מדידת כוח במהלך התכווצות כדי להעריך את תפקוד שריר בזחלי דג הזברה
23 ביולי 2013
מדידות כוח ניתן להשתמש כדי להדגים שינויים בתפקוד שרירים עקב פיתוח, פציעה, מחלה, טיפול או רעילות כימית. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את שיטה למדידת כוח בכיווץ מקסימאלי של שריר תא מטען הזחל דג הזברה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את ייצור הכוח במהלך התכווצות מקסימלית של דגי זברה, זחל, שריר תא המטען. זה מושג על ידי יצירת לולאות תפרים שישמשו להחזקת הזחלים במקומם במהלך מדידות כוח. לאחר מכן, הזחלים המורדמים ממוקמים בתוך תא הניסוי.
ברגע שהוא נמצא במקום, הכוח נרשם במהלך התכווצות עווית מקסימלית. השלב האחרון הוא למדוד את מידות שרירי תא המטען כך שניתן יהיה לנרמל את שיא הכוח לאזור חתך השריר. בסופו של דבר, מדידת ייצור הכוח במהלך ההתכווצות משמשת כדי להראות שינויים בתפקוד השרירים ובבריאות הכללית של השרירים.
למרות שאנו מדגימים שיטה זו באמצעות זחלי דג זברה מסוג בר, ניתן להשתמש בה גם עם זחלים מהונדסים גנטית או עם זחלים שטופלו בתרופות או בחומרים רעילים. לאחר מכן ניתן להשתמש בשיטה כדי לאפיין מודלים של מחלות שרירים ולהעריך טיפולים או לחקור התפתחות שרירים, פציעה או רעילות כימית. השלב הראשון הוא הכנת לולאות התפרים שישמשו להחזקת הזחלים במקומם.
במהלך בדיקת כוח, השתמש במלקחיים כדי להפריד תפרים לא סטריליים לשלושה גדילים. לאחר ההפרדה, התחל לקשור קשר כפול באחד הגדילים, אך עצור לפני הידוק הקשר לחלוטין כדי ליצור לולאה קטנה. במקום לסיים את הלולאה, השתמש במספריים כדי לחתוך תפרים עודפים מהזנבות.
הניחו את הלולאה על הצד הדביק של פתק דביק לשימוש מאוחר יותר. צרו שתי לולאות תפרים לכל זחל שייבדק. ראשית, הנח את מכשיר הבדיקה על הבמה של מיקרוסקופ סטריאו.
לאחר מכן, חבר את כבלי מתמר הכוח ובקר האורך למנגנון הבדיקה. הפעל את מתמר הכוח ואת בקר האורך והפוך את המתג בחזית בקר האורך. זה הופך את צינור בקר האורך למגשר עם העברה חד פעמית. פיפטה.
מלאו את תא הניסוי בתמיסת בדיקה. השתמש במלקחיים כדי להרים לולאת תפר על ידי אחד הזנבות כאחיזה. הלולאה בחלק המעוקל עלולה לעקם את התפר ולגרום לו להישבר במהלך השלבים הבאים.
תלו לולאה אחת על צינור מתמר הכוח ואחרת על בקר האורך בעזרת פיפטת העברה חד פעמית העבירו זחלי דג זברה לצלחת פטרי קטנה מלאה בתמיסת בדיקה. לאחר שההרדמה נכנסה לתוקף, דחפו בעדינות את הזנב כדי לוודא שיש חוסר מגע מעורר שחייה. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה מזכוכית כדי להעביר את הזחלים לתא הניסוי בעזרת מלקחיים.
הנח בעדינות את החלק הקדמי של הזחל דרך לולאת התפר בצינור מתמר הכוח, תוך אחיזה בשני הזנבות של לולאת התפר. משוך אותם בו זמנית כדי להדק את הלולאה האחורית לשק האלון או לשחות את שלפוחית השתן בעזרת מלקחיים. החזיקו זנב תפר אחד ומשכו, מה שגורם לזחלים להסתובב 90 מעלות סביב הצינור עד שהצד הצדדי של הזחל פונה כלפי מעלה.
