טרנספורמציה חיידקית: שיטת הלם החום
טרנספורמציה היא התהליך המתרחש כאשר תא בולע דנ"א זר מסביבתו. טרנספורמציה יכולה להתרחש בטבע בסוגים מסוימים של חיידקים. בביולוגיה מולקולרית, טרנספורמציה…
טרנספורמציה חיידקית היא שיטה נפוצה שבה דנ"א זר נכנס לחיידק, אשר לאחר מכן יכול להגביר, או לשכפל את ה- DNA. תאים שיש להם את היכולת לקחת בקלות את ה- DNA הזה נקראים תאים מוסמכים. למרות שהשינוי מתרחש באופן טבעי בסוגים רבים של חיידקים, מדענים מצאו דרכים לגרום באופן מלאכותי ולשפר את כשירותו של תא חיידקי. בסרטון זה נדבר על אחת הדרכים האלה, שינוי הלם חום.
לפני שנדבר על טכניקת הלם החום, בואו נדון תחילה בסוג הדנ"א הנפוץ ביותר בטרנספורמציה חיידקית: הפלסמיד. פלסמיד הוא דנ"א קטן, מעגלי, כפול גדילים שיכול להקטין את גודלו על ידי תות-על, כך שהוא יכול לעבור בקלות דרך נקבוביות בקרום התא.
פלסמיד מכיל כמה אזורים חשובים שכדאי להזכיר. פלסמידים זמינים מסחרית מכילים אתר שיבוט מרובים או MCS. אזור זה מכיל רצפים ספציפיים המוכרים על ידי אנדונוקלאזים מגבילים או אנזימי הגבלה, אשר דבק DNA. שברי DNA של עניין לחוקר ניתן להכניס לתוך אתר שיבוט מרובים כאשר פלסמיד ושבר DNA נחתכים עם אותם אנדונוקלאזים.
Plasmids מכילים גם מקור של שכפול, או ORI, המספק מידע לתא באשר למקום שבו שכפול של plasmid צריך להתחיל.
בנוסף למקור השכפול ואתר השיבוט המרובה, רוב הפלסמידים יכללו גן עמיד לאנטיביוטיקה. גן זה מעניק עמידות לאנטיביוטיקה לכל התאים המכילים את הפלסמיד, ומאפשר לתאים אלה לשרוד במדיה המכילה אנטיביוטיקה.
עכשיו כשדיברנו על פלסמידים, בואו נדבר על התאים שאליהם הם יוצגו: התאים המוסמכים. הסוג הנפוץ ביותר של חיידקים במחקר ביולוגיה מולקולרית, ושינוי הוא E. coli, אשר קורה גם לאכלס את המעי התחתון שלך. תאים נעשים בדרך כלל מוכשרים באמצעות חשיפה לסביבה עשירה בסידן.
המטענים החיוביים של יוני הסידן מנטרלים את המטענים השליליים של הפלסמיד ושל דופן התא החיידקי המתפזרים בדחייה אלקטרוסטטית ומחלישים את דופן התא.
על ידי חשיפת תאים לעלייה פתאומית בטמפרטורה, או הלם חום, נוצר הבדל לחץ בין החלק החיצוני לחלק הפנימי של התא, מה שגרם להיווצרות נקבוביות, שדרכו DNA פלסמי אמין יכול להיכנס. לאחר החזרת התאים לטמפרטורה נורמלית יותר, דופן התא יחלים את עצמו.
ברגע שהתאים יכבשו את הפלסמיד, הם יוכלו לגדול על לוחות אגר מעורבבים באנטיביוטיקה.
לפני תחילת טרנספורמציה הלם חום, לנקות את אזור העבודה ולוודא את כל הציוד הוא מעוקר.
ודא שיש לך מספיק מדיה אגר מוכן, אשר מספקים את התזונה לחיידקים אתה תעשה מוכשר. כמו כן הקפד לחטא את כל הפתרונות באמצעות autoclaving. אפשרו למדיה נוזלית להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש והכניסו את האגר להתקרר ל-50-55 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה שבה ניתן להוסיף אנטיביוטיקה ולשפוך צלחות. אפשר לצלחות להתקרר לטמפרטורת החדר כדי להתמצזק.
כאשר עובדים עם חיידקים, תמיד צריך להשתמש בטכניקה אספטית כדי לשמור על סטריליות. טכניקה אספטית כרוכה בדרך כלל בשימוש במבער בונזן כדי לעקר מכשירים וריגנטים וליצור זרם קונבקציה - אשר שומר מזהמים באוויר מחוץ לסביבת העבודה.
