Name: ויזואליזציה של Craniofacial פיתוח בsox10: קאאד מהונדס דג הזברה הקו באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: למדו לתעד נדידת תאי קרום העצב בדגי זברה תוך שימוש במיקרוסקופיית confocal וטכניקת photoconversion של חלבון kaede. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר התפתחות מבני הראש והפנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים רוברט Kelsh לחביבות שיתוף מגיב אמרגן sox10 דג הזברה.

1. אוסף עובר לphotoconversion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר לפחות עשרה זוגות של sox10: דג הזברה מהונדס קאאד בין 5 ל 6:00 בערב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, למשוך את החוצצים ולאסוף ביצים בסביבות הצהריים. להעביר אותם לצלחות פטרי ולשים אותם לתוך 28.5 חממת מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבות 24 הודעה שעה הפריה, לנקות את צלחות פטרי על ידי הסרת עוברים מתים. בדוק את שלב ההתפתחות של עוברים 13 באמצעות מיקרוסקופ שדה אור וכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר מסנן (EGFP). קאאד יהיה גלוי דרך מסנן זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עוברים להגיע 60 העברת hpf חמישה עוברי ניאון בהירים לתוך צלחת פטרי נפרדת וdechorionate במידת צורך. </li></ol> 2. הרכבה של עובר לphotoconversion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר את העובר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי נורמלי. ההרכבה של עוברים על מיקרוסקופ confocal היא מאוד מאתגרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדוכןמים ארד E3 או להכין E3 הטרי באמצעות המתכון הבא: להוסיף את הדברים הבאים לליטר אחד של DH מים מזוקקים 2 O להוסיף את הדברים הבאים כדי להפוך את E3L 1x: 0.292 גרם 5.0 מ&quot;מ NaCl 0.013 גרם 0.17mm KCl 0.044 גרם 0.33mm CaCl 2 (יבוש, 96%, מגיב ACS) 0.081 גרם .33 מ&quot;מ MgSO 4 (anhydrated) אופציונאלי: להוסיף 200 μl של 0.05% מתילן כחול ל1X E3 כמו פטריות ומערבבים. בינוני שומר בטמפרטורת חדר למשך השבוע 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש tricaine סטנדרטית או להכין tricaine באמצעות המתכון הבא: ל5 L של .0.2% tricaine לערבב את המרכיבים הבאים: 45 מיליליטר טריס-Cl (1M pH9.5) 5 LH 2 O 10 tricaine גרם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את &#39;מיץ סרט&#39; (50 מיליליטר E3, 0.015% פתרון tricaine), על ידי הוספת tricaine 3.75 מיליליטר 0.2% ל46.25 מיליליטר E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את agarose על ידי ערבוב 46.25 מיליליטר מים E3 עם נקודת 46.35 מ&quot;ג נמוך היתוך agarose (LMP) בבקבוק זכוכית 50 מ&quot;ל ולפזר חלקיקים מוצקים על ידי במיקרוגל. לאחר מכן להוסיף3.73 tricaine 0.2% מיליליטר לagarose ולשים את בקבוק זכוכית עם agarose לתוך 50 ° C אמבט מים עד שימוש. </li></ol> 3. הכנה והרכבה של עובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עובר עם E3/0.015% פתרון tricaine עשה בשלב 1.1.2 ועובר העברה לתא שקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספוג את כל עודפי E3 עם רקמת נייר ולשים agarose על עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובר עמדה מגבה בצורה מושלמת עם טיפים microloader. ודא שכל העובר אינו מרחף על גבי agarose, אבל לדחוף את הגוף כולו. ואז לשפוך E3/0.015% פתרון tricaine על עובר מוטבע agarose עד החדר מתמלא באופן מלא בנוזל. </li></ol> 4. התאמת הגדרות תוכנה על Confocal מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אובייקטיבי 20X אוויר immersible (צמצם מספרי 0.75; גודל חריר 20) למיקוד העובר. ואז ללחוץ על כפתור אור L100 על המיקרוסקופ ובחר ערוצים בתוכנה. controls/A1settings לפתוח את הסמלים להציג / רכישה וclick confocal התקנת הכפתור. הבא לחץ על &#39;אוטומטי&#39; ובחר ערוצים הבאים לפני סגירת החלון שוב: CH1: ננומטר DAPI ערוץ 403.4 (ניתן להשתמש באורכי גל שבין 350-410 ננומטר) CH2: 488.0 ננומטר CH3: 561.9 ננומטר </li></ol> 5. Photoconversion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את CH1 ו -3 ולהדליק CH2 לפני לחיצה על לחצן משתלבים הסרה וסריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד בתאים של עניין לphotoconversion, שהוא הטוב ביותר שנעשה על ידי הפעלה עם מתח 1frame/sec וגבוה (HV) 200 ולאחר מכן עולה במסגרות / השנייה והוריד HV בהתאם עד שמגיע 1/32 מסגרות / sec וHV סביב 100-120, תלוי ברעש הרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר העובר הוא בפוקוס, נראה בקצה הימני של מסך, לתפוס את השפה הירוקה ולהפוך אותו קטן יותר, כך שהוא מתאים לאזור של עניין לphotoconversion קליק ימני עם העכבר. קטן יותר הוא טוב יותר, כי photoconversion היא בלתי הפיכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מסגרות / sec עד 1 וHV 200 ופגעלסרוק. תמונה מוגדלת באזור של photoconversion גלויה עכשיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Photoconvert ידי הפעלת CH1 (403.4 ננומטר). לחשוף לליזר photoconverting כל מקום 5-60 שניות, תלוי בגודל של האזור עד קאאד הירוק כפי שניתן לראות דרך ערוץ ה-GFP הוא כמעט נעדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אות קאאד הירוקה היא כמעט נעדר, לכבות CH1. הפעל CH2 ו -3 ב. לאחר מכן, לחץ לחיצה ימנית על חלון בשדה אזור סריקת A1 ופגעתי &#39;חזרה לגודל מקורי&#39; כדי לבדוק אם תאים רצויים היו photoconverted. </li></ol> 6. מה שהופך את