באמצעות התקן המיקום X, Y, Z המחובר לבקר האורך, הזז את צינור בקר האורך לאורך ציר ה-x ומתחת לתא המטען והזנב של הזחלים. השאירו רווח בין קצות צינור בקר האורך לצינור מתמר הכוח. לאחר מכן, הנח את לולאת התפר מעל זנב הזחלים והדק את לולאת התפר.
כפי שהודגם קודם לכן, ייתכן שתצטרך לסובב את החלק האחורי של הזחלים כך שהצד הצדדי יפנה כלפי מעלה. לאחר שנמצא במקום, חתוך את זנבות לולאת התפר. השתמש במכשירי המיקום XY, Z כדי להוריד לאט את הצינורות עד שהם פשוט נוגעים בתחתית החדר.
לאחר מכן הרם את הזחלים למרחק מתאים מתחתית החדר. זה צריך להיות במרחק העבודה של אובייקט מיקרוסקופ הפוך שנעשה בו שימוש מאוחר יותר. לבסוף, כוונן את צינור בקר האורך כדי ליישר את הציר הארוך של הזחל עם הציר הארוך של צינור מתמר הכוח.
כדי להתחיל, העבר את מכשיר הבדיקה לשלב של מיקרוסקופ הפוך. לאחר מכן, חבר את מדחום סירקולטור אמבט המים ובקר הטמפרטורה למנגנון הבדיקה. הפעל את הרכיבים הדרושים והתאם את ההגדרה בבקר הטמפרטורה לערך הרצוי.
חבר כבלים מהסטימולטור למנגנון הבדיקה. הפעל את הכוח לממריץ, אך אל תגרה את הזחלים בשלב זה. כדי לבדוק שהזחלים מקבילים לתחתית החדר, צפו בחלק הזחלים בין קצות הצינורות.
אם מקבילים, שני קצוות הזחלים יהיו בפוקוס במידת הצורך. כוונן את צינור מתמר הכוח עד ששני הקצוות יהיו ממוקדים והזחל מקביל. הפעל את מערכת אורך סרקומר הווידיאו וסובב את מצלמת הווידיאו כך שהפסים יהיו מקבילים לצידי מסגרת הווידאו.
מרווח הפסים משמש כאינדיקטור לאורך סרקומר. כוונן את המיקרוסקופ כדי להתמקד בסיבים היקפיים ושים לב לאורך הסרקומר המצוין. במידת הצורך, כוונן את בקר האורך כדי לקצר את הזחלים עד שאורך הסרקום יהיה פחות מהאופטימלי כדי לייעל את כוח העווית.
ראשית, הגדר את זרם המוצא על הסטימולטור לגודל נמוך, ולאחר מכן תכנת תוכנה מיוחדת כדי לספק פולסים זרמים. משך של 0.2 אלפיות השנייה. ספק את הדופק הראשון והשתמש באוסילוסקופ כדי למדוד את שיא כוח העווית.
הגדל את הזרם במרווחים של 50 מיליאמפר ומדוד את שיא כוח העווית בכל רמת זרם חדשה. המתן 30 שניות בין עוויתות כדי למנוע עייפות ככל שזרם הגירוי עולה. שיא כוח העווית עולה בדרך כלל למקסימום ואז מקטין בהדרגה את הזרם שבו הזחל מייצר.
הכוח הגדול ביותר הוא זרם הגירוי האופטימלי לאחר שזוהה, הגדר את משרעת הזרם לזרם הגירוי האופטימלי והתאם את אורך הזחלים על מנת לעורר כוח עווית מרבי. לבסוף, עורר עווית של שרירי הזחל. השתמש באוסילוסקופ כדי לתעד את תגובת הכוח ולשמור את הרשומה לניתוח הבא.
