ויזואליזציה של Craniofacial פיתוח בsox10: קאאד מהונדס דג הזברה הקו באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal
30 בספטמבר 2013
ויזואליזציה של נתונים ניסיוניים הפכה מרכיב מרכזי בהצגת תוצאות לקהילה המדעית. דור של הקלטת הזמן לשגות חי של עוברים גובר תורם למצגת טובה יותר והבנה של תהליכים התפתחותיים מורכבים. פרוטוקול זה הוא מדריך צעד אחר צעד לתיוג תא באמצעות photoconversion חלבון קאאד של דג הזברה.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להפיק הקלטת time lapse חיה של נדידת תאי רב-עצביים (neural crest cells) כדי להראות את ההיווצרות של מבנים קרניאלי-פציאליים בשלבי התפתחותם. זאת משיגים תחילה על ידי קיבוע של דג זבב (zebrafish) טרנסגני SOX 10 KD תחת הרדמה באגרוז, במטרה למזער את התנועה לאורך הניסוי. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, מבוצעת הפעלה פוטו-כימית ב-UV כדי להמיר את ה-KD מירוק לאדום בתאי הרב-עצביים.
לאחר מכן, התמקדו בתאי הרבב העצבי שהומרו לתמונה. נוצר Z-stack של המבנה המתפתח לפני הקלטת סרטון Time-lapse. התוצאות המתקבלות מראות את התפתחותם של תאי רבב עצבי גולגולתי לחך הראשוני של דג הזברה בעובר זברה טרנסגני SOX 10 KD.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דימות סטטי, הוא שניתן להמחיש תהליכי התפתחות מורכבים, כגון נדידת תאים, בזמן אמת. דבר זה הופך את התוצאות לנגישות יותר עבור הקהילה המדעית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית, כגון האופן שבו נוצרים מבנים המופקים מתאי רכס עצבי (neural crest), וכיצד גנים מסוג PTO משפיעים על התפתחותם.
להכנה של קיבוע עוברים, השתמשו בבקבוק נפח 125 milliliter כדי לערבב E three water עם low melting point aeros, וחממו במיקרוגל כדי להמיס את התמיסה. לאחר מכן, הוסיפו trica והניחו את הבקבוק במקלח מים בטמפרטורה של 50 degree Celsius כדי לשמור על חום, ובדקו את עוברי zebrafish טרנסגניים של soine KD פלואורסצנטיים חזק ב-60 שעות לאחר ההפריה. לאחר מכן, העבירו כל אחד מהם לשקף עם תאי בחינה באמצעות נייר ספיגה.
ספגו את עודפי מי E3 ולאחר מכן השתמשו בתמיסת agarro כדי לכסות את העובר. השתמשו בקצה של micro loader כדי למצב את העובר בצורה גבנית (dorsal) מושלמת, תוך הבטחה שהעוברים שקועים לחלוטין ב-agarro. לאחר שה-agarro נקבע, מלאו את שקופית התא ב-E3 0.015% trica כדי לבצע המרה פוטוכימית.
התחילו בשימוש בעדשה אובייקטיבית 20x עם טבילה באוויר כדי להתמקד בעובר. לאחר מכן, לחצו על כפתור התאורה L 100 במיקרוסקופ ובחרו את הערוצים בתוכנה. פתחו את הסמלים.
צפו בהגדרות בקרת הרכישה A one, ולחצו על כפתור הגדרת הקונפוקלי. לאחר מכן, לחצו על auto ובחרו DPI 4 88 ו-561.9 עבור ערוצים 1, 2, 3 בהתאמה, לפני סגירת החלון פעם נוספת. לאחר מכן, כבו את ערוצים אחת ושלוש לפני הלחיצה על כפתור remove interlock ולחיצה על כפתור scan, החל מ-one frame per second ו-HV 200.
התחילו להתמקד בתאים הרלוונטיים. הגדילו בהדרגה את מספר הפריימים לשנייה לאחד ל-32, והפחיתו את המתח ל-100 עד 120, בהתאם לרעש הרקע. כאשר העובר נמצא במיקוד, גררו את המסגרת הירוקה בקצה הימני של המסך והקטינו אותה כדי להתאים לאזור המיועד להמרה פוטוכימית, לפני לחיצה ימנית עם העכבר.
שנו את מספר הפריימים לשנייה ל-1 ואת ה-HV ל-200 ולחצו על scan. כעת תופיע תמונה מוגדלת של אזור המרת הפוטו. תמונה הבאה.
בצע המרה של התאים על ידי הפעלת ערוץ אחד למשך חמש עד 60 שניות, עד שסיגנל ה-KD הירוק כמעט ונעלם. לאחר מכן, כבה את הערוץ המעורר (dappy channel). הפעל את ערוצים שתיים ושלוש כדי לחזור לרמת הזום המקורית.
