What are the three main temperature steps in a PCR cycle?

PCR uses three distinct temperature steps called denaturation, annealing, and extension. Denaturation at 95°C breaks hydrogen bonds between DNA base pairs, creating single-stranded DNA. Annealing at 50-65°C allows primers to bind to the template. Extension at 72°C enables DNA polymerase to synthesize new complementary strands by adding nucleotides.

Why is Taq polymerase used in PCR reactions?

Taq polymerase is a thermostable enzyme isolated from the bacterium Thermus aquaticus, which lives in hot springs. It can withstand temperatures exceeding 90°C, making it ideal for PCR because it remains active throughout repeated heating and cooling cycles without denaturing, unlike standard DNA polymerases.

What are the key requirements for designing PCR primers?

Effective primers must be 15-30 base pairs long with approximately 50% guanine and cytosine content. Both primers should have melting temperatures above 50°C and within 1-2 degrees of each other. Primers must be complementary to flanking regions of your target sequence, avoid forming primer dimers, and lack secondary structure from self-annealing.

How does PCR amplify DNA exponentially?

After each cycle, primers bind to newly synthesized single-stranded DNA. The amplicon forms when polymerase extends from the forward primer on a strand generated by reverse primer amplification, or vice versa. Once created, this amplicon serves as template in subsequent cycles, doubling the target DNA with each cycle and producing exponential amplification after 20-40 cycles.

What essential reagents must be included in a PCR reaction?

A complete PCR reaction requires DNA template, forward and reverse primers, Taq polymerase, dNTPs (nucleotide building blocks), reaction buffer containing magnesium and other ions, and PCR-grade water. A typical 50-microliter reaction includes specific concentrations of each component. The buffer maintains pH and provides cofactors necessary for polymerase function and reaction stability.

How do you verify successful PCR amplification?

After PCR completes, verify the product using gel electrophoresis concept procedure and applications to visualize DNA fragments. Successful amplification appears as a band at the correct base pair size matching your expected amplicon. Running negative controls without template and positive controls with known template helps confirm specificity and detect contamination in your reactions.

What is a PCR master mix and when should you use it?

A PCR master mix is a large-volume mixture of all shared reagents distributed into multiple reaction tubes, useful when amplifying the same product from numerous different templates. This approach reduces setup time and minimizes pipetting errors across many reactions. Each tube receives the master mix plus its specific DNA template, streamlining high-throughput PCR workflows.

PCR: תגובת שרשרת פולימראז

0 צפיות13:27 דק׳

תגובת שרשרת פולימראז או PCR היא שיטה נפוצה להגברת שברי DNA. PCR משתמש תרמורכיבה על אופניים, שהוא חימום וקירור חוזרים ונשנים של התגובה באמצעות שלוש טמפרטורות נפרדות הנקראות denaturation, חישול והרחבה או התארכות.

תגובת התרמו-אופניים מתחילה ברגע שמכניסים ריאגנטים של PCR לתרמוציקלר מכונה, המתוכנתת לחמם ולקרר את התגובה במדויק.

מחזור PCR מתחיל עם denaturation, אשר מתרחשת במשך 20 עד 30 שניות ב 95 °C (70 °F), הרבה מעל טמפרטורת ההיתוך של DNA. טמפרטורת ההיתוך היא מצב שבו חצי מהדנ"א הוא סליל כפול נטוש והשני הוא סליל אקראי נטוש אחד. טמפרטורת הדנטורציה היא הרבה מעל טמפרטורת ההיתוך, על מנת להבטיח כי כל קשרי המימן בין זוגות בסיס משלימים נשברים מניבים רק DNAs נטוש יחיד. גדילים בודדים מזווגים מכונה גדילי תחושה ואנטיסנס. רצף החושים, או גדיל הקידוד, זהה לרצף של mRNA, אשר בסופו של דבר יהיה קוד לחלבון. לכן, זה הגיוני. כאשר לקרוא משמאל לימין זה מתחיל עם 5 'פוספט ומסתיים עם הידרוקסיל 3 '. גדיל האנטיסנס נקרא גם גדיל משלים ומתחיל עם הידרוקסיל 3 'ומסתיים עם 5 'פוספט כאשר לקרוא משמאל לימין.

בשלב השני, חישול, חתיכות קצרות של DNA הנקראות פריימרים, אשר ספציפיים לתחושה או גדילי אנטיסנס להיקשר באמצעות קשרי מימן. הפריימר שנקשר לגדיל האנטיסנס ויש לו את אותו רצף כמו גדיל החוש הוא הפריימר הקדמי או החושי. הפריימר שנקשר לגדיל החוש ויש לו רצף הפוך ומשלים לגדיל החוש הוא פריימר ההפוך או האנטיסנס שלך. בהתאם לאורך הפריימרים המשמשים את טמפרטורת החישול לשלב זה היא בדרך כלל 3 עד 5 מעלות צלזיוס מתחת לטמפרטורת ההיתוך הנמוכה יותר של שני הפריימרים שלך. חישול נוטה להתרחש בין 50 ל 65 °C (65 °F) ונמשך 20 עד 40 שניות.