כדי למדוד את מידות השרירים, העבר את מכשיר הבדיקה בחזרה למיקרוסקופ הסטריאו. בעזרת סולם ה-IP, מדוד את גובה השרירים כפי שהוא נראה מהצד. קח את המדידות בנקודת ציון אנטומית.
למשל, הפתח האורוגניטלי המסומן כאן באדום. ואז מקפידים לא לשנות את אורך הזחלים. סובבו את הזחלים ב-90 מעלות באמצעות זנבות לולאת התפרים על מנת לראות את הזחלים מלמטה.
מדוד את רוחב השרירים כפי שהוא נראה מלמטה. לבסוף חותכים את לולאות התפרים עם להב מיקרו כדי לשחרר את הזחלים מציוד הבדיקה בזחלי דג זברה בריאים מסוג בר, סיבי השריר צריכים להיות מקבילים זה לזה ללא פערים גדולים ביניהם ויש להם עדויות לפסים זחלי דג זברה מסוג בר שאינם מציגים תכונות אלה או עם נזק ברור כגון סיבים מנותקים כפי שניתן לראות כאן יש להשליך כאן. שיא כוח העווית לעומת זרם הגירוי מתוכנן עבור זחלי דג זברה בודדים.
זרם הגירוי האופטימלי הוא בדרך כלל בין 400 ל-600 מיליאמפר . תגובת כוח מייצגת שנאספה במהלך התכווצות עווית מקסימלית של זחל בודד מוצגת כאן. הנה. ערכי שיא הכוח מזחלי בר בגילאים שונים מוצגים כנעים בין 0.9 ל-1.7.
מילי ניוטון עם זחלים מבוגרים יותר מייצרים יותר כוח מאשר זחלים צעירים יותר. זחלים מבוגרים מייצרים יותר כוח מזחלים צעירים יותר גם לאחר שכוחות השיא מנורמלים לאזור שריר חתך. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב להדק את לולאות התפרים מספיק כדי שהזחלים לא יוכלו להסתובב בקלות סביב מתמר הכוח וצינורות בקר האורך.
אם לולאות התפרים רופפות מדי, הכוח שנוצר על ידי הזחל לא יועבר במלואו למתמר הכוח וכוח העווית המרבי יזלזל.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה למדידת ייצור כוח במהלך כיווצים מקסימליים של שרירי הגו של זחלי דג הזברה. הטכניקה ישימה להערכת תפקוד השרירים בהקשרים שונים, כולל התפתחות, פגיעה וחשיפה כימית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- פיזיולוגיה של השריר
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- מדידות כוח יכולות להצביע על שינויים בבריאות השרירים.
- זחלי דגי זברה משמשים כמודל לחקר תפקוד השרירים.
- ניתן להתאים את השיטה לתנאים ניסויים שונים.
- הבנת התכווצות השרירים חיונית להערכת טיפולים ומודלים של מחלות.
מטרת המחקר
- למדידת כוח במהלך התכווצויות מקסימליות של זחלי zebrafish.
- לספק פרוטוקול להערכת תפקוד ובריאות השרירים.
- לאפשר את חקר תגובות השרירים לתרופות ולרעלים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת לולאות תפר לקיבוע הזחלים במהלך הבדיקה.
- שימוש במתמר כוח להקלטת התכווצויות שרירים.
- מדידת ממדי השריר לצורך נרמול הכוח.
- גירוי של הזחלים לעירור התכווצויות עווית (twitch) למדידת כוח.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של כוח התכווצות שיא (peak twitch force) בזריקי zebrafish.
- זיהוי זרם הגירוי האופטימלי ליצירת כוח מרבי.
- הדגמת התאימות של השיטה לתנאים ניסיוניים שונים.
- תובנות לגבי תפקוד השריר ובריאותו בהתבסס על מדידות כוח.