Z-מחסנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את הסמל &quot;Z-הסדרה ללכוד&quot; בשורת התפריט והיכולת להציב גבולות העליונים ותחתונים של Z-מחסנית לפני שמתחילים אותו. הגדר LUTs. </li></ol> 7. תוכנת הגדרות זמן לשגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לתיבת A1Simple GUI וסמן את ההגדרות הבאות: 1/32 מסגרות / sec גודל 1024 ממוצע או 8X 4 תלוי במספר של Z-ערימות שיש לקחת בלולאה אחת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אל:פקדי תצוגה / רכישה / רכישת רצף ND ומסגרת זמן שנקבע (8-v30), לחץ מתמשך ולחץ על Z-מחסנית. הגדר גבולות כפי שנבדק בעבר ולהתחיל סרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להוסיף E3/0.015% קאמרי שקופיות פתרון tricaine לאורך כל היום. בלילה, למלא את האולם לחלוטין. שיימשך עד למחרת בבוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, למלא E3/0.015% פתרון tricaine ולבדוק אם עובר הוא עדיין בחיים. הפסד של הקרינה מצביע על מוות. המשך מילוי ובדיקות לאורך כל היום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המבנה סיים להרכיב, או את העובר מת, לסיים את הסרט. </li></ol> 8. עיבוד פוסט פרודקשן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;הקרנת מופע מקסימום עוצמת&#39; בסרגל כלים, ולאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על התמונה וליצור מסמך חדש. הווידאו הוא נראה באיכות הטובה ביותר האפשרית עכשיו. ללכת על מנת להסיר מסגרות שאינם נחוצות ולהתאים LUTs. לבסוף לשמור כ. avi. פורמט זה יהיה בסדר עבור Windows. עבור לא תוכנה להורדת מקo להמיר. mov או. wmv. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+at+Birth+of+Cleft+Lip+With+or+Without+Cleft+Palate%3A+Data+From+the+International+Perinatal+Database+of+Typical+Oral+Clefts+%28IPDTOC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cleft+Palate+Craniofac.+J%22%5BJournal%5D)">Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC).</a> Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).</li>
<li>Dixon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleft+lip+and+palate%3A+understanding+genetic+and+environmental+influences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).</li>
<li>Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakthroughs+in+the+genetics+of+orofacial+clefting%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting.</a> Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).</li>
<li>Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+and+morphogenesis+of+the+zebrafish+larval+head+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton.</a> Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).</li>
<li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Fate+Map+of+First+Pharyngeal+Arch+Structures+in+the+sox10%3A+kaede+Zebrafish+Transgenic+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Craniofac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model.</a> J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).</li>
<li>Trainor, P. A., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hox+genes%2C+neural+crest+cells+and+branchial+arch+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).</li>
<li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segment+and+cell+type+lineage+restrictions+during+pharyngeal+arch+development+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo.</a> Development. 120 (3), 483-494 (1994).</li>
<li>Swartz, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+a+palatogenic+gene+program+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Examination of a palatogenic gene program in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).</li>
<li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish.+Birth+Defects+Res%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res.</a> C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).</li>
<li>Wada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).</li>
<li>Eberhart, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).</li>
<li>Ando, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li>
<li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).</li>
<li>Kawakami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish-secreted+matrix+protein+you%2Fscube2+is+implicated+in+long-range+regulation+of+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling.</a> Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).</li>
<li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+using+photoconvertible+proteins+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development.</a> J. Vis. Exp. (67), e4350(2012).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הנה שיטה חדשה להדמיה של פיתוח craniofacial במודל דג הזברה מוצגת. Sox10: קו דג הזברה מהונדס קאאד כבר השתמש בהצלחה כדי לתאר את דפוס הנדידה של CNCC בפירוט משמש כאורגניזם מודל 5. מחקרים קודמים השתמשו בציוני דרך גולמית כגון העין למקד את התאים ויש לסמוך על הזרקת mRNA קאאד, מבחני photoconversion או dextran והעמסת בכלוב לphotoconversion 10, 11, 14, 15 סוקס:. יש 10 קאאד קו מהונדס יתרונות רבים בהשוואה...