לחצו לחיצה ימנית על חלון הזום ובחרו ב-"return to original size" כדי לבדוק אם התאים הרצויים הומרו לתמונה באופן מספק. הגדירו את גבולות ה-Z-stack על ידי בחירה באייקון "Capture Z Series" בשורת התפריטים. התאימו את טבלאות הערכים (LUTs) כדי להגדיר צילום רצף זמנים (time lapse).
בחרו בתיבת ה-GUI הפשוטה A וסמנו את ההגדרות הבאות. אחת ל-32 פריימים לשנייה. גודל 1024 וממוצע של ארבעה או שמונה x, תלוי במספר ה-Z stacks שיש לצלם בלולאה אחת.
בשלב הבא, עברו לבקרת רכישת התצוגה (view acquisition controls), לרכישת רצף ND, והגדירו את מסגרת הזמן. לאחר מכן לחצו על continuous, ואז על Zack. הגדירו את הגבולות כפי שהודגם קודם לכן.
הפעילו את הסרט, הוסיפו לתא תמיססת E three 0.015%trica, החליקו לאורך היום ומלאו את התא לחלוטין לצורך דימוי למשך הלילה. עם סיום הדימוי, צרו סרטון באיכות גבוהה מקובץ הדימוי על ידי לחיצה על "הצג השחלה בעוצמה מרבית" (show maximum intensity projection). לאחר מכן, לחצו קליק ימני על התמונה וצרו מסמך חדש.
מחק פריימים מיותרים וכייל את ה-L uts. בסרטון זה, המציג את התפתחות החיך (Palato Genesis) בדגי zebrafish, נעשה שימוש בקו הטרנסגני SOX 10 K כדי לעקוב אחר תאי הרבמה העצבית הגולגולתית בעת התפתחותם ליצירת החיך הראשוני. התאים הקדמיים ביותר של החיך שנוצר עוברים המרה פוטו-כימית מירוק לאדום 60 שעות לאחר ההפריה.
כאשר הטרבקלות (trabecula) הזוגיות נפגשות ליצירת החיך הראשוני, עוקבים אחר תאים אלו עד שהם מגיעים ליעדם הסופי. סרטון זה מדגים פיתוח לקוי של החיך המוביל להיווצרות של שס אורופציאלי, כתוצאה מהשתקה (knockdown) של speck באמצעות morino. גן המעורב בשס פנים אלכסוני משמש כדוגמה.
ב-60 HPF, המרה פוטו-חד-צדדית של תאי לוח האתמואיד הקדמיים ביותר מראה כישלון בהפרשה בין תאי לוח האתמואיד המדיאליים ללטראליים. פגם זה דומה לפתוגנזה של התפתחות שס פנים אלכסוני בבני אדם, שבה מתרחש כישלון בהפרשה בין התהליך הנחרי הלטראלי לבליטה המקסילרית. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית לחקור את התפתחות תאי הרבב (neurocrest) בדגי zebrafish.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן השימוש בשיטה זו כדי לתעד את התהליך ההתפתחותי המעניין אתכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה להדמיה של נדידת תאי רבוב העצבים (neural crest) בעוברים של דגי זברה באמצעות הקלטות time-lapse של תאים חיים. באמצעות שימוש בהמרה פוטוכימית של חלבון ה-kaede, חוקרים יכולים להבין טוב יותר את התפתחות מבני הפנים הגולגולתיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- אמבריולוגיה
רקע
- ויזואליזציה של נתונים ניסויים היא קריטית לתקשורת מדעית.
- הקלטות Time-lapse משפרות את ההבנה של תהליכים התפתחותיים מורכבים.
- מודלים טראנסגניים של דגי זברה הם בעלי ערך לחקר דינמיקה של תאי רכס עצבי.
- טכניקות של פוטו-המרה (Photoconversion) מאפשרות מעקב מדויק אחר שינויים תאיים.
מטרת המחקר
- ליצירת הקלטות time-lapse של תאי רכס עצבי (neural crest cells) במיגרה בזמן אמת.
- להדגמת ההיווצרות של מבני פנים גולגולתיים בדגי zebrafish.
- לשימוש בפוטו-המרה (photoconversion) לצורך ויזואליזציה משופרת של תהליכים תאיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קיבוע דגי zebrafish טרנסגניים עם KD של SOX 10 תחת הרדמה באגרורוז.
- ביצוע הפעלת UV פוטו-כימית להמרת חלבון kaede מירוק לאדום.
- מיקוד בתאי רבוב עצבי (neural crest) שעברו המרה פוטו-כימית תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי.
- הקלטת סרטוני time-lapse לתיעוד התפתחותם של מבנים קרניאליים.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של נדידת תאי רב-עצביים (neural crest) בדגי zebrafish.
