שיטות בסיסיות בביולוגיה תאית ומולקולרית

ניסויים ביו-רפואיים רבים דורשים מניפולציה של כמות ידועה של תאים, על מנת להשיג נתונים מדויקים, ניתנים לשחזור ורלוונטיים סטטיסטית. לכן, לימוד כיצד לספור תאים היא טכניקה חיונית במיוחד עבור כל מדען ביו-רפואי מוצלח. הדרך הנפוצה ביותר לספור תאים היא באמצעות hemacytometer - מכשיר הנושא שתי רשתות חרוט לייזר, אשר מסייעים בספירה של תאי aliquot תחת מיקרוסקופ אור פשוט. לאחר מכן ניתן להשתמש בנתונים אלה כדי להסיק את מספר התאים במדגם ניסיוני. וידאו זה יראה כיצד: להתאים את ריכוז המדגם הניסיוני כך שאתה לא מנסה...

קווי תאים משמשים לעתים קרובות בניסויים ביו-רפואיים, שכן הם מאפשרים תרבות מהירה והתרחבות של סוגי תאים לניתוח ניסיוני. קווי התאים מתורבתים בתנאים דומים בהשוואה לתאים מבודדים טריים, או ראשוניים, אך עם כמה הבדלים חשובים בסיסיים: (i) קווי תאים דורשים קוקטיילים של גורם גדילה ספציפי משלהם ו- (ii) הצמיחה שלהם חייבת להיות מנוטרת באופן הדוק יותר מאשר תאים ראשוניים, שכן המוטציות המאפשרות להם לגדול ללא הגבלת זמן גם יכולות להוביל במהירות לצמיחתם. לכן, כאשר קו תא מגיע לנקודת הצמיחה בתרבות שבה הוא מכסה את רוב...

תגובת שרשרת פולימראז, או PCR, היא טכניקה המשמשת להגברת ה- DNA באמצעות תרמוג'ים – גלילות של שינויי טמפרטורה במרווחי זמן קבועים. באמצעות פולימראז DNA תרמוסטבל, PCR יכול ליצור עותקים רבים של DNA מאבני בניין DNA הנקראות dNTPs. ישנם שלושה שלבים ב- PCR: דנטורציה, חישול והארכות. דנטורציה היא הצעד הראשון במחזור וגורמת לדנ"א להינמס על ידי שיבוש קשרי מימן בין הבסיסים וכתוצאה מכך DNA חד-גדילי. חישול מוריד את הטמפרטורה מספיק כדי לאפשר את כריכת פריימרים אוליגונוקלאוטיד לתבנית ה- DNA. במהלך שלב ההארכה DNA...

אלקטרופורזה של ג'ל דנ"א היא טכניקה המשמשת לגילוי והפרדה של מולקולות DNA. שדה חשמלי מוחל על מטריצת ג'ל המורכבת אגרוז, ובתוך הג'ל, חלקיקי המטען ינדוד וייפרדו בהתאם לגודל. הפוספטים הטעונים השליליים של עמוד השדרה של הדנ"א גורמים לרסיסי דנ"א לנוע לכיוון האנודה - אלקטרודה טעונה חיובית. הסרטון מסביר את המנגנון שבאמצעותו רסיסי דנ"א נפתרים על ג'ל אגרוז, והוא מספק הליך כללי שלב אחר שלב כיצד להכין ג'לים אגרוז, לטעון דגימות DNA, להריץ ג'ל DNA, לדמיין שברי DNA, ולהיפטר כראוי של ג'ל וחיץ פועל לאחר סיום...

נתרן דודסיל סולפט פולי-אקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה, או SDS-PAGE, היא טכניקה נפוצה להפרדת תערובות של חלבונים בהתבסס על גודלם ולא שום דבר אחר. SDS, חומר ניקוי אניוני, משמש לייצור מטען אחיד לאורך חלבונים שהיו ליניאריים. על ידי טעינתם תחילה לתוך ג'ל עשוי polyacrylamide ולאחר מכן החלת שדה חשמלי על הג'ל, חלבונים מצופים SDS מופרדים לאחר מכן. השדה החשמלי משמש ככוח המניע, ומושך את החלבונים מצופים SDS לכיוון האנודה עם חלבונים גדולים יותר הנעים לאט יותר מחלבונים קטנים. על מנת לזהות חלבונים לפי גודל, תקני...