בתרי orofacial מייצג את עיוות craniofacial הנפוצה ביותר, עם 1/700-1, 000 משלוחים השפיעו 1. שיבוש של התפתחות עוברית המוקדמת craniofacial יכול להוביל להיווצרות של שפה שסועה וחך (CL / P). בעוד סיבות לשסועות syndromic הוכחו במידה רבה, את הבסיסים הגנטיים ואפיגנטיים של צורות nonsyndromic של clefting orofacial עדיין צריכים להיחשף 2-4. על מנת להבין את האטיולוגיה ופתוגנזה של מומים אלה, יש צורך להבהיר את התפתחות מבני craniofacial על בסיס סלולארי. בכל מיני החולייתנים תאי גולגולת עצביים רכס (CNCC) להעביר מהצינור העצבי הגבי כדי לאכלס את קשתות בלוע, אשר יתרמו להיווצרות של מבני orofacial. שיבוש של התפתחות עוברית המוקדמת רכס עצבי יכול להוביל להיווצרות של מומים craniofacial כולל CL / P 5-7. במודעהdition לדמיון מבני בין דג הזברה ופיתוח craniofacial יונקים (CNCCs מתגורר באזורים הומולוגיים), רשת הרגולציה הגן זה שמור ביותר. כמו כן, הוכיח כי CNCCs לפתח באותו אופן בין מיני amniote ודג הזברה 8, מה שהופך את דג הזברה אורגניזם רב עוצמה ללימוד בסיס ההתפתחותי והגנטי של CL / פ יש לו יתרונות רבים, לרבות גודל קטן, מהיר והתפתחות עוברית לשעבר ברחם, ושיעורי גידול גבוהים. יתר על כן, העובר הוא שקוף אופטי, מה שהופך אותו נוח לתצפית של אירועים התפתחותיים מורכבים מתחת למיקרוסקופ 9. זהו מודל חיה אידיאלי לחקר נדידה וההתמיינות של תאי רכס עצביים גולגולתי. הרחבת בעבר עבודה שפורסמה 8, 10, 11, דפוס הנדידה של CNCC תואר בפירוט באמצעות sox10: המודל המהונדס קאאד 5. קאאד הוא חלבון תמונה הניתנת להמרה שtuאחיות מוסמכות מירוקים לאדום לאחר הפעלת תמונה ומאפשרת לעקוב אחר CNCCs בדיוק. במהלך השינוי הזה את עמוד השדרה פפטיד הוא ביקע, טוען כי ההמרה היא יציבה, כלומר, יכולים להיות במעקב התאים ליעדן הסופי 12. קווים מהונדסים שכותרתו עם קאאד תחת שליטת תעתיק של sox10 הראו כי חיך amniote וצלחת כברתי של דג הזברה נוצרים homologously על ידי שילוב של בליטות הבילטראליים לסת (MXP) עם בולטות frontonasal (FNP) ושתפר היתוך Y בצורת משול בין מינים. בין יישומים אחרים, sox10: מודל דג הזברה מהונדס קאאד היה לשמש ליצירת קטעי וידאו של עוברי דג הזברה בשלבי התפתחותיים שונים כדי להראות היווצרות של מבני craniofacial נורמלים ולא נורמליים. Photoconversion של קבוצות ספציפיות של תאים מאפשרת לעקוב אחר התפתחותם. בשיטה זו גישה ליצור הדמיה חיה של פיתוח craniofacמבני ial בדג הזברה הוא הציג, מה שהופך את זה קל מבחינה ויזואלית להדגים תהליך התפתחותי מורכב זה. פרוטוקול זה מיועד לשיתוף החוויה של יצירת סרטונים אלה באמצעות ההתפתחות התקינה של צלחת כברתי בsox10: דג הזברה מהונדס קאאד לדוגמא ירושלים. פרוטוקול זה עוד יכול להיות מיושם על ביצוע קטעי וידאו הזמן לשגות של כל מבנה שמקורם בתאי רכס עצביים גולגולתי בדג זברה.

