דגי ה-DNA 3D חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור את הארגון המרחבי של מיקומים גנומיים ספציפיים בתאים בודדים בצורה חזקה. זה מושג על ידי יצירת בדיקות עם תווית פלואורסצנטית כדי לקשור ולהדגיש בסופו של דבר את אזור העניין הגנומי. השלבים הבאים הם להיצמד, לתקן ולחלחל תאים מעניינים בשקופית על מנת לאפשר גישה לבדיקה.

לאחר מכן דנטורציה של חום בו זמנית של בדיקה ו-DNA תאי מלווה בשלבי שטיפת הכלאה של בדיקה למשך הלילה כדי להסיר בדיקה שאינה קשורה במיוחד ועמידה נגדית עם dpi. כדי לדמיין את גרעין התא, תוצאות המתקבלות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית יחשפו בסופו של דבר את המיקום הגרעיני שתופסים אזורים גנומיים ספציפיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הארגון הגרעיני, כגון קביעת אינטראקציות תפקודיות בין גנים.

היתרון העיקרי של פרוטוקול DNA FISH הספציפי הזה הוא שהוא מהיר, חזק ורב-תכליתי. למרות שאנו מדגימים שיטה זו באמצעות תאי E E, ניתן ליישם אותה גם על סוגי תאים רבים אחרים, בדיקות מתויגות ישירות העשויות מגב של 100 עד 250. בסיסי קילו-בסיסים מייצרים באופן עקבי אותות בהירים אם נדרשים בדיקות קטנות יותר.

השתמש ב-40 עד 50 קילו-בסיס, או אפילו בפלסמידים המכילים חמישה עד 10 קילו-בסיסים. זהה את השיבוטים האחוריים או הקטנים המתאימים לגנים ספציפיים באמצעות דפדפני הגנום של האנסמבל או UCSC. כדי להכין DNA אחורי באיכות גבוהה השתמש במשקעים חוזרים או בערכה זמינה מסחרית, ניקיון התכשיר פרופורציונלי לנפח הבדיקה הנדרש.

בצע את התיוג בשני שלבים. ראשית, השתמש בתרגום NIC כדי להציג אלל אמינו, DUTP. שנית, השתמש בצימוד כימי כדי לחבר צבע תגובתי ממוצע AM.

כדאי להשקיע זמן בהכנת בדיקות בהירות מכיוון שהן קריטיות לאותות דגים חזקים. הליך זה יכול להתבצע במקביל לטיפול בתאים ואינו חייב להיעשות בתחילת היום. תחילה ערבב 10 עד 20 ננוגרם של בדיקה עם תווית ישירה עם שישה מיקרוליטר של CO 1D NA עבור שישה מיקרוגרם.

לאחר מכן הוסף מיקרוליטר אחד של DNA חד-גדילי מאשכי סלמון עבור 9.7 מיקרוגרם. התאם את נפח התערובת ל -100 מיקרוליטר עם מים. לאחר מכן, מוסיפים 10 מיקרוליטר של שלושה נתרן אצטט טוחנת ו -275 מיקרוליטר אתנול ומערבבים על ידי מערבולת.

הניחו לתערובת לשקע לפחות שעה במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, סובב את המשקעים במיקרו פוגה במהירות מקסימלית למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את הגלולה עם אתנול 70% וסובבו אותה שוב למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן יבש את הגלולה באוויר. ואז החייאה. השעו אותו בחמישה מיקרוליטרים של צורה דה-יונים.

אמיד ב-37 מעלות צלזיוס תוך כדי טלטול ב-1000 סל"ד אתה מרדיד כדי להגן עליו מפני אור. לאחר 30 דקות מוסיפים חמישה מיקרוליטר תערובת דקסטרין גופרתי וממשיכים בדגירה בתסיסה. במשך 10 דקות נוספות, נטיית התאים לדבוק בשקופית משתנה מאוד בהתאם לסוג התא.

