טרנספורמציה חיידקית: אלקטרופורציה
טרנספורמציה חיידקית היא תהליך טבעי, שבו חיידקים בולעים דנ"א זר ואז מגבירים או משכפלים אותו. במעבדה, תהליך זה יכול להיות מושרה באופן מלאכותי, באמצעות פולסים שדה חשמלי מתח גבוה כדי ליצור נקבוביות בקרום התא החיידקי, שדרכו DNA plasmid יכול לעבור. Electroporation מתייחס לשיטה זו והסרטון הבא ידגים את עקרונותיו, הליך שלב אחר שלב ויישומים.
לפני שנדבר על אלקטרופורציה של חיידקים, חשוב להבין את סוג הדנ"א המשמש בניסויים אלה: הפלסמיד. פלסמיד הוא פיסת דנ"א קטנה, מעגלית, חוץ-כרומוסומלית, הפועלת כווקטור, נושאת של רצף הדנ"א הספציפי שלך.
בין אם רצף זה הוא גן לחלבון פלואורסצנטי במדוזות או אנזים מצמחים, הוא מוחדר לפלסמיד דרך אזור הנקרא אתר השיבוט המרובה או MCS. אזור זה מכיל רצפים ספציפיים המבקעים על ידי אנדונקולאזים מגבילים או אנזימי הגבלה. ניתן להשתמש באותם אנזימי הגבלה כדי לחתוך את רצף העניין שלך, כך שהקצוות משלימים את הקצוות החתוכים החדשים של הפלסמיד.
Plasmids מכילים גם מקור של שכפול, ORI מקוצר, המציין את הנקודה שבה הוא ישוכפל. כשמדובר בטרנספורמציה הגן עמיד לאנטיביוטיקה הוא בעל חשיבות חיונית. כפי ששמו מרמז על גן זה מאפשר לחיידקים לייצר אנזים המנטרל אנטיביוטיקה המאפשרת להם לשרוד באנטיביוטיקה המכילה מדיה.
אלקטרופורציה עושה שימוש במכשיר מיוחד שנקרא אלקטרופורטור. בדרך כלל תאים ממוקמים לתוך cuvette אלקטרופורציה, אשר יש אלקטרודות בכל צד כי ליצור מגע חשמלי עם המכונה פעם מוכנס.
תאים חיידקיים מעורבבים עם DNA נטענים לתוך cuvette אלקטרופורציה ושדה חשמלי על הסדר 1000 עד 10,000 וולט לסנטימטר מוחל במשך כמה אלפיות השנייה. זה גורם למתח על פני הממברנה להגיע 0.5-1 וולט, אשר הוא האמין להוביל ארגון מחדש של bilayer פוספוליפיד הכולל את קרום התא כך נקבוביות ייווצרו. במצב זה DNA plasmid יעבור דרך הממברנה וכאשר פעימה הושלמה bilayer יתקן את עצמו.
לאחר שלקח את plasmid, חיידקים יכולים אז לגדול על לוחות אגר המכילים אנטיביוטיקה.
עכשיו שלמדנו על פלסמידים ומנגנון האלקטרופורציה. בואו נסתכל על איך ההליך מתנהל.
תאים שיכולים בקלות לקחת DNA מכונים תאים מוסמכים. הסוג הנפוץ ביותר של חיידקים מוסמכים שמשתנה במחקר ביולוגיה מולקולרית הוא E. coli, שהם החיידקים הפרוקריוטים שהופכים את ביתם במעי התחתון. E. coli המוכנים אלקטרופורציה מכונים תאים אלקטרו-קומפטנטיים.
בכל פעם שאתם מטפלים בחיידקים, ודאו שאזור העבודה נקי ככל האפשר.
טיפול בחיידקים דורש גם טכניקה אספטית בפועל אחת. בדרך כלל זה כרוך בשימוש במבער Bunsen כדי לעקר מכשירים וליצור זרם convection - אשר שומר מזהמים באוויר הרחק מסביבת העבודה.
מיד לפני אלקטרופורציה, מדיה חמה מראש לטמפרטורת החדר, להביא לוחות אגר המכילים אנטיביוטיקה ל 37 מעלות צלזיוס, ו cuvettes אלקטרופורציה מגניב על קרח.
לאחר מכן, להפשיר תאים אלקטרו-קומפטנטיים שטפו על קרח.
מוסיפים 1-5uL של פלסמיד קר 1ng/μL שהוא ללא מלח לתאי חיידקים, מערבבים בעדינות ומוסיפים את התערובת לתערובת הקרה. תוודא שאין בועות.
הגדר את המתח ואת עוצמת השדה של האלקטרופורטור להגדרות הנכונות עבור התאים שלך. כאן אתה רואה אלקטרופורטור מוגדר 1700 וולט ומפיק כוח שדה של 17kV / ס"מ.
נגב את החלק החיצוני של הקובט יבש והכניס אותו לתוך האלקטרופורטור. פעם את התאים עד שאתה שומע צפצוף.
פעימה לא מוצלחת גורמת לפריקה חשמלית, אשר ניתן להבחין כמו ניצוץ גלוי פופ נשמע. פריקה זו, המכונה קשתות, יכולה להיות תוצאה של יותר מדי מלח בתאים המוכשרים שלך או DNA.
ניתן לחזות את הצלחת השינוי שלך על ידי ציין את קבוע הזמן, שהוא משך הזמן שלוקח למתח להתפורר לאחר החלת הדופק. כאשר מלח קיים ואת פתרון electroporation הוא מוליך מאוד, הריקבון קורה במהירות, גרימת הפריקה, ובכך להרוג רבים של התאים שלך. עבור חיידקים, קבועי זמן טובים נעים בין 5-10 אלפיות השנייה.