מסקנות
- השיטה מספקת דרך מהימנה להערכת תפקוד השרירים בזריקים של דגי זברה.
- מדידות כוח יכולות לחשוף מידע חשוב על בריאות השרירים.
- ניתן להשתמש בטכניקה זו במחקרים של מחלות שרירים ובהערכת טיפולים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה כמותית של כוח במהלך התכווצות שריר בזריקי דגי זהב (zebrafish) מספקת מדד תפקודי לבריאות השריר, ומאפשרת הערכה חסונה של מודלים של מחלות והתערבויות פרמקולוגיות. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים על ידי קישור הפרעות גנטיות או כימיות לתוצאות פיזיולוגיות מדידות. שילוב של בדיקות שריר תפקודיות בתהליכי גילוי מגביר את הביטחון החזוי ומסייע בתיעדוף הפורטפוליו עבור תוכניות טיפוליות הקשורות לשריר.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של תפקוד השרירים בזריקים של דגי זברה שעברו מודיפיקציה גנטית או טופלו בתרכובות.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אספקת ראיות כמותיות למעורבות המטרה או לוויסות המסלול.
- מסייע בביטחון חיזויי בבחירה ובתיקוף של מודלים למחלות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מבסס בדיקה כמותית הניתנת לשחזור עבור כיווץ שרירים, המתאימה לסריקת התערבויות.
- מנstandardיז את תוצאי מדידת הכוח, ובכך תומך בהשוואה בין מחקרים ובין צוותים שונים.
- מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף להערכה עתידית של תרכובות ולמחקרים מכניסטיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם מדדי תפקוד שרירי עם נקודות סוף רלוונטיות למחלה לצורך המשכיות תרגומית.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מבוסס התאמה לסיכון על ידי קישור התערבויות מולקולריות לתוצאות פיזיולוגיות.
- תומך בפיתוח סמנים ביולוגיים על ידי קורלציה בין מדידות כוח לשינויים היסטולוגיים או מולקולריים.
אינטגרציה של צינור עיבוד וזרימת עבודה
שיטה זו למדידת כוח משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מוקדם של מטרה ועד להערכת מודלים פרה-קליניים, ובכך מספקת גשר בין הפרעה מולקולרית לתוצאה תפקודית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי כימות התגובה של השריר למניפולציה גנטית או כימית.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים וסטנדרטיים להערכה מהימנה של תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מדידות של כוח ושטח חתך להשוואה סטטיסטית חזקה בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר נתונים תפקודיים in vivo לוולידציה פרה-קלינית ולהתאמה של סמנים ביולוגיים (biomarkers).
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר למגוון מחקרי רעילות ומחלות שרירים בין צוותי מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתוכניות המכוונות לשרירים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה של הבדיקה, את השחזוריות ואת יכולת ההרחבה ליישומים בעתירי תפוקה (high-throughput).
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אספקת נקודות קצה תפקודיות בשלב מוקדם של מסלול הפיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף וקידום של נכסים הקשורים לשרירים בהתאמה לרמת הסיכון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בדגי zebrafish, פיזיולוגיה של השריר ומכשור של חיישני כוח (force transducer).
- נדרשת הקמה מדויקת של תשתיות הגירוי, המדידה והדימוי.
- יש צורך בסטנדרטיזציה בין-צוותית של הפרוטוקולים ותהליכי ניתוח הנתונים.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור רקעים גנטיים שונים או מחלקות של תרכובות.
- תשומת לב קפדנית למתיחות התפרים ולמיקום הזחלים היא קריטית להעברה מדויקת של הכוח.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Preparing Suture Loops
1:50
Preparing the Experimental Chamber and Positioning the Larva
4:11
Recording Force During a Maximal Twitch Contraction
6:20
Measuring Musculature Dimensions with Larva at Optimal Length
7:00
Results: Peak Force During Maximal Twitch
7:56
Conclusion