עבור כל סוג תא, קבע את זמן ההתייצבות האופטימלי ואת צפיפות התאים באופן אמפירי. לקבלת תוצאות עקביות, התאים צריכים להיות בתרחיף תא בודד כדי להדביק תאי ES של עכבר בשקופית. התחל בסיבוב האזור בשקופית שבו התאים יזוהו.

בעזרת עט הידרופובי, הכינו תרחיף של 20 עד 50,000 תאים לכל 80 עד 100 מיקרוליטר במדיום תרבית רגיל, הוסיפו את תרחיף התאים למעגל ואפשרו לתאים להיצמד כשלוש שעות באינקובטור לח. לאחר חיבור השקופית, תקן את התאים על ידי טבילה עדינה של השקופית ב-4% PFA למשך 10 דקות. השקופית צריכה להיות שטוחה במגש כמו קופסת טיפים.

שימוש בריאגנטים בטמפרטורת החדר בצנצנות קופלן. ראשית מרווים את התאים עם טריס כלוריד למשך 10 דקות. שנית, חלחל את התאים באמצעות תערובת סאפין וטריטון X 100 למשך 10 דקות.

כעת שטפו את התאים פעמיים ב-PBS למשך חמש דקות לכל שטיפה. לאחר השטיפות דוגרים על התאים ב-20% גליצרול למשך 20 דקות לפחות. בשלב זה, ניתן לאחסן את השקופיות ב-50% גליצרול במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.

אחסון למשך יום או יותר אמור להגביר את עוצמת האות. הקפד לאזן את התאים לטמפרטורת החדר ב-20% גליצרול ב-PBS לפני שתמשיך. כעת, הקפיאו והפשירו את השקופית שלוש פעמים באמצעות חנקן נוזלי.

שקופית אחת בכל פעם כשצליל הפצפוץ נפסק. לאחר מספר שניות, הסר את השקופית למגבת נייר כדי להפשיר המתן עד שהגליצרול הקפוא האטום ייעלם לפני הקפאת המגלשה שוב, ניתן לבצע עד 15 שקופיות בנוחות בסיבוב במשך שלושה מחזורי הפשרת הקפאה. כעת שטפו את השקופיות פעמיים ב-PBS למשך חמש דקות לכל כביסה.

לאחר מכן דגרו את המגלשות בחומצה הידרוכלורית 0.1 מולרית למשך 30 דקות. עקוב אחר הטיפול בחומצה הידרוכלורית עם שטיפה נוספת של חמש דקות ב-PBS. כעת סלסל את התאים שוב עם סאפין חזק יותר ומערבבים טריטון X 100 למשך 30 דקות כדי לשטוף את פעילי השטח מהשקופיות, השתמש בשתי שטיפות PBS של חמש דקות.

השקופיות מוכנות כעת לשיווי משקל בצורת אמיד של 50% ל-XSSC. זה היה אמור להימשך לפחות 10 דקות תוך כדי שיווי משקל, לאחזר את הגשושית למעלה ולמטה כמה פעמים ואז להעביר 10 מיקרוליטר לכל נקודת תא להחלקת כיסוי בגודל המתאים. הסר שקופית מהצורה אמיד וייבש את כל עודפי הנוזלים סביב התאים בעזרת מגבת נייר, אך אל תאפשר לנקודת התא להתייבש.

עכשיו הפוך את הכיסוי. החלק אל השקופית מעל התאים. אטום את החלקת הכיסוי למגלשה בעזרת מלט גומי.

הניחו למלט להתייבש לחלוטין ושמרו על המגלשה מוגנת מפני אור. לאחר מכן, מחממים את המגלשות ל -78 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות בדיוק על פלטה חמה. זה קריטי לביצוע תקין.

כיסוי חייב להגן על התאים מפני אור במהלך שלב זה כדי לשמר את המורפולוגיה הגרעינית ככל האפשר. זה קריטי לא לתת לתאים להתייבש ולוודא שלמיקום החום יש את הטמפרטורה הנכונה. לאחר מכן, הניחו את השקופיות בקופסה אטומה עם מגבות נייר לחות כדי לספק לחות ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

התחל הליך זה על ידי קילוף מלט הגומי מסביב להחלקות הכיסוי. לאחר מכן הנח כל שקופית לתוך X עודף SC עד שהכיסוי מחליק, משתחרר ומחליק. לאחר מכן, שטפו את השקופיות בצורת אמיד של 50% בשני x SC עודפים למשך 15 דקות בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס.

