Name: דגי ה-DNA 3D חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: למדו פרוטוקול DNA FISH תלת-ממדי עם בדיקות פלואורסצנטיות מסומנות ישירות לניתוח ארכיטקטורה גרעינית. שיטה זו מאפשרת חקירת ארגון מרחבי של לוקוסים גנומיים בתאים בודדים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי BBSRC וקרן Wellcome. ברצוננו להודות לסיימון ווקר לקבלת סיוע עם הדמיה ופליקס קרוגר לעזרה עם ניתוח bioinformatic.

<ol><li>Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+transcription%3A+shaping+the+landscape+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Replication and transcription: shaping the landscape of the genome.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 669-677 (2005).</li>
<li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+sequence%3A+cellular+organization+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (1016).</li>
<li>de Wit, E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+3C+technologies%3A+insights+into+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization.</a> Genes Dev. 26, 11-24 (2012).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York, USA. (2000).</li>
<li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome Res. 19, 901-909 (2011).</li>
<li>Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+nuclear+proteins+together+with+transcribed+and+inactive+genes+in+structurally+preserved+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells.</a> Methods. 26, 10-18 (2002).</li>
<li>Hewitt, S. L., Yin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nat. Immunol. 10, 655-664 (2009).</li>
<li>Solovei, I., Cavallo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+preservation+of+nuclear+chromatin+architecture+during+three-dimensional+fluorescence+in+situ+hybridization+%283D-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Spatial preservation of nuclear chromatin architecture during three-dimensional fluorescence in situ hybridization (3D-FISH.</a> Experimental Cell Research. 276, 10-23 (2002).</li>
<li>Solovei, I. FISH on three-dimensionally preserved nuclei. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolovei%2C+I+%22FISH%3A+A+Practical+Approach%22">FISH: A Practical Approach</a>. Beatty, B., Mai, S., Squire, J. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).</li>
<li>Krueger, C., King, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pairing+of+homologous+regions+in+the+mouse+genome+is+associated+with+transcription+but+not+imprinting+status%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pairing of homologous regions in the mouse genome is associated with transcription but not imprinting status.</a> PLoS One. 7, e38983(2012).</li>
<li>Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on Cultured Cells Combined with Immunostaining. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolovei%2C+I+%22Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29%3A+Protocols+and+Applications%22">Fluorescence in situ hybridization (FISH): Protocols and Applications</a>. Bridger, J. M., Volpi, E. V. , Humana Press. New York, New York, USA. (2010).</li>
</ol>

ההפקה של מאמר זה באופן חלקי בחסות Zeiss וMetaSystems קארל.