<table><tbody><tr><td>Sox10: kaede קו דג זברה טרנסגני </td><td>MGH</td><td></td><td>זמין דרך מעבדת Liao</td></tr><tr><td>צלחות פטרי 100x15 מ"מ</td><td>BD פלקון</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי 35 מ"מ x 10 מ"מ</td><td>BD Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure נקודת התכה נמוכה (LMP) Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15517022</td><td></td></tr><tr><td>Lab Tek 2 Chamber SlideSystem </td><td>LabTek</td><td>154453</td><td></td></tr><tr><td>Microloaders 200/pk</td><td>Fisher</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R Si Confocal Ti series</td><td>Nikon</td><td>ללא מספר</td><td></td>קטלוגי</tr><tr><td>NIS Elements Software AR3.2 64-bit</td><td>Nikon</td><td>ללא מספר</td><td></td> קטלוגי</tr></tbody></table>

ויזואליזציה של craniofacial פיתוח בsox10: קאאד מהונדס דג הזברה הקו באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

palatogenesis חוליות הוא תהליך התפתחותי כוריאוגרפיה והמורכב ביותר, הכולל הגירה של רכס עצבי גולגולתי (CNC) תאים, התכנסות והרחבה של בליטות פנים, והתבגרות של שלד craniofacial. כדי ללמוד את התרומה של הרכס העצבי הגולגולת לאזורים ספציפיים של חיך דג הזברה sox10: קו דג הזברה מהונדס קאאד נוצר. Sox10 מספק הגבלת שושלת של חלבון כתב קאאד לרכס העצבי, ובכך הופך את תא תיוג תהליך מדויק יותר מאשר צבע מסורתי או הזרקת mRNA כתב. קאאד הוא חלבון תמונה הניתנת להמרה שהופך מירוק לאדום לאחר הפעלת תמונה ומאפשר לעקוב אחר תאים בדיוק. Sox10: הקו מהונדס קאאד שימש לביצוע ניתוח שושלת להתוות אוכלוסיות תאי CNC כי להצמיח לסת מול לסת תחתון, אלמנטים ולהמחיש הומולוגיה של בליטות פנים לamniotes. פרוטוקול זה מתאר את הצעדים כדי ליצור וידאו חי זמן לשגות של sox10: עובר דג הזברה קאאד. פיתוח של צלחת כברתי ישמש כדוגמא מעשית. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על ביצוע הקלטת confocal זמן לשגות של כל קאאד או חלבון כתב photoconvertible דומה בדג זברה מהונדס. יתר על כן, ניתן להשתמש בו כדי ללכוד את הפיתוח לא רק נורמלי, אלא גם לא תקין של מבני craniofacial במוטנטים דג הזברה.