ברגע שה פריימרים נקשרים לדנ"א הם מובילים את התגובה על ידי יצירת קצה קבוצת הידרוקסיל 3 'שאליו פולימראז, אנזים המשכפל DNA, יהיה לאגד.

השלב הבא שנקרא התארכות או הרחבה מתרחש ב 72 °C (72 °F), אשר אופטימלי עבור פעילות פולימראז. ברגע שהוא קשור לפולימראז מתחיל להוסיף טריפוספטים נוקלאוטידים בחינם, או dNTPs, עד קצה הפריימר אחד בכל פעם בכיוון 5 'עד 3 'כדי להפוך DNA תקוע כפול.

לאחר השלמת ההארכה מתחיל המחזור הבא. במחזור הבא פריימרים ייקשרו לדנ"א נטוש יחיד שנוצר באמצעות הרחבה קודמת. השבר הקצר שאתה מנסה להגביר, האמפליקון, ייווצר בסופו של דבר כאשר הפולימראז משתרע מהפריימר הקדמי על גדיל שנוצר על ידי הגברה מהפריימר ההפוך או להיפך. לאחר שנוצר, כמות האמפליקון תגדל באופן אקספוננציאלי במחזורים הבאים. בהתאם למטרה של התגובה שלך, 20 עד 40 מחזורים יהיה צורך.

עבור אמפליקולים ארוכים, שלב התארכות סופית מופעל בדרך כלל ב 72 °C (5 עד 15 דקות) על מנת להבטיח את כל ה- DNA הוא כפול תקוע. בדרך כלל, שלב אחיזה סופי ב 4 °C מתוכנת לתוך thermocycler כצעד זהירות כדי להבטיח כי ה- DNA נשאר יציב עד שהוצא מתוך התרמוציקלר.

תגובת ה- PCR דורשת מספר ריאגנטים מרכזיים. הראשונה היא תבנית הדנ"א, שהיא דגימת הדנ"א שממנה יוגבר השבר שלך. ואז יש את הפריימרים שלך, שהם חתיכות קצרות של DNA או אוליגונוקלאוטידים שמראש תגובת הפולימראז.

ישנם מספר שיקולים חשובים שיש לקחת בעת בחירת הפריימרים שלך. ראשית, הם חייבים להיות משלימים לאזורי 5' ו-3' של תבנית ה- DNA שלך שמאגפים את הרצף שברצונך להגביר. שנית, הם צריכים להיות בין 15 ל -30 זוגות בסיסים ארוכים ולהיות מורכבים כ -50% גואניס וציטוצינים. שלישית, טמפרטורות ההיתוך של שני פריימרים צריך להיות מעל 50 °C (50 °F) ובתוך 1 עד 2 מעלות אחד של השני, כך שהם יכולים להיקשר ביעילות באותה טמפרטורת חישול. רביעית, הם לא יכולים להיות משלימים זה לזה וליצור עמעום פריימר. וחמישית, הם לא צריכים להכיל מבנה משני, שהוא צורה על ידי חישול עצמי בתוך אחד הפריימרים.

בנוסף לפריימרים ולתבנית ה- DNA, DNA פולימראז חיוני לתגובת ה- PCR. האנזים הנפוץ ביותר ב- PCR הוא טאק פולימראז, שהוא אנזים תרמוסטבל מבודד מהחיידק תרמיוס אקווטיקה שעושה את ביתו במעיינות חמים. טאק פולימראז יכול לעמוד בטמפרטורות גבוהות מ 90 °C (50 °F).

dNTPs, אשר ירכיבו את זוגות הבסיס בגדילים הגדלים, יש להוסיף גם לתגובה. מאגר תגובה, השומר על רמת חומציות ומכיל יונים חשובים כמו מנגן, מגנזיום ואשלגן, הוא גם מרכיב תגובה הכרחי המייצב את התגובה ומספק קופקטורים חשובים לאנזים פולימראז. כמו כל התגובות, PCR צריך ממס, ולכן מים כיתה PCR, אשר ללא יונים שיכול לעכב את התגובה, משמש.

לפני תחילת ה- PCR ודא שסביבת העבודה נקייה כדי למנוע זיהום. כפפות חייבות תמיד להיות משוחקות.

כדי לעזור במעקב אחר רכיבי התגובה השונים שתזדקק להם. ערוך טבלה של נפחים ותרכיוזים של ריאגנט עבור כל אחת מהדגימות שלך, כולל פקדים. במונחים של כרכים תגובה טיפוסית צריכה להכיל 5μL של 10X מאגר תגובה, 4μL של 25 mM MgCl2, 1μL של dNTPs ב 10 mM, 2μL של פריימרים קדימה והפוך ב 50 ng / μL, ו 0.3μL של פולימראז טאק ב 5 U / μL. ברצונך להוסיף מספיק תבנית כך ש- 100 ng יהיה נוכח בתגובה. לבסוף, רוב תגובות PCR מתבצעות בנפח כולל של 50μL. אז נפח של מים כיתה PCR חייב לשמש כדי להבטיח את הנפח הכולל הוא אכן, 50μL.