דגי ה-DNA 3D הפך לכלי להכרה רחבה לנתח סידורים מרחביים בגרעין. בעוד דגים מספק תוצאות חזותיות וישירה, כמו בכל טכניקה, צריך להיות מודעים למגבלותיו. דגי ה-DNA בפני הבעיה המהותית שטיפולים קשים יחסית יש צורך להפוך את הכרומטין נגיש לבדיקות דגים שסופו של דבר משבשים את מבנה הדבר מאוד הגרעיני שהוא להיות מנותחים. כמה אסטרטגיות כבר רדף ללהטט נגישות ושימור מבנה. בפרוטוקול המתואר כאן, ה-DNA הכרומוזומלי נעשתה נגיש על ידי permeabilization הקפאת הפשרה של תאים וDenaturation חום לפני ההכלאה חללית. Solovei, et al., (2002) ניתחו שינויים מבניים לאחר טיפול דומה ומצא כי התזוזה הממוצעת של תחומים הכרומטין הייתה 300 ננומטר אשר מגביל את הרזולוציה של ניתוח מבני לאזורים בערך 1 MB בגנום 8. אמנם זה לא ברזולוציה גבוהה, זההוא בקנה מידה סבירה לניתוח עמדה גרעינית. שיקול מעשי יותר לניתוח דג הוא שרכישת תמונה ומדידות של מרחקים גרעיניים הן תהליכי זמן רב המגבילים את מספר הגרעינים שניתן לנתח. על מנת ללמוד אירועים נדירים שמטרתם לעשות הדמיה אוטומטית קצב העברת נתונים גבוהה. ואז, עם בקרות מתאימות במקום, ניתן להשוות בכמות מספקת כדי לאפשר ניתוח סטטיסטי חזק של יחסים מרחביים. אנו שגרתי לנתח 600 גרעינים לכל נקודת נתונים שעבורו אנו קובעים את קואורדינטות 3D של כל אותות הדגים בתוך הנפח הגרעיני. נתונים אלה דורשים שטח אחסון קטן מאוד ומאפשרים ניתוח של מרחקים בין משפחות ותוך allelic, או עמדות רדיאליים בכל שלב מאוחר יותר. יתר על כן, אפשר לעשות עיבוד אוטומטי באופן עיוור חוקר אשר מקטין באופן משמעותי את הסבירות להטיה לא מודעת. כדי לאפשר לanalys תפוקה גבוהה מסוג זההוא, המטרה שלנו הייתה להקים בדרך מהירה ויעילה של ביצוע דגי ה-DNA. מצאנו הפרוטוקול מתואר כאן להיות מאוד חזק, באופן עקבי לייצר אותות בהירים עם רקע נמוך. זה עבד לכל סוגי התאים שניסינו סיפק לנו להתאים את הצעד של הצמדת התאים לשקופית. יתר על כן, עם חריג אחד, כולנו משמשים Bács יכול להפוך לבדיקות בהירות. יש לנו גם זוהו בהצלחה מספר החלבונים גרעיניים על ידי מכתים נוגדן לאחר דגי ה-DNA. בעוד עבור חלבונים מסוימים זה עובד טוב, אנו ממליצים השוואה עם immunofluorescence המסורתי (IF) על מנת להבטיח עקביות של דפוס מכתים הנוגדן בין אם ודגים חיסוני דנ&quot;א (השווה 11). באופן כללי, מצאנו כי בדיקות שכותרת בצבעים שונים הפיקו את אותן תוצאות. עם זאת, יש לשקול את ההיבטים הבאים בעת בחירת צבע הסימון. ראשית, הצבע של fluorophore צריך להיות גם לזיהוי על ידי u מיקרוסקופSED. שנית, אורך הגל של האור הנפלט על ידי fluorophores צריך להיות שונה במידה מספקת, כדי למנוע דימום דרך לערוץ האחר. זה יהיה תלוי במסננים במיקרוסקופ. והשלישי, לפחות בידיים שלנו, כמה צבעים לייצר אותות בהירים יותר באופן עקבי יותר מאחרים. יש לנו תמיד משמשים DAPI (כחול) כcounterstain שהופך אלקסה פלואוריד 555 (אדום), 488 (ירוק), ו647 (הרבה אדום) בחירות טובות עבור תיוג בדיקות. עם מערכת ההדמיה שלנו, מצא אלקסה פלואוריד 555 (אדום) כדי לייצר את האותות הבהירים ביותר, ואחריו Alexa פלואוריד 488 (ירוק). יש Alexa פלואוריד 647 (הרבה אדום) חסרון שלא ניתן לאתר אותו על ידי העין האנושית ולכן לא ניתן לראות אותות כשמסתכלים למטה למיקרוסקופ. לכן, אם עושים דגים בשני צבעים, אנו ממליצים על שילוב של צבעים אדומים וירוקים. שתי בעיות עיקריות שעשויות להתעורר: תאים לשטוף מעליו את השקופיות ואותות חלשים. כיצד תאים גם לדבוק בשקופית היא betw עצומה משתנהסוגי een סלולריים, ואת הפרוטוקול הטוב ביותר ליישב / תאי זרע צריך להיות נחושים. אנחנו השתמשנו בהצלחה גם מטען חשמלי חיובי או שקופיות מצופות פולי-L-ליזין (קנה מוכן לשימוש), אבל מצא תאים בדרך כלל דבקו טובים יותר לשקופיות מצופות פולי-L-ליזין. מצאו גם כי כאשר תאים היו אזורים שלמים צפופים מדי הייתם להתקלף כמו סדין, ואילו הדמיה אוטומטית הכבידה אם התאים היו דלילים מדי. לכן, אם המדגם הוא לא יקר מדי, יש זורעים מספרי תאים שונים כדי לקבוע את הצפיפות האידיאלית. אם תאים נוטים לשטוף במיוחד, ניתן להשתמש בעט מחסום הידרופובי, וניתן לבצע את הפעולות דגים על ידי pipetting בזהירות פתרונות ישירות על גבי שקופית. גם מפחית באופן דרסטי Pipetting הכרכים של חומרים כימיים הנחוצים, אבל לוקח זמן רב יותר במידה ניכרת כאשר עושה מספר שקופיות. אותות חלשים הם בדרך כלל עקב בדיקות עניות, וזה בהחלט שווה להשקיע את הזמן לעשייה טוב. הנקי BAC-DNA יש להשתמשד כחומר מוצא אשר ניתן להשיג על ידי משקעים חוזרים ונשנים או ערכות זמינות מסחרי. זיהום חיידקים עם הדנ&quot;א הגנומי משפיע לרעה על איכות בדיקה וטיפול זהיר במהלך תמוגה תא וסינון של lysate התא נדרש כדי לשמור אותו למינימום. , היא, לעומת זאת אין צורך להשתמש בצעד exonuclease לעיכול ה-DNA ליניארי, כמו זה מפחית תשואה במידה רבה. תיוג יעיל של הבדיקה הוא קריטי. בקרת האיכות החשובה ביותר של שלב זה היא לבדוק את גודל השבר לאחר תרגום ניק (ראה נציג תוצאות). למרוח &#39;טוב&#39; כמעט תמיד יגרום לחללית צבעונית. עם זאת, מצאנו שמדי פעם BAC מסוים לא יכול להיות מעובד לתוך חללית טובה, וBAC שונה צריך להיות נבחרים. צעד חשוב נוסף הוא denaturation חום. אם הטמפרטורה נמוכה מדי, ה-DNA יהיה רק ​​באופן חלקי מפוגל וכלת חללית תהיה לקויה. אם הטמפרטורה גבוהה מדי, מבנה הגרעיני wiתהיה מוטרד יותר ממה שנחוץ. בידיים שלנו, 78 מעלות צלזיוס בבלוק חם הפוך היא הפשרה האידיאלית, אבל זה עשוי להשתנות בהתאם לבלוק החם המתאים בשימוש. היו לנו תוצאות טובות באמצעות הרכבה בינונית Vectashield, אבל גילינו שיש לו פחות זהב SlowFade רקע ומשמר את אות הניאון למשך זמן ארוך יותר. אנו לא ממליצים על שימוש בהרכבה בינונית קשה להגדיר כפי שמצאנו את זה כדי להשפיע על מבנה 3D וליצור בועות אוויר לאורך זמן. לסיכום, בהיר בדיקות ניאון ישירות כותרתו יחד עם פרוטוקול FISH-DNA תואר כאן מציעות פתרון יעיל לניתוח חזק ומהיר של ארכיטקטורה גרעינית אשר חל על מגוון רחב של שאלות ביולוגיות.