טרנספורמציה היא התהליך המתרחש כאשר תא בולע דנ"א זר מסביבתו. טרנספורמציה יכולה להתרחש בטבע בסוגים מסוימים של חיידקים. בביולוגיה מולקולרית, טרנספורמציה משוחזרת באופן מלאכותי במעבדה באמצעות יצירת נקבוביות בקרומי תאים חיידקיים. תאים חיידקיים המסוגלים לקלוט דנ"א מהסביבה נקראים תאים מוסמכים. במעבדה, תאים חיידקיים יכולים להיות מוכשרים ו- DNA לאחר מכן הציג על ידי הליך שנקרא שיטת הלם חום. שינוי הלם חום משתמש בסביבה עשירה בסידן המסופקת על ידי סידן כלוריד כדי לנטרל את הדחייה האלקטרוסטטית בין ה- DNA...

המונח "טרנספורמציה" מתייחס בליעה תאית של DNA זר. בטבע, טרנספורמציה יכולה להתרחש בסוגים מסוימים של חיידקים. בביולוגיה מולקולרית, לעומת זאת, טרנספורמציה מושרה באופן מלאכותי באמצעות יצירת נקבוביות בקירות התא החיידקי. תאים חיידקיים המסוגלים לקלוט דנ"א מהסביבה נקראים תאים מוסמכים. תאים אלקטרו-קומפטנטיים יכולים להיות מיוצרים במעבדה וניתן להשיג טרנספורמציה של תאים אלה באמצעות יישום של שדה חשמלי היוצר נקבוביות בקיר התא שדרכו DNA יכול לעבור. הסרטון מסביר את הציוד המשמש באלקטרופורציה כגון...

חיסון הקשור לאנזים (ELISA) מבוצע בדרך כלל כדי לזהות את הנוכחות ו/או הכמות של חלבון יעד של עניין בתוך מדגם ניסיוני. זיהוי חלבון היעד מתאפשר על ידי נוגדנים, מה להפוך את ELISA לחיסון. באמצעות סדרה של שלבי דגירה ושטיפה, נוגדנים אלה, המקושרים לעתים קרובות, או מצומדים, לאנזים, יזהו חלבון ציפוי בתחתית באר על צלחת microtiter. כאשר נחשף למצע, אנזים הקשור לנוגדנים יגרום לשינוי צבע, ובכך יציין את נוכחותו של חלבון העניין במדגם. בסרטון זה, התיאוריה שמאחורי אופן העבודה של ELISAs מוסברת, כולל דיון בכריכה...

טיהור פלסמיד הוא טכניקה המשמשת לבודד ולטהר דנ"א פלסמיד מדנ"א גנומי, חלבונים, ריבוזומים ודפנות התא החיידקי. פלסמיד הוא דנ"א קטן, מעגלי, כפול גדילים המשמש כנשא של מולקולות דנ"א ספציפיות. כאשר הוא הוכנס לאורגניזם מארח באמצעות טרנספורמציה, פלסמיד ישוכפל, וייצור עותקים רבים של שבר הדנ"א הנחקר. בסרטון וידאו זה, הליך כללי שלב אחר שלב מתואר כיצד לבצע טיהור plasmid. טיהור Plasmid כולל שלושה שלבים בסיסיים: צמיחת תרבית החיידקים, קצירה ותמיסה של החיידקים, וטיהור ה- DNA הפלסמיד. הסרטון מכיל הסבר שבו ניתן...

טיהור ג'ל משמש לשחזור שברי DNA לאחר הפרדה אלקטרופורטית. שחזור DNA מג'ל אגרוז כולל שלושה שלבים בסיסיים: כריכה, כביסה ואלגנטיות מעמוד סיליקה. DNA הוא האמין להיקשר סיליקה בנוכחות מלח גבוה דרך גשר מלח. לאחר הכריכה, DNA נשטף מטומאים ונבהר בתנאי מלח נמוכים המפריעים לאינטראקציה זו. וידאו זה עובר צעד אחר צעד, הליך כללי לחיתוך רצועה מן הג'ל, סולוביליזציה ג'ל, טיהור באמצעות כריכה לעמוד סיליקה, ו elution של DNA מטוהר. בנוסף, המצגת דנה במספר טיפים להבטחת טיהור ג'ל מוצלח, כולל החשיבות של הפעלת ג'ל אגרוז...