שמור מכסה על אמבט המים כדי להגן עליהם מפני אור. לאחר מכן שטפו את השקופיות ב-0.2 XSSC למשך 15 דקות בחום של 63 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שני XSSC למשך חמש דקות ב-45 מעלות צלזיוס, ולבסוף לעודף SE בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

השלבים הנותרים הם כולם בטמפרטורת החדר, החל מכביסה של חמש דקות ו-PBS כעת מכתים את השקופיות ב-dappy למשך שתי דקות ואז מעכבים את השקופיות עם PBS למשך חמש דקות. כדי להרכיב את החלקת הכיסוי, החל 10 מיקרוליטר של מדיום הרכבה לכל נקודת תא על פתק הכיסוי בגודל המתאים. לאחר מכן יבש את עודפי PBS מסביב לנקודת התא מבלי לתת לתאים להתייבש.

הפוך את המכסה, החלק על שקופית ואטום אותה בלכה באמצעות פרוטוקול הכנת בדיקת הדגים. לאחר תרגום NIC, מריחה של DNA אמורה להיות גלויה כאשר עיקר השברים נעים בין 150 ל-700 זוגות בסיסים. לאחר צימוד כימי, ניתן לאמוד את שילוב הצבע הפלואורסצנטי על ידי ניתוח ספקטרוסקופי של מעבר הגשושית.

שלבי בקרת איכות אלה כדי לשפוט את איכות הבדיקה הם קריטיים על ידי שימוש בבדיקה כזו. הדמיה אוטומטית עם מיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי הייתה אפשרית. זה דורש אותות דגים חדים וניתנים לזיהוי בקלות עם רקע מועט.

זוהי תמונת שדה ראייה גולמית. התמונות הבאות מייצגות גרעינים שזוהו ונותחו באופן אוטומטי. מרחקים בין-אלליים ובין-לוקוס שונים מוצגים למעלה מימין ומשני הצדדים מתחת לכל גרעין.

בהגדלה זו, כתמים לבנים מייצגים את הגרעינים המזוהים לכל שדה ראייה. היסטוגרמות אלה מציגות מרחקים בין-אלליים מקסימליים בין אותות ירוקים למעלה לאותות אדומים מתחת. כל הנתונים הם מתאי נבט P 20 עם בדיקות הממוקמות על כרומוזומים שונים המכסים את הגנים HBB ו-HBA ואשכול היסטון.

אלו הן דוגמאות לגרעיני כבד עובריים מוכתמים בבדיקות גב המכסות את הגנים מיקרופון ו-KC ו-Q1. מתמונות אלה ניתן לקבל קואורדינטות גרעיניות של אותות דגים ולחשב יחסים מרחביים של אזורים גנומיים. מרחקים בין-אלליים משורטטים כשבריר מרדיוס הגרעין.

בדיקות אדומות היו קרובות יותר זו לזו באופן משמעותי מאשר בדיקות ירוקות בנתונים אלה. מיקרוסקופיה קונפוקלית, הדורשת אותות אינטנסיביים יותר הייתה אפשרית גם היא. ערימות תמונות שימשו למידול תלת מימדי של אותות דגים בטריטוריות הכרומוזומים שלהם.

שני הבדיקות הללו באדום ולבן קרובות לשני קצות כרומוזום העכבר שבעה צבע כרומוזום שלם מוצג בירוק. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע דגי DNA על מנת לחקור את המיקום המרחבי של מיקומים גנומיים ספציפיים בתאים בודדים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שכל טיפול עשוי להשפיע על הארכיטקטורה הגרעינית וחשוב לכלול מתאים ביצוע הליך זה.

שיטות אחרות כמו דגים חיסוניים יכולות להתבצע על מנת לענות על שאלות נוספות כמו יחסים מרחביים בין גנים וחלבונים.