ה-DNA הקרינה הכלאה באתר (FISH-DNA) מאפשרת הדמיה תלת ממדית של לוקוסים בודדים גן, תחומים subchromosomal וכרומוזומים אפילו כולו בכל שלבי מחזור החיים של התא. דגי 2D משמש למחקרי metaphase בעוד דגי 3D כבר נעשו שימוש נרחב כדי לחקור את הקשר בין הארגון המרחבי של הגנום ותפקודו במהלך שלבי ביניים (1,2 והפניות בו). מבחינה היסטורית, מחקרי שיתוף עמותה בוצעו על ידי חקירת עשרות עד מאות בודדים לוקוסים על ידי דגים. טכניקות רב עוצמה גבוהות יותר לאחרונה תפוקה מבוססת 3C כגון 4C וHi-C פותחו 3, המאפשרות חקירה צולבת דיבורים מולקולריים בין אלפים רבים של לוקוסים שונים. בעוד טכניקות מבוססות 3C ודגי DNA יכולים להיות שיטות משלימות, הם לא בהכרח לענות על אותן השאלות. שיטות מבוססות 3C לספק readout הרכב של אוכלוסיות תאים מעורבות, וכתוצאה מכך probability לעמיתים לעמותות. בניגוד לכך, בעוד בתפוקה נמוכה, המבוססות על טכניקות דגים מציעות את האפשרות לנתח סידורים מרחביים של לוקוסים או כרומוזומים בתאים בודדים על פי שלבי המחזור התפתחותיים או סלולריים שלהם. לפיכך, דגים ימשיכו להיות כלי חשוב לחיטוט יחסי פונקצית מבנה גרעיניים. ישנם שני שיקולים עיקריים בביצוע ניסויי דגים 3D מוצלחים. אלה הם: 1. קבלת בדיקות שכותרתו בצורה אופטימלית ו -2. בחירה של טיפולים סלולריים, כולל קיבעון, לפני וצעדים שלאחר הכלאה, כדי לשמור על מורפולוגיה גרעינית עד כמה שניתן בעת ​​ביצוע ה-DNA נגישה מספיק להכלאת חללית. תיוג בדיקה יעיל חשוב מאוד לדגים. באופן מסורתי, ניק-תרגום נעשה שימוש כדי להציג או hapten או נוקלאוטידים fluorophore-מצומדות 4. בדומה לכך, ערכות ניק-תרגום המסחרי זמינות עבור hapten הישיר או התאגדות fluorophore, buלא גם לתיוג שני שלבי שימוש בנוקלאוטידים aminoallyl וצבעים אמין-תגובתי. זה האחרון הופך את שילוב צבע יעיל יותר על ידי מתן פולימראז ה-DNA מולקולה פחות מגושמת לעבוד איתו. לאחרונה, ערכות לתיוג הלא האנזימטית של ה-DNA פותחו אשר מחייבים לנצל קואורדינטיבית של פלטינה לחומצות גרעין. אפילו ניתן לרכוש כבר 5 בדיקות שכותרתו דגים. בעוד ערכות ובדיקות שיוצרו באופן מסחרי ללא ספק נותנים נוחות שימוש, הם הרבה יותר יקרים מאשר לקנות רכיבים הבודדים ובייצור בדיקות בבית. אנחנו מותאמים פרוטוקול תרגום ניק עלות נמוך כדי לתייג ישירות רבות בדיקות שונות BAC במספר צבעים. גילתה שקבלת דנ&quot;א BAC הטהור ביותר היא קריטית ותוצאות בדרישה רק 10-20 ng של חללית לכל שקופית דגים, בהשוואה ל 10 - 20 של פי יותר כאשר ה-DNA משמש תבנית טמאה, וכתוצאה מכך העלות גדולה וזמן חיסכון. השימוש באמין allyldUTP מאפשר תיוג גמיש שלבדיקות עם צבעים אמין-reactive זמינים (למשל אלקסה פלואוריד או CY-צבעים) או haptens (למשל ביוטין, digoxigenin). בדיקות hapten שכותרתו מזוהות על ידי נוגדני fluorophore-מצומדות או streptavidin להגביר ולדמיין את האות. בדיקות ישירות כותרתו בהירה בדרך כלל מראות פחות מכתים רקע ולהימנע יתר הגברה של אותות, ולכן כתוצאה מייצוג מדויק יותר של לוקליזציה גרעינית ומורפולוגיה לוקוס. קיימות מספר טכניקות דגים שונים שמשתמשות בfixatives שונה, טיפולים מראש, ושטיפות לאחר הכלאה אבל אלה בדרך כלל נופלים לתוך הקטגוריות הבאות: קיבעון glutaraldehyde עם NaOH denaturation, קיבעון פורמלדהיד עם HCl denaturation, וקיבעון פורמלדהיד עם denaturation חום 6-9 . לכל אלה יש יתרונות וחסרונות. תוצאות glutaraldehyde קיבעון בשימור מבני גרעין טוב, אבל דורש טיפול עם צמצום סוכנים כדי למזערautofluorescence כתוצאה מכך, וטיפול NaOH צריך להיות מבוקרים בקפידה כדי לאזן denaturation DNA מספיק ונזק אפשרי למבנה גרעיני 6. קיבעון פורמלדהיד הוא פחות חזק, נותן סבירות מוגברת של הפרעות של אדריכלות גרעינית, אלא גם נותן בדרך כלל אותות ונמוכים autofluorescence 9 חזקים יותר ואמינים יותר. HCl טיפול depurinates DNA ורצועות את החלבונים, ומספק גישה טובה ל-DNA לבדיקות, אלא גם עשוי להציג את הפסקות DNA. חימום פיזי שמפריד בין שני גדילי דנ&quot;א וכתוצאה מהכלאת המטרה טובה ואותות חזקים, אבל יכול לגרום להפרעות במבנה גרעיני 8. המידה שבה כל אחת מטכניקות אלה משפיע epitopes החלבון משתנית מאוד 6,9, וכתוצאה מכך הדרישה לקבוע באופן ניסיוני עבור כל חלבון הפרוטוקול האופטימלי לשימוש בניסויים חיסוני דגים. אמנם אין DNA FISH te &quot;מושלם&quot;chnique, כולם יכול להיות שימושי אם גם בשליטה. המטרה שלנו הייתה לעשות אופטימיזציה של פרוטוקול ה-DNA לדגים חזקים ולשעתק לחקור מיקום המרחבי של לוקוסים רבים במגוון רחב של סוגי תאים 10, תוך התמקדות בשיטת החימום עבור רוב האותות אמינים. עם זה ושימוש במערכת הדמיה האוטומטית נועדו להגדיל את התפוקה לניתוח תא בודד של הסדרים גרעיניים.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>NTB buffer</td><td></td><td></td><td>שלב 1.1.1 (ראה רשימת 'מאגרי FISH ותערובות תגובה' להלן)</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>D-1532</td><td>שלב 1.1.1</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td>שלב 1.1.1 (ראה רשימת 'מאגרי FISH ותערובות תגובה' להלן)</td></tr><tr><td>Aminoallyl-dUTP</td><td>Ambion</td><td>AM8439</td><td>שלב 1.1.1</td></tr><tr><td>DNA פולימראז I</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M02095</td><td>שלב 1.1.1</td></tr><tr><td>DNase I רקומביננטי RNase ללא</td><td>רוש</td><td>4716728001</td><td>שלב 1.1.1</td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR מהירה QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>שלב 1.1.4, 1.2.3</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>VWR</td><td>27653</td><td>שלב 1.1.5, שלב 2.1.1.2</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>שלב 1.2.1</td></tr><tr><td>צבע תגובתי של Alexa Fluor Decapacks ליישומי מיקרו-מערך</td><td>Invitrogen (בדיקות מולקולריות)</td> <td>A32750, A32756, A32757</td><td>שלב 1.2.2</td></tr><tr><td>DMSO (נטול מים) </td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td>שלב 1.2.2</td></tr><tr><td>SYBR כתם ג'ל DNA בטוח</td><td>Life Technologies</td><td>S33102</td><td>שלב 1.2.4 (חלופה לאתידיום ברומיד)</td></tr> <tr><td>Cot-1 DNA</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td>שלב 2.1.1.1 (ניתן להכין DNA של Cot-1 בכמויות גדולות ועובד