מיד לפני תגובת הלם החום, יש לחמם מראש את המדיה לטמפרטורת החדר ולצלחות אגר LB המכילות אנטיביוטיקה ל-37 מעלות צלזיוס. כמו כן, ודאו שאמבט המים שלכם הוא 42°C.
לאחר מכן, להפשיר תאים בעלי יכולת כימית על קרח.
מוסיפים, 1-5uL של פלסמיד קר 1ng/μL לתאי החיידקים, מערבבים בעדינות, ומחזירים את תערובת התא והפלסטיד לקרח במשך 30 דקות.
כאשר הזמן תם, לזעזע את התא ואת תערובת plasmid על ידי הצבתו באמבט מים ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות.
מיד לאחר הוצאת הצינור מאמבט המים לשים אותו על קרח ולהוסיף 450μL של מדיה. מניחים אותו באינקובטור רועד במשך 37°C במשך שעה אחת מעל 225 סל"ד, כך התאים יכולים להתאושש.
באמצעות טכניקה אספטית נכונה, להוסיף 20-200uL חיידקים לצלחת אגר LB ולהפיץ את המדיום סביב עם מפזר חיידקי. לדגור על הלוחות בלילה ב 37°C הפוך כדי למנוע חשיפה של חיידקים עיבוי.
למחרת, החיידקים שלקחו במושבות פלסמיד.
לאחר מכן, לספור את המושבות כדי לחשב את יעילות הטרנספורמציה, שהוא מספר טרנספורמטים מוצלחים חלקי הכמות הכוללת של DNA מצופה.
עכשיו, מושבות ניתן לבחור לניסויים נוספים.
לפני שנעשה מוכשר החיידקים המשמשים בטרנספורמציה מאוחסנים במקפיא. יש להפשיר עליהם על קרח, להתפשט על צלחת אגר – ללא אנטיביוטיקה, ולאפשר להם לגדול בין לילה ב-37 מעלות צלזיוס.
באמצעות טכניקה אספטית, בחר מושבה חיידקית מצלחת אגר וגדל אותה בתרבית גדולה של 500 מ"ל בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד – מכשיר, המונע משקעים של החיידקים ואפילו פיזור של חומרים מזינים בתקשורת.
בעוד התאים גדלים לעשות 0.1 סידן כלורי 0.1 סידן כלורי 0.1 סידן כלורי בתוספת 15% פתרונות גליצריל, autoclave, ולתת מגניב.
מדידות ספיגה משמשות כדי לקבוע אם החיידקים נמצאים בשלב אמצע היומן של הצמיחה שלהם, מה שאומר שהם בקלות לקחת DNA. ברגע שהתאים הגיעו לשלב זה, הנח אותם על קרח ולשמור אותם שם לאורך כל ההליך.
לאחר מכן, להפריד את התאים החיידקיים לתוך שני צינורות צנטריפוגה גדולים להסתובב ב 4 מעלות צלזיוס. יוצקים את supernatant ו resuspend בכ 100 מ"ל 0.1 טחנת של סידן כלורי קר. לאחר מכן, דגירה תאים על קרח במשך 30 דקות. צעד זה חוזר על עצמו לפחות פעם נוספת. מחזורים של תאים מסתובבים וממתינים מחדש מכונים לעתים קרובות שטיפת התאים שלך.
לאחר השטיפה הסופית, resuspend תאים קר 50mL 0.1 סידן כלורי בתוספת 15% תמיסת גליסול. תאים אלה הם עכשיו מוכשרים מבחינה כימית.
יש להפיץ 50μL של חיידקים לצינורות מיקרו-פוג מרובים ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן להלם חום.
קיימים יישומים רבים וריאציות של טרנספורמציה חיידקית.
בנוסף הלם חום, eletroporation היא טכניקה נפוצה נוספת עבור טרנספורמציה. כפי ששמו מרמז אלקטרופורציה כרוכה בשימוש בחשמל כדי להפוך נקבוביות בקרום התא החיידקי שדרכו DNA יכול לעבור.
לגבי הקרנה עבור חיידקים שעברו טרנספורמציה, plasmids לעתים קרובות מכילים גן קידוד האנזים בטא-גלקטוזידאז כדי לסייע עם הקרנה. כאשר המצע של אנזים זה כלול בצלחות אגר, חיידקים שעברו טרנסגמה עם פלסמידים המכילים מושבות לבנות תשואה להוסיף, בעוד אלה שלא, מניבים מושבות כחולות. שיטה זו נקראת הקרנה כחול לבן.
