Question 1

מהו פלסמיד ומדוע הוא משמש בטרנספורמציה של חיידקים?

Accepted Answer

פלסמיד הוא מולקולת DNA קטנה, מעגלית ודו-גדילית, שיכולה להקטין את גודלה באמצעות סלילה-מראת (supercoiling), מה שמאפשר לה לעבור דרך נקבי ממברנת התא הבקטריאלי. פלסמידים מכילים אתר שיבוט מרובה להחדרת מקטעי DNA, נקודת מוצא לשכפול (origin of replication) להעתקת ה-DNA, וגן לעמידות לאנטיביוטיקה המאפשר לתאים שעברו טרנספורמציה לשרוד במצעים המכילים אנטיביוטיקה.

Question 2

כיצד סידן כלוריד הופך תאי חיידקים לקומפטנטיים?

Accepted Answer

סידום כלוריד יוצר סביבה עשירה בסידן, שבה יוני סידן חיוביים מנטרלים מטענים שליליים הן ב-DNA הפלסמידי והן בדופן התא הבקטריאלי. נטרול זה מפחית את הדחייה האלקטרוסטטית ומחליש את דופן התא, ובכך מכין את התאים לקליטת DNA זר במהלך הליך ההלם התרמי.

Question 3

מה קורה במהלך שלב ההלם התרמי של טרנספורמציה חיידקית?

Accepted Answer

עלייה פתאומית בטמפרטורה ל-42°C למשך 30 שניות יוצרת הפרש לחצים בין פנים התא לחוצהו, מה שגורם להיווצרות נקבים בממברנה הבקטריאלית. DNA פלסמידי מסולס (Supercoiled) חודר פנימה דרך נקבים אלו. לאחר ההלם התרמי, התאים מקוררים מיד על קרח, דבר המאפשר לדופן התא להירפא ולהתייצב, ובכך לקבע את הפלסמיד בתוך התא.

Question 4

מהי יעילות טרנספורמציה וכיצד היא מחושבת?

Accepted Answer

יעילות הטרנספורמציה מודדת את שיעור ההצלחה של הליך הטרנספורמציה. היא מחושבת על ידי חלוקת מספר הטרנספורמנטים המוצלחים (מושבות המכילות את הפלסמיד) בכמות ה-DNA הכוללת שהועברה לצלחת. מדד זה מסייע לחוקרים להעריך באיזו יעילות שיטת ההלם התרמי הכניסה פלסמידים לתאי החיידקים.

Question 5

כיצד מכינים תאים בעלי כשירות כימית (chemically competent cells) לפני טרנספורמציה בשיטת ההלם התרמי?

Accepted Answer

מגדלים חיידקים עד לשלב הלוגריתמי האמצעי (mid-log phase), לאחר מכן סובבים אותם בצנטריפוגה ושוטפים אותם מספר פעמים בתמיסת סידן כלוריד קרה כדי להסיר את מצע הגידול. לאחר השטיפה האחרונה, התאים מומסים מחדש בסידן כלוריד בתוספת 15% גליצריול, מחולקים למבחנות מיקרו-צנטריפוגה, ונשמרים בטמפרטורה של 80°C- עד למועד השימוש בהם לטרנספורמציה.

Question 6

מדוע טכניקה אספטית חשובה במהלך טרנספורמציה של חיידקים?

Accepted Answer

טכניקה אספטית שומרת על סטריליות לאורך כל הליך הטרנספורמציה על ידי מניעת חדירת מזהמים מהאוויר למרחב העבודה. מבער בנזן מעקר מכשירים וריאגנטים תוך써 יצירת זרם קונבקציה המרחיק מזהמים. דבר זה מבטיח שרק החיידקים הטרנספורמיים הרצויים יגדלו על פלטות אגר.

Question 7

מה קורה לאחר שזרעו את החיידקים שעברו טרנספורמציה, ומהו השלב הבא?

Accepted Answer

את הצלחות הפטריות מדגירים למשך לילה בטמפרטורה של 37°C כשהן הפוכות, כדי למנוע חשיפה לעיבוי. למחרת, מושבות המכילות את הפלסמיד נראות לעין וניתן לספור אותן כדי לחשב את יעילות הטרנספורמציה. ניתן להעביר מושבות נבחרות לגידול במצע נוזלי המכיל אנטיביוטיקה לצורך בידוד וטיהור של ה-DNA הפלסמי עבור ניסויים נוספים.

טרנספורמציה חיידקית: שיטת הלם החום - חידון הערכה