באותה מידה)</td></tr><tr><td>DNA חד-גדילי מאשכי סלמון </td><td>Sigma</td><td>D7656</td><td>שלב 2.1.1.1</td></tr><tr><td>פורממיד דה-יונים</td><td>Sigma</td><td>F-9037</td><td>שלב 2.1.1.3 (סכנה בריאותית)</td></tr><tr><td>Dextran sulphate</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D8906</td><td>שלב 2.1.1.4 (ראה רשימת 'מאגרי FISH ותערובות תגובה' להלן)</td></tr><tr><td>בדיקות צביעה XMP</td><td>MetaSystems</td><td>000000-0528-837</td><td>שלב 2.1.1.4 </td></tr><tr><td>שקופיות מצופות פולי-L-ליזין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P0425</td><td>שלב 2.1.2</td></tr><tr><td>עט הידרופובי (ImmEdge)</td> <td>מעבדות וקטור</td><td>H-4000</td><td>שלב 2.1.2</td></tr><tr><td>70 &mu; m מסננת (עכבר f&#8211; תאי כבד טל בלבד)</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td>שלב 2.1.2.1</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>שלב 2.1.3 (דליק, קורוזיבי, רעילות חריפה, סכנה בריאותית) (ראה רשימת 'חוצצי FISH ותערובות תגובה' להלן)</td></tr><tr><td>Tris-Cl</td><td></td><td></td><td>שלב 2.1.3 (ראה רשימת 'מאגרי FISH ותערובות תגובה' להלן)</td></tr><tr><td>ספונין מקליפת Quillaja</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td>שלב 2.1.4, 2.1.11 (רעילות חריפה), (ראה רשימת 'מאגרי FISH ותערובות תגובה' להלן)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>שלב 2.1.4, 2.1.11 (רעילות חריפה, מסוכנת לסביבה)</td></tr><tr><td>10 x PBS</td><td>Life Technologies (GIBCO)</td><td>70011-036</td><td>שלב 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, </td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>G/0650</td><td>שלב 2.1.6</td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>20252</td><td>שלב 2.1.9 (רעילות חריפה, קורוזיבית)</td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>47670</td><td>שלב 2.1.14, 2.2.3 (סכנה בריאותית)</td></tr><tr><td>SSC</td><td></td><td></td><td>שלב 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (ראה רשימת 'מאגרי FISH ותערובות תגובה' להלן)</td></tr><tr><td>Coverslips 22 x 22</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022022A1</td><td>שלב 2.1.15</td></tr><tr><td>כיסויים 22 x 50</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022050A1</td><td>שלב 2.1.15</td></tr><tr><td>מלט גומי</td><td>Marabu</td><td>2901 (10 000)</td><td>שלב 2.1.15 (דליק, סכנה בריאותית, סכנה לסביבה)</td></tr><tr><td>בדיקות</td><td>מולקולריות DAPI Invitrogen</td><td>D3571</td><td>שלב 2.2.8 (סכנה בריאותית)</td></tr><tr><td>SlowFade Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36936</td><td>שלב 2.2.10 (מדיום הרכבה)</td></tr><tr><td>לק שקוף</td><td>כל ספק</td><td></td><td>שלב 2.2.10</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>שלב 1.1.6, 1.2.4 (ספקטרוסקופיה של מיקרו-נפח)</td></tr><tr><td>טייפון FLA 7000 phosphoimager</td><td>GE מדעי</td><td></td> החיים <td>שלב 1.2.4</td></tr><tr><td>צנצנות קופלין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6016 (6EA)/S5516 (6EA)שלב</td> <td>2.1.3 ואילך</td></tr><tr><td>חנקן נוזלי </td><td>כל</td><td></td><td>ספק שלב 2.1.7</td></tr><tr><td>בסיס עם מכסה שחור (תא אטום לאור)</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td>שלב 2.1.17</td></tr><tr><td>נוחות תרמו-מיקסר</td><td>Eppendorf</td><td>5355 000.011</td><td>שלב 2.2.3 (או השתמש בשייקר ב-37 מעלות; C room)</td></tr><tr><td colspan="4">Imaging and Image Processing</td></tr><tr><td>Metafer - פלטפורמת אוטומציה של הדמיה</td><td>MetaSystems</td><td></td><td>תוכנת הדמיה אוטומטית</td></tr><tr><td>MetaCyte - ניתוח FISH אינטרפאזי אוטומטי</td><td>תוכנת הדמיה אוטומטית</td><td>MetaSystems</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager Z2</td><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי</td> זקוף <td>Zeiss</td><td></td> בשימוש עם הדמיה אוטומטית</tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי IX81 (FV1000)</td><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td> <td>אולימפוס</td><td></td></tr><tr><td>Bitplane, גרסה 7.3</td><td>תוכנת ניתוח תמונות ומידול תלת מימד</td><td>של אימאריס</td><td></td></tr>, <tr><td>גרסה 4.1</td><td>תוכנת ניתוח תמונות ודה-קונבולוציה</td> <td>של הויגנס</td><td></td><</tr><tr>td colspan="4"> FISH חוצצים ותערובות תגובה <table border="1"> <tbody> <tr> <td>שם</td> <td>Composition</td> <td>Comments</td> </tr> <tr> <td> 10 x מאגר NTB</td> <td>0.5 מ' Tris-HCl, pH 7.5</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0.05 M MgCl2</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0.5 מ"ג/מ"ל BSA</td> <td></td> </tr> <tr> <td>dNTP Mix</td> <td>0.5 mM dGTP</td> <td>Store 50 &mu; l aliquots ב-20 & deg; C</td> </tr> <tr> <td></td> <td>0.5 mM dATP</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0.5 mM dCTP</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0.125 mM dTTP</td> <td></td> </tr> <tr> <td>4 % PFA</td> <td>שוקלים 4 גרם/100 מ"ל PFA ב-PBS ומחממים ל-62&00 מעלות צלזיוס. התאימו את ה-pH עם NaOH ל-7.0 כדי להמיס את ה-PFA.</td> <td>אחסן 50 מ"ל ב-20 מעלות; ג, אין להקפיא מחדש</td> </tr> <tr> <td>2% תמיסת ספונין</td> <td>יש להמיס 2 גרם ספונין לכל 100 מ"ל PBS על ידי ערבוב ממושך. יש להמיס ולהתאים את ה-pH ל-7.0 עם NaOH. הביאו ל-1 ליטר עם ddH20 וחיטוי. </td> <td>אחסן 5 מ"ל ב-20 מעלות; C</td> </tr> <tr> <td>20 x SSC</td> <td>שוקלים 175.3 גרם NaCl ו-88.2 גרם נתרן ציטראט ומוסיפים ל-80 מ"ל ddH20. יש להמיס ולהתאים את ה-pH ל-7.0 עם NaOH. יש להביא ל-1 ליטר עם ddH20 ו-autoclave.</td> <td></td> </tr> <tr> <td>תערובת דקסטרן סולפט</td> <td>20% דקסטרן סולפט ב-2 x מאגר SSC; תמיסת מערבולת ומערבבים על נדנדה למשך הלילה.</td> <td>Store 500 &mu; l aliquots ב-20 & deg; C</td> </tr> </tbody> </table> </td></tr></tbody></table>