סופג מערבי משמש לזיהוי נוכחות של חלבונים ספציפיים בדגימות מופרדות אלקטרופורטית. בעקבות הפרדה על ידי טכניקה המכונה נתרן דודסיל סולפט polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה, או SDS-PAGE, העברה מערבית משמשת להעברת חלבונים מג'ל polyacrylamide על פיסת ממברנה אשר לוכד את החלבונים במקומות המתאימים שלהם. לאחר מכן, הממברנות נבדקות עם נוגדנים בתהליך שנקרא אימונובלוט. אימונובלוטינג משתמש בחלבון נוגדנים ונוגדנים מחייבים דרך אתרי זיהוי ספציפיים, ומספקים את הספציפיות הגבוהה הנדרשת לזיהוי חלבון יחיד. איתור...

טרנספקטיון הוא תהליך של החדרת חומר גנטי, כגון DNA ורנ"א נטוש כפול, לתאי יונקים. החדרת DNA לתא מאפשרת ביטוי, או ייצור, של חלבונים המשתמשים במכונות של התאים עצמם, ואילו החדרת RNA לתא משמשת לווסת את הייצור של חלבון מסוים על ידי הפסקת התרגום. בעוד אתר הפעולה עבור RNA transfected הוא ציטופלסמה, DNA חייב להיות מועבר לגרעין עבור transfection יעיל. שם, הדנ"א יכול להתבטא באופן ארעי לפרק זמן קצר, או להשתלב בדנ"א הגנומי, שם השינוי מועבר מתא לתא כשהוא מתחלק. וידאו זה מתאר את היסודות מאחורי transfections...

בביולוגיה מולקולרית, קשירה מתייחסת לצירוף של שני שברי DNA באמצעות היווצרות של קשר זרחן. אנזים המכונה ליגאז מזרז את תגובת קשירה. בתא, רצועות לתקן הפסקות גדיל יחיד וכפול המתרחשות במהלך שכפול DNA. במעבדה, קשירת DNA משמשת במהלך שיבוט מולקולרי כדי להצטרף לרסיסי DNA של תוספות עם וקטורים – מולקולות DNA נשאיות שישכפלו שברי מטרה באורגניזמים מארחים. וידאו זה מספק מבוא לקשירת DNA. העיקרון הבסיסי של קשירה מתואר, כמו גם הליך שלב אחר שלב להגדרת תגובת קשירה כללית. היבטים קריטיים של תגובות קשירה נדונים,...

הגבלת אנזימים או אנדונוקלאזים מזהים וחותכים דנ"א ברצף מסוים. אנזימים אלה מתרחשים באופן טבעי בחיידקים כהגנה מפני בקטריופאג'ים - וירוסים שמדביקים חיידקים. אנזימי הגבלת חיידקים חותכים את הדנ"א הבקטריופאז' הפולש תוך השארת הדנ"א הגנומי החיידקי ללא פגע עקב תוספת של קבוצות מתיל. וידאו זה מסביר את העקרונות הבסיסיים של אנזימי הגבלה כולל: כיצד אנזימי הגבלה נקראים וסוגי אתרי זיהוי ו overhangs הקיימים. כמו כן מסופק הליך כללי צעד אחר צעד כיצד להגדיר תקציר הגבלה כולל הרכיבים הדרושים, את הסדר שבו יש להרכיב...

שיבוט מולקולרי הוא מערכת של שיטות, המשמשות להחדרת דנ"א רקומביננטי לווקטור - נשא של מולקולות דנ"א שישכפלו שברי דנ"א רקומביננטיים באורגניזמים מארחים. שבר הדנ"א, שעשוי להיות גן, יכול להיות מבודד מדגם פרוקריוטי או אאוקריוטי. לאחר בידוד של שבר העניין, או להוסיף, הן הווקטור ואת ההוספה חייב להיות חתוך עם אנזימי הגבלה מטוהר. החלקים המטוהרים מחוברים יחד למרות טכניקה הנקראת קשירה. האנזים שמזרז את תגובת קשירה ידוע בשם ליגאז. וידאו זה מסביר את השיטות העיקריות המשולבות, בד בבד, כדי לכלול את הליך השיבוט...