputs compatible with high-content imaging pipelines.
- Scalability: Adaptable to any kaede or photoconvertible reporter in transgenic zebrafish for platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Illustrates homology of zebrafish facial prominences to amniotes, enhancing translational relevance.
- Operational Value: Captures both normal and abnormal craniofacial development in mutants for phenotypic validation.
- Risk Mitigation: Enables observation of effusion defects modeling human orofacial cleft pathogenesis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing live imaging of neural crest-derived structures prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in cranial neural crest migration and palate formation.
- Screening: Delivers quantitative confocal readouts for assessing compound effects on cell dynamics.
- Analytics: Enables measurement of migration velocity, convergence timing, and tissue boundary formation.
- Translational Research: Connects zebrafish palate development to human craniofacial homologs for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for developmental phenotype assessment across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation through direct visualization of cell fate decisions.
- Operational Value: Standardizes photoactivation and time-lapse protocols for reproducible neural crest tracking.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking genetic targets to observable craniofacial phenotypes.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of targets based on developmental phenotype severity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, confocal microscopy, and photoconvertible protein handling.
- Dependent on UV-capable confocal systems and agarose embedding infrastructure for embryo immobilization.
- Necessitates standardization of photoactivation duration and z-stack acquisition across users.
- Adaptation considerations include varying promoter-driven reporters and developmental staging across zebrafish strains.
- Practical limitations include phototoxicity from prolonged UV exposure and embryo viability during extended imaging.