דגי ה-dna 3d חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

דגי ה-DNA 3D הפך לכלי עיקרי לניתוח ארגון תלת ממדי של הגרעין, וכמה וריאציות של הטכניקה שפורסמו. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול אשר עברו אופטימיזציה עבור חוסן, שחזור, וקלויות שימוש. מאור בדיקות ישירות כותרת ניאון מופקות על ידי ניק-תרגום עם אמינו-allyldUTP אחרי הצימוד כימי של הצבע. דגי ה-DNA 3D מתבצע באמצעות צעד הקפאת הפשרה לpermeabilization התא וצעד לחימום denaturation סימולטני של בדיקה ה-DNA והגרעינית. הפרוטוקול הוא ישים למגוון של סוגי תאים ומגוון רחב של בדיקות (BACS, פלסמידים, fosmids, או צבעי כרומוזום שלמים) ומאפשר הדמיה אוטומטית תפוקה גבוהה. בשיטה זו אנו שיגרתי לחקור לוקליזציה גרעינית של עד שלושה אזורים בכרומוזומים.

הפרוטוקול מתואר כאן (איור 1 לסקירה) נעשה שימוש כדי אפקט נהדר לשלב דגי DNA עם לכידת תמונת תפוקה גבוהה לניתוח של ארגון הגנומי. הדור של בדיקות איכות טובות הוא קריטי להצלחה (ראה דיון). איור 2 מדגים שתי בקרות איכות חשובות לבדיקות דגים. אחרי שניק-תרגום, כתם של ה-DNA צריך להיות גלוי עם כמות גדולה של שברי הריצה נ&quot;ב בין 150 ל 700 (איור 2 א). לאחר צימוד כימי, שילוב של צבע פלואורסצנטי ניתן ללמוד על ידי ניתוח ספקטרוסקופיות של החללית (איור 2). בעת שימוש בבדיקות טובות, בעקבות פרוטוקול FISH-DNA גורם בדרך כלל לאותות דגים DNA בהירים על רקע נמוך. אנחנו השתמשנו בהצלחה בפרוטוקול זה על מגוון רחב של סוגי תאים שונים, וגם עם מיקרוסקופים עלית הקרינה או confocal. הדמיה אוטומטית באמצעות עלית fluorescenc<html> מיקרוסקופ האלקטרוני דורש אותות דגים חדים, הניתנים לזיהוי בקלות עם קצת רקע (איור 3), ואילו מיקרוסקופיה confocal דורשת אותות אינטנסיביים יותר. איור 4 א מציג תמונות המעובדות מייצגות. ניתן להשיג קואורדינטות גרעיניות של אותות דגים, ויחסים מרחביים של אזורים גנטיים ניתן לחשב (לדוגמה ראה איור 4). יש לנו גם בשימוש ערימות תמונה המתקבלות על ידי מיקרוסקופיה confocal למודלי 3D של אותות דגים בתוך שטחי כרומוזום (סרט 1). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1.jpg" /> איור 1. זרימת עבודה לתיוג הבדיקה ה-DNA ודגים. הכנת חללית היא מוצגת בכחול. הליך ה-DNA FISH מוצג בשחור עם פרטים שנמסרו בירוק. = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2.jpg" /> איור 2. תיוג בדיקות על ידי ניק-תרגום ובקרת איכות של בדיקות שכותרת. א) למרוח ג&#39;ל מראה אידיאלי לפני החימום כדי להשבית DNase אני (מסלול 1: סולם DNA, מסלול 2 ו 3: Bács לאחר ניק-תרגום). ברים צריכים להיות בטווח שבין 150-700 נקודות בסיס. כתם נוסף ב~ 1 קילו הוא ציין בתדירות גבוהה עם תגובות ניק-תרגום מוצלחים. ב &#39;) ניתוח ספקטרום מלא Microvolume של בדיקות שכותרת. שיא ה-DNA ב260 ננומטר הוא ציין עם שיא שני מקביל לאורך גל הספיגה של fluorophore הבדיקה תחת כותרת: Alexa פלואוריד 488: 495 ננומטר, Alexa פלואוריד 555: 555 ננומטר, Alexa פלואוריד 647: 650 ננומטר. הראה שלוש בדיקות עם שילוב טוב: פסגות ספיגת fluorophore הן גובה דומה או גבוה יותר מפסגות DNA. יש Alexa פלואוריד 647 בדרך כלל הספיגה גבוהה יותרמAlexa פלואוריד 555, אשר בתורו יש ספיגת גבוהה יותר מאשר Alexa פלואוריד 488. אלקסה פלואוריד 488 גם סופג קצת אור ב 260 ננומטר, ולכן השיא הראשון לבדיקה זו הוא גבוה יותר מהאחרים. בדיקות עם ספיגת fluorophore תכנית שילוב גרועה 2-3-לקפל נמוכות מספיגת ה-DNA. בדיקות עם יותר משיא fluorophore הגבוה פי 2 מאשר ה-DNA השיא מכילות בדרך כלל צבע unconjugated שעלול לגרום לרקע בדגים. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3.jpg" /> איור 3. צילום מסך מהתוכנה ההדמיה דגי 3D MetaCyte מראה ניסוי דגים בשלושה צבעים אופייניים. המסך מחולק למספר חלקים. תמונה בשדה של נוף (FOV) Raw) שנתפס על ידי מערכת סריקת שקופיות MetaCyte Metafer /. ב &#39;) גלריה של תמונות של גרעינים זיהו כי יש לבטל את<html> עיבוד תמונת dergone ופילוח לאותות דגים. סוגים שונים של נתונים יכולים להיות מוצגים על כל תמונה בגלריה. שם שקופיות במספר תא דוגמה זו מוצג שמאלית עליונה עם interallelic השונים ומרחקי interlocus ימניים עליונה וכל צד מתחת לכל תמונה. C) עם מספר הגרעינים שזוהו בניתוח. ד &#39;) תיאור של השקופית עם האזור שנסרק על ידי מערכת. ה) הגדלה של האזור שנסרק. כתמים לבנים מייצגים זיהו גרעינים לFOV. F) נתונים מעובדים. בדוגמה זו מרחקי interallelic המקסימאליים בין אותות ירוקים (למעלה) ואותות אדומים (תחתון) מוצגים. הנתונים שמוצגים הוא מP20 תאי הנבט של עכבר. בדיקות נמצאות על כרומוזומים שונים, המכסים Hbb וגנים HBA ואשכול היסטון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587fig3large.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> . בתוך עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4.jpg" /> איור 4. דוגמאות לתמונות שעובדו ונתונים positional נגזרו. A תמונות) מעובד לE13.5 תאי כבד עוברי של עכבר מוכתמים בדיקות BAC ממוקמות על כרומוזומים שונים המכסים Myc וKCNQ1 גנים (מכונה myc וKvDMR, בצבע ירוק ואדום, בהתאמה). B) עלילות תיבה-זיף טיוקי המייצגים את מרחק interallelic החלוקה לאותן לוקוסים 600 בגרעינים. מרחק Interallelic הוא להתוות כחלק של רדיוס הגרעין &#39;(מרחק / רדיוס) לדין וחשבון על שינויים בגודל גרעיני. יש גרעיני תאי גזע עובריים ברדיוס של כ 5 מיקרומטר. בדיקות אדומות הן משמעותית יחד קרוב יותר מחלליות ירוקות (***: p &lt;0.01, מבחן t מזווג). נתונים מ10. סרט 1. מודלים 3D של שני לוקוסים בתוכם לא כרומוזוםerritory. שתי בדיקות BAC ממוקמים קרוב לשני קצוות של כרומוזום 7 בעכבר תויגו (אדום אדום רחוק, (לבן פסאודו בצבע)) והכלאה יחד עם כל צבע כרומוזום (ירוק) לתאי הגזע העובריים של עכבר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587movie1.mov" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בסרט.</a>

