אלקטרופורזה של ג'ל דנ"א

DNA Gel Electrophoresis היא טכניקה המשמשת להפרדה ולזיהוי שברי DNA בהתבסס על גודל.

שברי דנ"א בגדלים שונים נטענים בג'ל נקבובי העשוי מאגורוז – פחמימה שנמצאת באצות אדומות.

כאשר שדה חשמלי מוחל, השברים ינדדו דרך הג'ל, הודות לקבוצות הפוספט הטעונות השליליות בנוקלאוטידים של ה- DNA.

חתיכות קטנות יותר של DNA ינועו בקלות רבה יותר דרך הג'ל מאשר שברים גדולים יותר, אשר מתקשים יותר לנוע דרך מטריצת הג'ל.

כאשר ריצת הג'ל הושלמה ניתן להשוות את המיקום של דגימות ה- DNA שלך לסדרה של שברים או רצועות בגדלים ידועים, הנקראים סולם DNA.

לאחר מכן ניתן לאשר את נוכחותו של שבר העניין שלך בהתבסס על גודלו, אשר נקבע על ידי השוואת המיקום היחסי של דגימת הבדיקה שלך לרסיסי הסולם.

ג'לים אגרוז מוכנים באמצעות פתרון אחוז משקל מעל נפח. אז 1 גרם של אגרוז ב 100 מ"ל של חוצץ יעשה ג'ל 1%. ג'לים באחוז נמוך יותר יפתרו טוב יותר שברים גדולים יותר וג'לים באחוז גבוה יותר יקלו על זיהוי שברים קטנים יותר. כדי להתחיל את הליך הכנת הג'ל, לשקול את המסה המתאימה של agarose לתוך בקבוקון ארלנמאייר.

הוסף מאגר פועל לבקבוקון, כך שנפח המאגר אינו עולה על 1/3 מקיבולת הבקבוקון. ואז מערבבים לערבב.

ממיסים את תערובת האגרוז/חיץ על ידי חימום במיקרוגל בעוצמה מרבית. כל שלושים שניות, להסיר את הבקבוקון מערבבים את התוכן לערבב היטב. חזור על הפעולה עד שהאגרוז יתמוסס לחלוטין.

הבא להוסיף אתידיום ברומיד לריכוז של 0.5 מ"ג / מ"ל. אתידיום ברומיד הוא תרכובת ארומטית שמתאימה בין זוגות בסיס בודדים של DNA, או intercalates, וגורם DNA לפלוט פלואורסצנטיות כתומה אינטנסיבית תחת אור UV. חשוב לציין כי אתידיום ברומיד הוא מסרטן ולכן כפפות תמיד צריך להיות משוחק בעת טיפול ג'לים המכילים תרכובת זו.

כדי למנוע את מגש הג'ל מפני עיוות, תן אגרוז להתקרר על ידי הצבתו באמבט מים 65 מעלות צלזיוס.

כמו agarose הוא קירור, להכין את תבנית ג'ל על ידי הצבת מגש הג'ל לתוך מנגנון הליהוק. כחלופה, אתה יכול להשתמש בסרט כדי לאטום את הקצוות הפתוחים של מגש הג'ל כדי ליצור את התבנית. הצבת מסרק לתוך הג'ל יוצרת את הבארות שבהן DNA טעון. ודא שהמסרק ייצור באר בגודל המתאים לדגימת הדנ"א שלך.

יוצקים את האגרוז המותך לתבנית הג'ל ומאפשרים לה להקשיח בטמפרטורת החדר.

אחרי שהאגורוז יתקשה, תוציא את המסרק. אם הג'ל לא הולך לשמש מיד, לעטוף אותו בניילון נצמד ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד השימוש.

אם הג'ל הולך לשמש מיד, למקם אותו בקופסת הג'ל.

כדי להתחיל בהליך זה, הוסף צבע טעינת ג'ל לדגימות ה- DNA שיש להפריד. טעינת צבע נעשית בדרך כלל בריכוז של פי 6. טעינת צבע מסייעת לדמיין ולטעון דגימות לתוך הבארות ומסייעת לקבוע כמה רחוק הדגימות עברו במהלך הריצה.

הגדר את ספק הכוח למתח הרצוי.

עכשיו להוסיף מספיק חוצץ פועל לתוך תיבת הג'ל כדי לכסות את פני השטח של הג'ל. הקפד להשתמש באותו מאגר פועל כמו זה המשמש להכנת הג'ל.

חבר את הלידים של קופסת הג'ל לאספקת החשמל והפעל אותה. זכור כי DNA טעון שלילית יעבור לכיוון האנודה, שהיא חיובית, ובאופן כללי בצבע אדום. הקפד לא לחבר את העופרת השחורה, או קתודה, לתחתית קופסת הג'ל. אז אתה לא שוכח, יש לזכור כי חתולים שחורים הם מזל רע, או שלילי, ואת CAThode השחור הוא ולכן שלילי. תריץ את הג'ל שלך לאדום, או את האנודה. כדי לוודא שגם תיבת הג'ל וגם ספק הכוח פועלים; הופעת הבועות באלקטרודות מצביעה על כך שהזרם עובר.