ברוב ניסויי הטרנספורמציה המטרה היא לגרום לחיידקים המפרידים במהירות לייצר כמויות גדולות של הפלסמיד שלך, הכולל את גן היעד שלך. בעקבות טרנספורמציה חיידקית, השלב הבא הוא לגדל כמויות גדולות של החיידקים במדיום נוזלי המכיל אנטיביוטיקה ולבצע טיהור plasmid, אשר, כפי שהוא מרמז, כרוך בטיהור plasmids מחיידקים. ערכות מסחריות רבות זמינות למטרה זו.
לפעמים המטרה של טרנספורמציה היא שחיידקים ייצרו כמויות גדולות של חלבון המקודד על ידי הפלסמיד. כאן אתה רואה תאים חיידקיים להיות הומוגניים lysed לפני טכניקה הנקראת טיהור זיקה יכול להתבצע כדי לבודד את חלבון היעד. לאחר טיהור כמויות גדולות של החלבון זה אז יכול להיות מגובש ואת המבנה של חלבון מסוים של עניין ניתן לזהות.
הרגע צפיתם ב-JoVE Introduction לתמורות של הלם חום. בסרטון זה סקרנו: מהו טרנספורמציה של הלם חום וכיצד הוא עובד, העיקר שמאחוריו וכיצד להפוך חיידקים מוצלחים. תודה שצפיתם!
טרנספורמציה חיידקית היא שיטה נפוצה שבה דנ"א זר נכנס לחיידק, אשר לאחר מכן יכול להגביר, או לשכפל את ה- DNA. תאים שיש להם את היכולת לקחת בקלות את ה- DNA הזה נקראים תאים מוסמכים. למרות שהשינוי מתרחש באופן טבעי בסוגים רבים של חיידקים, מדענים מצאו דרכים לגרום באופן מלאכותי ולשפר את כשירותו של תא חיידקי. בסרטון זה נדבר על אחת הדרכים האלה, שינוי הלם חום.
לפני שנדבר על טכניקת הלם החום, בואו נדון תחילה בסוג הדנ"א הנפוץ ביותר בטרנספורמציה חיידקית: הפלסמיד. פלסמיד הוא דנ"א קטן, מעגלי, כפול גדילים שיכול להקטין את גודלו על ידי תות-על, כך שהוא יכול לעבור בקלות דרך נקבוביות בקרום התא.
פלסמיד מכיל כמה אזורים חשובים שכדאי להזכיר. פלסמידים זמינים מסחרית מכילים אתר שיבוט מרובים או MCS. אזור זה מכיל רצפים ספציפיים המוכרים על ידי אנדונוקלאזים מגבילים או אנזימי הגבלה, אשר דבק DNA. שברי DNA של עניין לחוקר ניתן להכניס לתוך אתר שיבוט מרובים כאשר פלסמיד ושבר DNA נחתכים עם אותם אנדונוקלאזים.
Plasmids מכילים גם מקור של שכפול, או ORI, המספק מידע לתא באשר למקום שבו שכפול של plasmid צריך להתחיל.
בנוסף למקור השכפול ואתר השיבוט המרובה, רוב הפלסמידים יכללו גן עמיד לאנטיביוטיקה. גן זה מעניק עמידות לאנטיביוטיקה לכל התאים המכילים את הפלסמיד, ומאפשר לתאים אלה לשרוד במדיה המכילה אנטיביוטיקה.
עכשיו כשדיברנו על פלסמידים, בואו נדבר על התאים שאליהם הם יוצגו: התאים המוסמכים. הסוג הנפוץ ביותר של חיידקים במחקר ביולוגיה מולקולרית, ושינוי הוא E. coli, אשר קורה גם לאכלס את המעי התחתון שלך. תאים נעשים בדרך כלל מוכשרים באמצעות חשיפה לסביבה עשירה בסידן.
המטענים החיוביים של יוני הסידן מנטרלים את המטענים השליליים של הפלסמיד ושל דופן התא החיידקי המתפזרים בדחייה אלקטרוסטטית ומחלישים את דופן התא.
על ידי חשיפת תאים לעלייה פתאומית בטמפרטורה, או הלם חום, נוצר הבדל לחץ בין החלק החיצוני לחלק הפנימי של התא, מה שגרם להיווצרות נקבוביות, שדרכו DNA פלסמי אמין יכול להיכנס. לאחר החזרת התאים לטמפרטורה נורמלית יותר, דופן התא יחלים את עצמו.
ברגע שהתאים יכבשו את הפלסמיד, הם יוכלו לגדול על לוחות אגר מעורבבים באנטיביוטיקה.
לפני תחילת טרנספורמציה הלם חום, לנקות את אזור העבודה ולוודא את כל הציוד הוא מעוקר.