אנו מתארים פרוטוקול חזק ותכליתי לניתוח ארכיטקטורה גרעינית ידי דגי DNA 3D באמצעות בדיקות ניאון שכותרתו ישירות.

דגי ה-DNA 3D חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לחקור באופן חסון את הארגון המרחבי של לוקוסים גנומיים ספציפיים בתאים בודדים. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת גשושים (probes) מסומנים פלואורסצנטית, שנועדו להיקשר ולהדגיש את האזור הגנומי הנחקר. השלבים הבאים הם הדבקה, קיבוע ופרמיליזציה (permeabilization) של התאים הרלוונטיים על גבי סלייד, כדי לאפשר את גישת הגשושים.לאחר מכן, דנטורציה תרמית סימולטנית של הגשוש (probe) ושל ה-DNA התאי ת Followed בצעדי שטיפת היברידיזציה של הגשוש למשך לילה כדי להסיר גשוש שנקשר באופן לא ספציפי, וצביעה נגדית עם dpi. כדי להמחיש את תוצאות גרעין התא, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תחשוף בסופו של דבר את המיקום הגרעיני שתופסים אזורים גנומיים ספציפיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הארגון הגרעיני, כגון קביעת אינטראקציות פונקציונליות בין גנים.היתרון המרכזי של פרוטוקול ה-DNA FISH הספציפי הזה הוא היותו מהיר, חסון ורב-גוני. למרות שאנו מדגימים שיטה זו באמצעות תאי E Es, ניתן להחילה אותה גם על סוגי תאים רבים אחרים. גושים של 100 עד 250 Kilobases המשמשים ליצירת גושים מסומנים באופן ישיר מייצרים באופן עקבי אותות בהירים, אם נדרשים גושים קטנים יותר.השתמשו ב-smid של 40 עד 50 kilobase, או אפילו בפלסמידים המכילים רצפי הכנסה (inserts) של חמישה עד 10 kilobase. זהו את שיבוטי ה-back או ה-smid המתאימים לגנים ספציפיים באמצעות דפדפני הגנום של ensemble או UCSC. להכנת DNA back באיכות גבוהה, השתמשו בשיקוע חוזר או בערכה זמינה מסחרית; ניקיון ההכנה פרופורציונלי לנפח הגשש (probe) הנדרש.בצע את הסימון בשני שלבים. ראשית, השתמש בתרגום NIC כדי להחדיר אלל חומצת אמינו, DUTP. שנית, השתמש בצימוד כימי כדי להצמיד צבע ריאקטיבי מסוג AM mean.מומלץ להשקיע זמן בהכנת גששים בעלי פלואורסצנציה חזקה, שכן אלו קריטיים לקבלת אותות דגים (fish signals) חזקים. ניתן לבצע הליך זה במקביל לטיפול בתאים, ואין צורך לבצעו בתחילת היום. ראשית, ערבבו 10 עד 20 nanograms של גשש מסומן ישירות עם שש µL של CO 1D NA עבור שש micrograms.לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד של DNA גדילי בודד מבישרי סלמון (salmon testes) עבור 9.7 micrograms. התאימו את נפח התערובת ל-100 microliters באמצעות מים. לאחר מכן, הוסיפו 10 microliters של sodium acetate בריכוז three molar ו-275 microliters של ethanol וערבבו באמצעות vortexing.השאירו את התערובת להשקיע למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לאחר מכן, סובבו את המשקע במיקרו-צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את המשקע עם 70% ethanol וסובבתו שוב למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.בשלב הבא ייבשו את המשקע באוויר. לאחר מכן, השביו אותו. השביו אותו ב-5 µL של מים דאיוניים.דגירה ב-37 °C תוך כדי ניעור ב-1000 RPM ועטיפה בנייר אלומיניום להגנה מפני אור. לאחר 30 דקות, הוסף 5 µL של תערובת dextrin sulfate והמשך בדגירה עם ניעור למשך 10 דקות נוספות. נטיית התאים להיצמד ל-Slide משתנה מאוד בהתאם לסוג התא.עבור כל סוג תא, קבעו באופן אמפירי את זמן השקיעה ואת צפיפות התאים האופטימליים. לקבלת תוצאות עקביות, התאים חייבים להיות בתגסיה של תאים בודדים (single cell suspension). כדי להדביק תאי ES של עכבר על סלייד, התחילו בסימון מעגל על פני השטח של הסלייד שבו יונחו התאים.בעזרת עט הידרופובי, הכינו תרחיף של 20 עד 50,000 תאים ל-80 עד 100 µL במצע תרבית רגיל, הוסיפו את תרחיף התאים לתוך העיגול והמתינו כשלוש שעות באינקובטור לח כדי לאפשר לתאים להיצמד. לאחר היצמדות התאים לסלייד, קבעו את התאים על ידי טבילה עדינה של הסלייד ב-4% PFA למשך 10 דקות. יש להניח את הסלייד בצורה שטוחה בתבנית, כגון קופסת טיפים.שימוש בריאגנטים בטמפרטורת החדר בתוך צנצנות coplan. ראשית, בצעו השבתה (quench) של התאים באמצעות tris chloride למשך 10 דקות. שנית, בצעו חדירה (permease) לתאים באמצעות תערובת של sapin ו-triton X 100 למשך 10 דקות.כעת שטפו את התאים פעמיים ב-PBS למשך חמש דקות לכל שטיפה. לאחר השטיפות, דגרו את התאים ב-20% glycerol למשך 20 דקות לפחות. בשלב זה, ניתן לאחסן את ה laminae ב-50% glycerol בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius למשך מספר שבועות.אחסון למשך יום או יותר אמור להגביר את עוצמת האות. יש לוודא כי התאים הגיעו לטמפרטורת החדר ב-20% glycerol ב-PBS לפני ההמשך. כעת, הקפיאו והפשיתו את הנסקיקה שלוש פעמים באמצעות חנקן נוזלי.