- הדגמה של תאי רב-עצביים קרניאליים המתפתחים לחך הראשוני.
- יצירת סרטון time-lapse המציג דינמיקה תאית.
- תובנות לגבי תפקידו של SOX 10 בהתפתחות פניו-גולגולתית.
מסקנות
- הפרוטוקול מדגים ביעילות את התנהגות תאי הרבב העצבי (neural crest cells) in vivo.
- המרה פוטונית (Photoconversion) היא כלי רב-עוצמה לחקר תהליכי התפתחות.
- הממצאים תורמים להבנת ההתפתחות הקראניו-פציאלית (התפתחות הגולגולת והפנים).
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הדמיה של דינמיקת תאי הרב גולגולת (neural crest) בדגי zebrafish מספקת מודל ניבוי להפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליך אישוש של מטרות קרניו-פציאליות. מערכת הטרנסגנית sox10:kaede מאפשרת מעקב זמני ברזולוציה גבוהה של אירועי נדידה ודיפרנציאציה הרלוונטיים למורפוגנזה פנימית אנושית. גישה זו תומכת בגילוי מוקדם על ידי קישור הפרעות גנטיות לתוצאות פנוטיפיות במערכת הרלוונטית למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות מעקב אחר תרומות של רבמות עצביות קרניאליות לאלמנטים של הלסת העליונה והתחתונה.
- ערך תפעולי: מאפשר הגבלה מדויקת של שושלת באמצעות רפורטר kaede בעל יכולת המרה פוטוכימית, ובכך מפחית עמימות בסימון בהשוואה להזרקת צבע.
- ערך ניבוי: תומך בסריקה פנוטיפית של מוטנטים קרניו-פציאליים להערכת מעורבות המטרה ושינויים במסלול.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים מרחביים-זמניים על נדידת תאים והתכנסות רקמות לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: מפיק פלטי time-lapse הניתנים לשחזור ותואמים לתהליכי דימוי בתוכן גבוה (high-content imaging).
- יכולת הרחבה: ניתן להתאמה לכל kaede או ר포רטר בעל יכולת המרה פוטו-כימית בדגי zebrafish טרנסגניים לצורך שימוש חוזר בפלטפורמה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: ממחיש את ההומולוגיה של הבליטות הפנים של דג הזברה לאמניוטות, ובכך מגביר את הרלוונטיות התרגומית.
- ערך תפעולי: מאפשר תיעוד של התפתחות קרניו-פציאלית תקינה ובלתי תקינה במוטנטים לצורך תיקוף פנוטיפי.
- הפחתת סיכונים: מאפשר תצפית על פגמי נזילה המדמים פתוגנזה של שס פה וחך אנושי.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת דימיון חי של מבנים ממקור רב-עצבי (neural crest) לפני סריקת תרכובות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי תפקוד גנים בנדידת תאי הרב רשת העצבית הגולגולתית וביצירת החך.
- סריקה: מספק תוצאות קוונטטטיביות של מיקרוסקופיה קונפוקלית להערכת השפעת תרכובות על דינמיקה של תאים.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של מהירות נדידה, תזמון התכנסות ויצירת גבולות רקמה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין התפתחות החך בדגי zebrafish לבין הומולוגים פנים-גולגולתיים אנושיים לצורך התאמת סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת דימות הניתנת לשימוש חוזר לצורך הערכת פנוטיפ התפתחותי על פני פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות באמצעות ויזואליזציה ישירה של החלטות גורל תאי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי פוטו-אקטיבציה וצילום במרווחי זמן (time-lapse) למעקב רב-שחזור אחר רבדי העצב (neural crest).
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך (go/no-go) על ידי קישור מטרות גנטיות לפנוטיפים קראניו-פציאליים נצפים.
- השפעה על תיק הפיתוח: מספק תובנות לתיעדוף מטרות מותאם סיכונים, בהתבסס על חומרת הפנוטיפ ההתפתחותי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באמבריולוגיה של דגי זבראפיש, מיקרוסקופיה קונפוקלית וטיפול בחלבונים בעלי יכולת המרה פוטוכימית.
- תלוי במערכות קונפוקליות המסוגלות להפיק קרינת UV ובתשתית להטמעה באגרוז לצורך קיבוע העוברי.
- מחייב סטנדרטיזציה של משך הפוטו-אקטיבציה ושל רכישת ה-z-stack בין המשתמשים השונים.
- שיקולי התאמה כוללים חלבונים רפורטרים שונים המונעים על ידי פרומוטורים שונים ושלבי התפתחות שוניים בין זני זבראפיש.
- מגבלות מעשיות כוללות פוטוטוקסיקוטיות כתוצאה מחשיפה ממושכת ל-UV ויכולת הישרדות של העוברים במהלך הדמיה ממושכת.