בsox10: CNCCs קו מהונדס קאאד, נדידה והודעה נודדת שכותרתו fluorescently ירוקה. תאי CNCC שכותרתו עם קאאד פלואורסצנטי הירוק לסכם ביטוי mRNA sox10 אנדוגני 5. בין יישומים אחרים, מודל חיה זה שימש כדי להמחיש את הפיתוח של מבני craniofacial תלויים CNCC טוב יותר. התפתחות תקינה של מבנים ספציפיים וגם התפתחות פתולוגית של מומים Craniofacial, שפה שסועה וחך במיוחד כבר נתפסה. סדרה של קטעי וידאו זמן לשגות חי של דג הזברה...

ויזואליזציה של נתונים ניסיוניים הפכה מרכיב מרכזי בהצגת תוצאות לקהילה המדעית. דור של הקלטת הזמן לשגות חי של עוברים גובר תורם למצגת טובה יותר והבנה של תהליכים התפתחותיים מורכבים. פרוטוקול זה הוא מדריך צעד אחר צעד לתיוג תא באמצעות photoconversion חלבון קאאד של דג הזברה.

ויזואליזציה של Craniofacial פיתוח בsox10: קאאד מהונדס דג הזברה הקו באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להפיק הקלטת time lapse חיה של נדידת תאי רב-עצביים (neural crest cells) כדי להראות את ההיווצרות של מבנים קרניאלי-פציאליים בשלבי התפתחותם. זאת משיגים תחילה על ידי קיבוע של דג זבב (zebrafish) טרנסגני SOX 10 KD תחת הרדמה באגרוז, במטרה למזער את התנועה לאורך הניסוי. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, מבוצעת הפעלה פוטו-כימית ב-UV כדי להמיר את ה-KD מירוק לאדום בתאי הרב-עצביים.לאחר מכן, התמקדו בתאי הרבב העצבי שהומרו לתמונה. נוצר Z-stack של המבנה המתפתח לפני הקלטת סרטון Time-lapse. התוצאות המתקבלות מראות את התפתחותם של תאי רבב עצבי גולגולתי לחך הראשוני של דג הזברה בעובר זברה טרנסגני SOX 10 KD.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דימות סטטי, הוא שניתן להמחיש תהליכי התפתחות מורכבים, כגון נדידת תאים, בזמן אמת. דבר זה הופך את התוצאות לנגישות יותר עבור הקהילה המדעית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית, כגון האופן שבו נוצרים מבנים המופקים מתאי רכס עצבי (neural crest), וכיצד גנים מסוג PTO משפיעים על התפתחותם.להכנה של קיבוע עוברים, השתמשו בבקבוק נפח 125 milliliter כדי לערבב E three water עם low melting point aeros, וחממו במיקרוגל כדי להמיס את התמיסה. לאחר מכן, הוסיפו trica והניחו את הבקבוק במקלח מים בטמפרטורה של 50 degree Celsi

visualization-craniofacial-development-sox10-kaede-transgenic

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

confocal הדמיה זמן לשגות היא טכניקה רבת עוצמה שימושית לאפיון התפתחות עוברית. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ולאפיין המורפוגנזה craniofacial בסוג פראי, כמו גם PDGFRA, smad5, וSMO עוברים שעברו מוטציה.