שקופית אחת בכל פעם כאשר צליל הפצפוץ נפסק. לאחר מספר שניות, העבירו את השקופית לנייר סופג להפשרה; המתינו עד שהגליצרין הקפוא והעכור ייעלם לפני הקפאת השקופית שוב. ניתן לעבוד בנוחות עם עד 15 שקופיות בסבבי עבודה למשך שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה. כעת שטפו את השקופיות פעמיים ב-PBS למשך חמש דקות לכל שטיפה.לאחר מכן, דגרו את השקופיות בחומצה כלורית בריכוז 0.1 molar למשך 30 דקות. לאחר הטיפול בחומצה כלורית, בצעו שטיפה נוספת ב-PBS למשך חמש דקות. כעת, בצעו פרמיליזציה (permeabilization) שנית לתאים באמצעות תערובת חזקה יותר של sapin ו-Triton X 100 למשך 30 דקות. כדי לשטוף את החומרים הפעילים מהשקופיות, השתמשו בשתי שטיפות PBS של חמש דקות כל אחת.השקופיות מוכנות כעת להשגחה (equilibrating) ב-50% form amide בתוך XSSC. שלב זה צריך להימשך לפחות 10 דקות; בזמן ההשגחה, יש לשאוב את הפרובה (probe) למעלה ולמטה באמצעות פיפט מספר פעמים, ולאחר מכן להעביר 10 µL לכל נקודת תאים אל זכוכית כיסוי בגודל המתאים. הוצא שקופית מה-form amide וייבש בעזרת נייר סופג שאריות נוזל מסביב לתאים, אך הקפד שנקודת התאים לא תתייבש.כעת הפכו את הזכוכיתית. החליקו אותה על התבנית מעל התאים. אטמו את הזכוכיתית לתבנית באמצעות דבק גומי.יש להמתין עד שהדבק יתייבש לחלוטין ולשמור על הזריקה מוגנת מאור. לאחר מכן, יש לחמם את הזריקות ל-78 °C למשך שתי דקות בדיוק על גבי פלטה מחממת. שלב זה הוא קריטי לביצוע תקין.יש להשתמש בכיסוי להגנה על התאים מפני אור במהלך שלב זה, כדי לשמר את המורפולוגיה הגרעינית ככל האפשר. קריטי למנוע מהתאים להתייבש ולהבטיח שלמכשיר החימום (heat loc) יש את הטמפרטורה הנכונה. לאחר מכן, יש להניח את השקופיות בקופסה אטומה לאור עם נייר סופג לח כדי לספק לחות, ולדגור למשך לילה ב-37 °C.התחילו את הפרוצדורה על ידי קילוף דבק הגומי מסביב לזכוכיות הכיסוי. לאחר מכן, הניחו כל סלייד ב-X excess SC עד שזכוכיות הכיסוי ישתחררו ויחליקו החוצה. לאחר מכן, שטפו את הסליידים ב-50% form amide ב-two x excess SC למשך 15 דקות בטמפרטורה של 45 °C.שמרו על מכסה לסבון המים כדי להגן עליהם מאור. לאחר מכן, שטפו את העגיות ב-0.2 XSSC למשך 15 דקות ב-63 °C. לאחר מכן ב-2XSSC למשך חמש דקות ב-45 °C, ולבסוף ב-SE בעודף בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.השלבים הנותרים מתבצעים כולם בטמפרטורת החדר, החל משטיפה של חמש דקות ב-PBS; כעת צבעו את הנספיחים ב-DAPI למשך שתי דקות, ולאחר מכן בצעו דה-סטיינינג (detain) של הנספיחים ב-PBS למשך חמש דקות. כדי להרכיב את זכוכית הכיסוי, מרחו 10 µL של מדיום הרכבה (mounting medium) לכל נקודת תאים על זכוכית כיסוי בגודל המתאים. לאחר מכן, ייבשו את עודפי ה-PBS מסביב לנקודת התאים, תוך הקפדה שהתאים עצמם לא יתייבשו.הפוך את מכסיות הזכוכית, הנח אותה על תבנית והחתם אותה בלק לציפורניים בהתאם לפרוטוקול להכנת גשש דגים. לאחר תרגום NIC, אמור להיות נראה מריח של DNA כאשר מרבית הפסיגמנטים נעים בין 150 ל-700 base pairs. לאחר צימוד כימי, ניתן להעריך את ההטמעה של הצבע הפלואורסצנטי באמצעות ניתוח ספקטרוסקופי של מעבר הגשש.שלבי בקרת איכות אלו להערכת איכות הגשש הם קריטיים לצורך שימוש בגשש כזה. דימוי אוטומטי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפיפלוורסצנטי היה בר ביצוע. דבר זה דורש אותות FISH חדים וניתנים לזיהוי בקלות עם רקע מינימלי.זוהי תמונת שדה ראייה גולמית. התמונות הבאות מציגות גרעינים שזוהו ונותחו באופן אוטומטי. מרחקים בין-אלליים ובין-לוכסיים שונים מוצגים בפינה הימנית העליונה ובשני הצדדים מתחת לכל גרעין.בהגדלה זו, נקודות לבנות מייצגות את הגרעינים שזוהו לכל שדה ראייה. היסטוגרמות אלו מראות את המרחקים הבין-אלליים המקסימליים בין אותות ירוקים למעלה ואותות אדומים למטה. כל הנתונים נלקחו מתאי נבט P 20 עם גששים הממוקמים על כרומוזומים שונים המכסים את הגנים HBB ו-HBA ואשכול היסטונים.אלו הן דוגמאות של גרעיני כבד עוברי שצבעו באמצעות גששים משלימים המכסים את הגנים mic, KC ו-Q1. מתמונות אלו ניתן להפיק קואורדינטות גרעיניות של אותות דגים ולחשב יחסים מרחביים של אזורים גנומיים. מרחקים בין-אלליים מוצגים כשבר מרדיוס הגרעין.בנתונים אלו, גששים אדומים היו קרובים משמעותית זה לזה מאשר גששים ירוקים. מיקרוסקופיה קונפוקאלית, הדורשת אותות עזים יותר, הייתה ישימה גם כן. ערימות תמונות שימשו למידול תלת-ממדי של אותות הדגים בתוך טריטוריות הכרומוזומים שלהם.שני הגששים הללו, באדום ובלבן, נמצאים קרוב לכל אחד מקצוות כרומוזום 7 של עכבר; צביעת כרומוזום שלם מוצגת בירוק. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של אופן ביצוע DNA FISH כדי לחקור את המיקום המרחבי של לוקוסים גנומיים ספציפיים בתאים בודדים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שכל טיפול עשוי להשפיע על ארכיטקטורת הגרעין, וחשוב לכלול ביקורות מתאימות בעקבות הליך זה.ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון immuno fish, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון קשרים מרחביים בין גנים לחלבונים.