ודא שיש לך מספיק מדיה אגר מוכן, אשר מספקים את התזונה לחיידקים אתה תעשה מוכשר. כמו כן הקפד לחטא את כל הפתרונות באמצעות autoclaving. אפשרו למדיה נוזלית להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש והכניסו את האגר להתקרר ל-50-55 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה שבה ניתן להוסיף אנטיביוטיקה ולשפוך צלחות. אפשר לצלחות להתקרר לטמפרטורת החדר כדי להתמצזק.
כאשר עובדים עם חיידקים, תמיד צריך להשתמש בטכניקה אספטית כדי לשמור על סטריליות. טכניקה אספטית כרוכה בדרך כלל בשימוש במבער בונזן כדי לעקר מכשירים וריגנטים וליצור זרם קונבקציה - אשר שומר מזהמים באוויר מחוץ לסביבת העבודה.
מיד לפני תגובת הלם החום, יש לחמם מראש את המדיה לטמפרטורת החדר ולצלחות אגר LB המכילות אנטיביוטיקה ל-37 מעלות צלזיוס. כמו כן, ודאו שאמבט המים שלכם הוא 42°C.
לאחר מכן, להפשיר תאים בעלי יכולת כימית על קרח.
מוסיפים, 1-5uL של פלסמיד קר 1ng/μL לתאי החיידקים, מערבבים בעדינות, ומחזירים את תערובת התא והפלסטיד לקרח במשך 30 דקות.
כאשר הזמן תם, לזעזע את התא ואת תערובת plasmid על ידי הצבתו באמבט מים ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות.
מיד לאחר הוצאת הצינור מאמבט המים לשים אותו על קרח ולהוסיף 450μL של מדיה. מניחים אותו באינקובטור רועד במשך 37°C במשך שעה אחת מעל 225 סל"ד, כך התאים יכולים להתאושש.
באמצעות טכניקה אספטית נכונה, להוסיף 20-200uL חיידקים לצלחת אגר LB ולהפיץ את המדיום סביב עם מפזר חיידקי. לדגור על הלוחות בלילה ב 37°C הפוך כדי למנוע חשיפה של חיידקים עיבוי.
למחרת, החיידקים שלקחו במושבות פלסמיד.
לאחר מכן, לספור את המושבות כדי לחשב את יעילות הטרנספורמציה, שהוא מספר טרנספורמטים מוצלחים חלקי הכמות הכוללת של DNA מצופה.
עכשיו, מושבות ניתן לבחור לניסויים נוספים.
לפני שנעשה מוכשר החיידקים המשמשים בטרנספורמציה מאוחסנים במקפיא. יש להפשיר עליהם על קרח, להתפשט על צלחת אגר – ללא אנטיביוטיקה, ולאפשר להם לגדול בין לילה ב-37 מעלות צלזיוס.
באמצעות טכניקה אספטית, בחר מושבה חיידקית מצלחת אגר וגדל אותה בתרבית גדולה של 500 מ"ל בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד – מכשיר, המונע משקעים של החיידקים ואפילו פיזור של חומרים מזינים בתקשורת.
בעוד התאים גדלים לעשות 0.1 סידן כלורי 0.1 סידן כלורי 0.1 סידן כלורי בתוספת 15% פתרונות גליצריל, autoclave, ולתת מגניב.
מדידות ספיגה משמשות כדי לקבוע אם החיידקים נמצאים בשלב אמצע היומן של הצמיחה שלהם, מה שאומר שהם בקלות לקחת DNA. ברגע שהתאים הגיעו לשלב זה, הנח אותם על קרח ולשמור אותם שם לאורך כל ההליך.
לאחר מכן, להפריד את התאים החיידקיים לתוך שני צינורות צנטריפוגה גדולים להסתובב ב 4 מעלות צלזיוס. יוצקים את supernatant ו resuspend בכ 100 מ"ל 0.1 טחנת של סידן כלורי קר. לאחר מכן, דגירה תאים על קרח במשך 30 דקות. צעד זה חוזר על עצמו לפחות פעם נוספת. מחזורים של תאים מסתובבים וממתינים מחדש מכונים לעתים קרובות שטיפת התאים שלך.
לאחר השטיפה הסופית, resuspend תאים קר 50mL 0.1 סידן כלורי בתוספת 15% תמיסת גליסול. תאים אלה הם עכשיו מוכשרים מבחינה כימית.
יש להפיץ 50μL של חיידקים לצינורות מיקרו-פוג מרובים ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן להלם חום.
קיימים יישומים רבים וריאציות של טרנספורמציה חיידקית.