הסר את המכסה של קופסת הג'ל. טוען לאט ובזהירות את דגימות הדנ"א לתוך הג'ל. שוב, צבע הטעינה במדגם מאפשר לדגימה לשקוע לתוך הג'ל ויעזור לעקוב אחר כמה רחוק המדגם נסע. סמן גודל DNA, או סולם, תמיד צריך להיות טעון יחד עם הדגימות הניסיוניות.

החלף את המכסה. בדוק שוב שהאלקטרודות מחוברות לחריצים הנכונים באספקת החשמל.

תדליק את החשמל. הפעל את הג'ל עד שהצבע ינדדה למרחק מתאים.

כאשר הריצה אלקטרופורזה הושלמה, לכבות את ספק הכוח ולהסיר את המכסה של תיבת הג'ל.

הסר את הג'ל מקופסת הג'ל ולנקז את חוצץ עודף על פני השטח של הג'ל. מניחים את מגש הג'ל על מגבות נייר כדי לספוג כל מאגר פועל שנותר.

כדי לדמיין את שברי ה- DNA, הסר את הג'ל ממגש הג'ל וחשוף את הג'ל לאור סגול במיוחד.

שבר דנ"א אמור להופיע כלהקות פלואורסצנטיות כתומות. צלם תמונה של הג'ל.

בסוף הניסוי, יש להיפטר כראוי מהג'ל ואת מאגר הריצה לפי תקנות המוסד. שוב, זכור תמיד להתמודד עם ג'ל וריצה חוצצים עם כפפות כדי למנוע חשיפה אתידיום ברומיד.

עכשיו שראית איך לבצע אלקטרופורזה של ג'ל דנ"א. בואו נסתכל על כמה יישומים במורד הזרם וריאציות של שיטה שימושית מאוד זו.

כאן אתה רואה תוצאה אלקטרופורזה ג'ל אגרוז לאחר הפרדת מוצרי PCR. שברי הדנ"א שנטענים לתוך הג'ל נראים כמו רצועות מוגדרות בבירור. תקן ה- DNA או הסולם צריך להיות מופרד במידה המאפשרת את הקביעה השימושית של הגדלים של רצועות מדגם. בדוגמה זו, שברי DNA של 765 זוגות בסיסים, 880 זוגות בסיסים וזוגות בסיס 1022 מופרדים על ג'ל אגרוז 1.5% עם סולם DNA 2-log.

בנוסף לאישור נוכחות של שבר DNA של עניין, אלקטרופורזה ג'ל DNA יכול להיות משולב עם הליכי טיהור ג'ל. בדרך כלל סכין גילוח משמש כדי לחתוך את שבר ה- DNA של עניין, כך שניתן לאסוף אותו ואת דגימת ה- DNA בתוכו התאושש.

אלקטרופסיס ג'ל אגרוז יכול גם להיות משולב עם סופג העברה, אשר כרוך המאפשר DNA, או RNA, לעבור לממברנה תאית שבו בדיקות רדיואקטיביות ניתן להשתמש כדי לזהות רצפי DNA או RNA ספציפיים במדגם המופרד אלקטרופורטית שלך.

אלקטרופורזה ג'ל DNA סטנדרטי אינו אידיאלי להפרדה של DNA במשקל מולקולרי גבוה גדול מ 15-20 kb בגודל, כמו DNA גנומי. כדי להפריד דגימות DNA גדולות, נעשה שימוש באלקטרופורזה של ג'ל שדה דופק, הכולל חשיפת הג'ל לשדה חשמלי משתנה, או פועם, בכיוונים שונים. טכניקה זו כוללת מנגנון ריצה ג'ל מיוחד, אשר יש זוגות של אלקטרודות ערוכים באוריינטציות שונות סביב הג'ל. זה יכול לשמש כדי לזהות הבדלים בגדלי הגנום בין אוכלוסיות של אורגניזמים, כמו דגימות DNA מקהילות מיקרוביות שונות, אתם רואים כאן אשר נלקחים מסביבות אגם שונות.

הרגע ראית הקדמה לאלקטרופורזה של ג'ל דנ"א. הראינו לכם את הרעיון שמאחורי השיטה, כיצד להכין את ג'ל אגרוז, כיצד לטעון את הדגימות שלכם, כיצד להפעיל את הג'ל, ולנתח אותו וכמה יישומים נפוצים של אלקטרופורזה ג'ל אגרוז. תודה שצפיתם ובהצלחה עם הפעלת הג'ל שלכם.