robust-3d-dna-fish-using-directly-labeled-probes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרסום זה מתאר כיצד להשתמש מיני דגים Agilent מערכת זיהוי כדי לזהות את המין של דג על ידי הפקת DNA וביצוע PCR וניתוח RFLP.

ה-DNA מבוססי פרוטוקול זיהוי דגים המינים

שימוש הר שלם באתרו הכלאה קישור לביולוגיה מולקולרית האורגניזם

בידוד ואפיון תאי גידול במחזור הדם של חולי סרטן הוא סוג של ביופסיה נוזלית לא פולשנית וקשורה להישנות המחלה ולהתקדמות המחלה. סרטון זה מתאר את הטכניקה של הכלאה פלואורסצנטית באתרו של DNA (DNA FISH) על CTCs שנלכדו על חוט רפואי, כדי לחקור גן ספציפי מעניין.

דג DNA תלת-ממדי: טכניקה לאיתור גן מסוים על כרומוזום

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי בו זמני של שינויי היסטון ידי רצפי DNA וimmunofluorescence ידי דגי DNA אחרי מיקרוסקופיה וניתוחים (דגי 3D החיסוני DNA) 3D.

Immunofluorescence שילוב ודגי DNA על 3D-השתמרו גרעיני Interphase לחקר שינויים בארגון גרעיני 3D

כאן, אנו מציגים גישה שיטתית לפיתוח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, רגיש...

בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio

PCR בשילוב עם ניתוח ברזולוציה גבוהה להמיס (HRMA) הוא הוכיח כשיטת מהירה ויעילה לגנוטיפ דג הזברה.

מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

עובר דג הזברה הוא מודל מצוין למחקר בביולוגיה התפתחותית. במהלך עובר, דג הזברה מתפתחת עם מסת חלמון, אשר מציבה אתגרים תלת ממדים לתצפית מדגם וניתוח. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור הכנות הר שטוחות דו ממדים של הר שלם באתרם דגימות (לוואי) מוכתמות דג הזברה עובר.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

דג זברה שימשו מודל גנטי אמין האורגניזמים במחקר ביו-רפואי, במיוחד עם כניסתו של טכנולוגיות לעריכת ג'ין. כאשר הזחל פנוטיפים צפויים, זיהוי ה-DNA החילוץ, גנוטיפ יכול להיות מאתגר. כאן, אנו מתארים הליך genotyping יעיל עבור הזחלים דג זברה, מאת הזנב מסיכה, מוקדם ככל 72-h שלאחר ההפריה.

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

3d-DNA דגים ססגוניות מייצג כלי להמחיש המקום גנומית מרובים בתוך גרעיני תלת-ממד משומרים, חד משמעית הגדרת אינטראקציות הדדית שלהם לוקליזציה בתוך החלל הגרעיני ברמת תא בודד. כאן, פרוטוקול צעד אחר צעד מתואר עבור קשת רחבה של תאים ראשוניים אנושיים.

3D מרובת צבעים דג DNA כלי ללמוד אדריכלות גרעינית בתאים ראשוניים אנושיים

למדו פרוטוקול DNA FISH תלת-ממדי עם בדיקות פלואורסצנטיות מסומנות ישירות לניתוח ארכיטקטורה גרעינית. שיטה זו מאפשרת חקירת ארגון מרחבי של לוקוסים גנומיים בתאים בודדים.

דגי ה-DNA 3D חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות

גלה סרטונים נוספים