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

ארגון תא של עצמות craniofacial כבר שיערו ארוך אבל אף פעם לא דמיין ישירות. תיוג תא Multi-רפאים ובשידור חי vivo   הדמיה מאפשרת הדמיה של התנהגות הדינמית של תאים בלסת תחתונה דג הזברה. כאן, אנו פירוט הפרוטוקול לתמרן Zebrabow דג מהונדס וישירות להתבונן עיבור תא ושינויים מורפולוגיים של כונדרוציטים בסחוס של מקל.

ויזואליזציה של הכונדרוציטים עיבור וכיוונית למניעת הפצת נשק באמצעות ניתוח תא משובט Zebrabow בסחוס של העוברית מקל

השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח זמן לשגות של פיתוח איבר עוברי דג הזברה באמצעות הקרינה מיקרוסקופ לנתח מסוגל לבצע חתך אופטיים אסטרטגיות פשוטות של הסתגלות לתקן להיסחף מוקדי מישוריים.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

כאן, אנו מציגים שיטת הרכבה רב-תכליתית המאפשרת הדמיה ארוכת טווח של התפתחות הגוף האחורי של עוברי דג זברה חיים מבלי להפריע להתפתחות תקינה.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

שילוב של טכניקות אופטי מתקדם של סריקת מיקרוסקופ עם זמן עירור קרינה פלואורסצנטית פוטון מרובה אורך גל לייזר בוצע כדי ללכוד דימות ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של הרכס העצבי הגירה ב Tg (sox10:EGFP) ו- Tg (foxd3:GFP) דג זברה עוברי.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

כאן, אנו מציגים סדרה סטנדרטית של פרוטוקולים להתבונן sulcus עינית, נעלה את מבנה שזוהתה לאחרונה, והתפאורה אבולוציונית בעיניים חוליות. באמצעות רימות דג זברה, נדגים טכניקות הדרושות כדי לזהות גורמים שתורמים היווצרות וסגירת sulcus עינית מעולה.

ויזואליזציה של Sulcus עינית הממונה במהלך מופרה רזבורה rerio

מאמר זה מתאר שיטה לטעינת עוברי שברירי הדגים עבור מיקרוסקופ הזמן המורחבת הקפיצה הדקה. שיטה בעלות נמוכה זו קלה לביצוע באמצעות מנות מיקרוסקופית תחתית רגילות של זכוכית להדמיה בכל מיקרוסקופ הפוך. ההרכבה מבוצעת בשכבות של הצמח בריכוזים שונים.

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

ב vivo הדמיה היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי לחקור את המנגנונים הסלולריים בבסיס פיתוח מערכת העצבים. כאן אנו מתארים טכניקה לשימוש מיקרוסקופיה מיקוד הזמן כדי להמחיש מספר גדול של המוח ססגוניות באמצעות התווית בזמן אמת בתוך מערכת העצבים דג זברה המתפתח.

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

פרוטוקול זה מתאר גישה לתיוג תותוג טומוטו והדמיה רב ממדית של התפתחות עיניים מוקדמות של דגי זברה. אנו מתארים תיוג, הטמעה והדמיה בארבעה ממדים (4D) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, ושיקולים למיטוב רכישת ערכות נתונים לניתוח מנגנונים של מורפוגנזה של אופטית.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

כאן, פרוטוקול מסופק להדמיה בהילוך מהיר של מורפוגנזה עינית באמצעות מיקרוסקופ יריעת אור זמין מסחרית ותחנת עבודה לעיבוד תמונה כדי לנתח את הנתונים המתקבלים. פרוטוקול זה מפרט את ההליכים להרדמה עוברית, הטבעה באגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה, השעיה בתא ההדמיה, הגדרת פרמטרי ההדמיה, ולבסוף ניתוח נתוני ההדמיה באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.

הדמיה של מורפוגנזה עינית על ידי מיקרוסקופיה של גיליון אור באמצעות rx3:GFP דגי זברה מהונדסים

למדו לתעד נדידת תאי קרום העצב בדגי זברה תוך שימוש במיקרוסקופיית confocal וטכניקת photoconversion של חלבון kaede. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר התפתחות מבני הראש והפנים.

ויזואליזציה של Craniofacial פיתוח בsox10: קאאד מהונדס דג הזברה הקו באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal

גלה סרטונים נוספים