בנוסף הלם חום, eletroporation היא טכניקה נפוצה נוספת עבור טרנספורמציה. כפי ששמו מרמז אלקטרופורציה כרוכה בשימוש בחשמל כדי להפוך נקבוביות בקרום התא החיידקי שדרכו DNA יכול לעבור.
לגבי הקרנה עבור חיידקים שעברו טרנספורמציה, plasmids לעתים קרובות מכילים גן קידוד האנזים בטא-גלקטוזידאז כדי לסייע עם הקרנה. כאשר המצע של אנזים זה כלול בצלחות אגר, חיידקים שעברו טרנסגמה עם פלסמידים המכילים מושבות לבנות תשואה להוסיף, בעוד אלה שלא, מניבים מושבות כחולות. שיטה זו נקראת הקרנה כחול לבן.
ברוב ניסויי הטרנספורמציה המטרה היא לגרום לחיידקים המפרידים במהירות לייצר כמויות גדולות של הפלסמיד שלך, הכולל את גן היעד שלך. בעקבות טרנספורמציה חיידקית, השלב הבא הוא לגדל כמויות גדולות של החיידקים במדיום נוזלי המכיל אנטיביוטיקה ולבצע טיהור plasmid, אשר, כפי שהוא מרמז, כרוך בטיהור plasmids מחיידקים. ערכות מסחריות רבות זמינות למטרה זו.
לפעמים המטרה של טרנספורמציה היא שחיידקים ייצרו כמויות גדולות של חלבון המקודד על ידי הפלסמיד. כאן אתה רואה תאים חיידקיים להיות הומוגניים lysed לפני טכניקה הנקראת טיהור זיקה יכול להתבצע כדי לבודד את חלבון היעד. לאחר טיהור כמויות גדולות של החלבון זה אז יכול להיות מגובש ואת המבנה של חלבון מסוים של עניין ניתן לזהות.
הרגע צפיתם ב-JoVE Introduction לתמורות של הלם חום. בסרטון זה סקרנו: מהו טרנספורמציה של הלם חום וכיצד הוא עובד, העיקר שמאחוריו וכיצד להפוך חיידקים מוצלחים. תודה שצפיתם!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a plasmid and why is it used in bacterial transformation?
A plasmid is a small, circular, double-stranded DNA molecule that can reduce its size through supercoiling, allowing it to pass through bacterial cell membrane pores. Plasmids contain a multiple cloning site for inserting DNA fragments, an origin of replication for DNA copying, and an antibiotic resistance gene that lets transformed cells survive in antibiotic-containing media.
Q2: How does calcium chloride make bacterial cells competent?
Calcium chloride creates a calcium-rich environment where positive calcium ions neutralize negative charges on both the plasmid DNA and bacterial cell wall. This neutralization reduces electrostatic repulsion and weakens the cell wall, preparing cells to take up foreign DNA during the heat shock procedure.
Q3: What happens during the heat shock step of bacterial transformation?
A sudden temperature increase to 42°C for 30 seconds creates a pressure difference between the cell's interior and exterior, inducing pore formation in the bacterial membrane. Supercoiled plasmid DNA enters through these pores. After heat shock, cells are immediately cooled on ice, allowing the cell wall to self-heal and stabilize the plasmid inside.
Q4: What is transformation efficiency and how is it calculated?
Transformation efficiency measures the success rate of the transformation procedure. It is calculated by dividing the number of successful transformants (colonies containing the plasmid) by the total amount of DNA plated. This metric helps researchers evaluate how effectively the heat shock method introduced plasmids into bacterial cells.
Q5: How are chemically competent cells prepared before heat shock transformation?
Bacteria are grown to mid-log phase, then centrifuged and washed multiple times with cold calcium chloride solution to remove growth media. After the final wash, cells are resuspended in calcium chloride plus 15% glycerol, distributed into microfuge tubes, and stored at -80°C until needed for transformation.
Q6: Why is aseptic technique important during bacterial transformation?
Aseptic technique maintains sterility throughout the transformation procedure by preventing airborne contaminants from entering the workspace. A Bunsen burner sterilizes instruments and reagents while creating a convection current that keeps contaminants away. This ensures that only the desired transformed bacteria grow on agar plates.
Q7: What happens after transformed bacteria are plated and what is the next step?
Plates are incubated overnight at 37°C upside down to prevent condensation exposure. The next day, colonies containing the plasmid are visible and can be counted to calculate transformation efficiency. Selected colonies can then be grown in antibiotic-containing liquid medium for plasmid purification isolation and purification of plasmid DNA for further experimentation.