ברגע שתגובתך מתוכננת על הנייר, אסוף את הריאגנטים שלך על קרח.

לאחר מכן, הוסף את ריאגנטים שלך לצינור PCR. ראשית להוסיף מים, אז התבנית שלך, פריימרים שלך, חוצץ, מגנזיום כלוריד, ו- dNTPs, להוסיף Taq פולימראז האחרון ולערבב ביסודיות.

לאחר שהתגובה שלך מוגדרת למקם את המדגם שלך תרמוציקלר ולהתחיל את תוכנית PCR. בקצרה, חלקים של המכונה מורכבים thermoblock, שבו צינור PCR או צלחת מוכנס בכפוף לשינויי טמפרטורה מדויקים. מכסה מחומם, המונע עיבוי כך שאף דגימה לא תאבד וממשק עם תצוגה לתכנות טמפרטורות PCR ומשכי מחזור. הגדר תמיד את התוכנית לפני הרכבת התגובה.

ברגע שהתרמו-מחזור עשה את עבודתו. הוציאו את התגובה שלכם ואמתו את מוצר ה-PCR עם אלקטרופורזה של ג'ל. אם ה- PCR מצליח, אתה אמור לראות את האמפליקון בגודל זוג הבסיס הנכון.

ועכשיו לכמה רמזים מועילים בעת עבודה עם PCR. כאשר אתה מנסה להגביר את אותו מוצר PCR ממספר תבניות שונות ולכן יש הרבה תגובות שונות להתקנה. זה שימושי כדי להגדיל את התגובה כדי ליצור תערובת מאסטר. תערובת מאסטר PCR היא תערובת נפח גדול של כל הריאגנטים המשותפים בין הדגימות שלך, אשר מופץ מאוחר יותר לתוך צינורות תגובה מרובים.

רוב תגובות PCR מתחילות בשלב דנטורציה ראשוני, המתרחש ב 95°C במשך 1 עד 9 דקות. שלב זה מבטיח שכל התבנית תיתקע בודדת עבור מחזור ההגברה הראשון.

לעתים קרובות רצוי להשתמש בארון PCR כאשר הסיכון של זיהום המדגם שלך הוא גבוה. כדי לבדוק אם יש זיהום כלשהו בתגובה שלך זה מועיל להגדיר שליטה שלילית, אשר אין תבנית DNA ולא צריך לייצר מוצר בג'ל ה- DNA שלך.

לעתים קרובות PCR חייב להיות מותאם על ידי התאמת טמפרטורות, ריכוז מגנזיום כלוריד, או מנסה פריימרים חדשים. לאחר שה- PCR פועל. מומלץ להפעיל תמיד תבנית בקרה חיובית, אשר לדעתך תפיק מוצר.

וריאציות ויישומים רבים של PCR קיימים למגוון מטרות.

וריאציה אחת של PCR, התחלה חמה PCR, כרוך בהסתרת הפולימראז מהתגובה עד לאחר שלב הדנטורציה הראשון, המונע הגברה לא מדעית שעלולה להתרחש לפני רכיבה על אופניים.

ניתן גם לשנות PCR כדי להגביר בו זמנית רצפי DNA מרובים על ידי שימוש בפריימרים מרובים בתגובת PCR אחת הנקראת מולטיפלקס PCR.

בשילוב עם בדיקות אוליגונוקלאוטיד פלואורסצנטיות, PCR יכול למעשה להפוך לטכניקה שיכולה למדוד רמות יחסיות או מוחלטות של ביטוי גנים או כמה mRNA מיוצר עבור גן נתון או קבוצה של גנים. שיטה זו נקראת qPCR.

PCR יכול לשמש גם כדי לקבוע את נוכחותו של רצף DNA מסוים באורגניזם. הליך זה מכונה genotyping. לדוגמה, genotyping יכול לשמש כדי לקבוע את האותנטיות של דגימות דגים על ידי להבין אם רצף ספציפי למין קיים במדגם. Genotyping משמש גם בניתוח משפטי כדי לקבוע אם DNA נמצא בזירת פשע תואם חשוד.

הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לפי.סי.אר. בסרטון זה סקרנו מה הוא PCR וכיצד הוא עובד, את הרכיבים הרבים של תגובת PCR, את המנגנון שבאמצעותו PCR יכול להגביר את ה- DNA ואת הווריאציות והיישומים הרבים של טכניקה שימושית זו. תודה שצפיתם!

תגובת שרשרת פולימראז, או PCR, היא טכניקה המשמשת להגברת ה- DNA באמצעות תרמוג'ים – גלילות של שינויי טמפרטורה במרווחי זמן קבועים. באמצעות פולימראז DNA תר…