מיד לאחר פעימות, להסיר את cuvette ולהוסיף 1 מ"ל של מדיה ישירות לתאים. תא זה המכיל מדיה ממוקם בצינור ודגורה ב 37 °C במשך 1 שעה, עם רועד, על מנת התאים להתאושש.
לאחר מכן, באמצעות טכניקה אספטית להוסיף 20-200uL של התא לאנטיביוטיקה המכילה צלחת אגר. הפוך את הצלחות כך אגר הוא על גבי ולכן עיבוי לא נופל לתוך התאים שלך לדגורת לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
חיידקים שעברו טרנספורמציה עם הפלסמיד אמורים ליצור מושבות. לספור את המושבות ולחשב את יעילות הטרנספורמציה, שהוא מספר טרנספורמטים מוצלחים חלקי הכמות הכוללת של DNA מצופה.
אגר ומדיה, המספקים את התזונה עבור החיידקים שלך, צריך להיות מוכן מראש מעוקר באמצעות autoclaving. אפשרו למדיה נוזלית להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש ולתת לאגר להתקרר ל-50-55 מעלות צלזיוס – הטמפרטורה שבה ניתן להוסיף אנטיביוטיקה ולשפוך צלחות. לאחר מכן, אפשר לצלחות להתקרר לטמפרטורת החדר כדי להתמצק.
מאז חיידקים המשמשים טרנספורמציה מאוחסנים במקפיא, הם חייבים להיות מופשרים תחילה על קרח, להתפשט על צלחת אגר ללא אנטיביוטיקה ולאחר מכן גדל לילה ב 37°C.
באמצעות טכניקה אספטית לבחור מושבה חיידקית מן צלחת אגר ולהגדיל אותו בתרבות גדולה יותר 500mL לילה ב 37 °C באינקובטור רועד.
בזמן שהתאים גדלים, להכין על ליטר מים deionized ולהוות 10% גלילצל ומים, נפח לפתרון נפח. יש לאבודד את הפתרונות ולתת להם להתקרר ב-4°C.
מדידות ספיגה משמשות כדי לקבוע אם החיידקים נמצאים בשלב אמצע יומן הצמיחה שלהם, מה שאומר שהם בקלות לקחת DNA. ברגע שהתאים הגיעו לשלב זה, הנח אותם על קרח ולשמור אותם שם לאורך כל ההליך.
לאחר מכן, לשטוף תאים על ידי הפרדתם בשני צינורות צנטריפוגה גדולים להסתובב ב 4 מעלות צלזיוס, לשפוך את supernatant ו resuspend במים סטריליים 100mL עקר. חזור על שלב זה לפחות עוד פעם אחת. מטרת צעד זה היא להסיר מלח, אשר ישפיע מאוד על טכניקת electroporation.
בצע שתי שטיפות נוספות ב 50 מ"ל של 10% גלילצל במים ולבסוף resuspend החיידקים באותה פתרון.
הוסף 50μL של תאים לתוך צינורות אפנדורף מרובים. תאים אלה מוכנים כעת לשימוש אלקטרופורציה ויש לשמור על 4°C. או שהם יכולים להיות קפואים מהבהבים ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס.
כפי שאתה עומד לראות, אלקטרופורציה יש יישומים רבים.
חלופה לאלקטרופורציה היא טרנספורמציה של הלם חום, הנשענת על חשיפת החיידקים הן לסידן כלוריד והן לחום על מנת להכניס DNA לתאים שלך.
באופן כללי, הלם חום הוא עדין יותר על החיידקים שלך מאשר אלקטרופורציה ואינו דורש מלח נמוך. תגובות קשירה, אלה הכרוכות בהכנסת גן היעד שלך לתוך plasmid, ניתן להשתמש ישירות טרנספורמציה הלם חום. טרנספורמציית הלם חום זולה יותר מאלקטרופורציה ולא מסתמכת על ציוד יקר או cuvettes. מצד שני, הלם חום מוביל ליעילות טרנספורמציה נמוכה יותר מאשר אלקטרופורציה ולוקח יותר זמן. כמו כן הוא מוגבל חיידקים, שמרים ופרוטופלסטים צמחיים בעוד אלקטרופורציה ניתן להחיל על תאים יונקים.
כאן אתה רואה פיברובלסטים עובריים של עכבר נטענים לתוך cuvette אלקטרופורציה. לאחר השלמת האלקטרופורציה, יעילות הטרנספורמציה יכולה להיקבע על ידי התבוננות במידת החלבון הפלואורסצנטי הירוק המקודד על ידי הפלסמיד. טרנספקטיון הוא המונח שניתן לשינוי של תאי יונקים, אשר בדרך כלל דורש עוצמות שדה נמוכות יותר מאשר תאים חיידקיים וקבועי זמן גבוהים יותר.
אלקטרופורציה יכולה להתבצע גם בבעלי חיים שלמים כמו עובר העוף המתפתח שראית כאן. DNA Plasmid מוזרק למוחו של האפרוח ולאחר מכן בדיקה אלקטרופורציה משמשת כדי להחיל שדה חשמלי על רקמת המוח. לאחר יום או יומיים, חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים - המקודדים על ידי הפלסמיד - מיוצרים על ידי נוירונים, ומדענים יכולים לצפות בשינויים מבניים במוח האפרוח המתפתח.
הרגע צפיתם בהקדמה של JoVE לשינוי חיידקי על ידי אלקטרופורציה. וידאו זה הציג את הפלסמיד כסוג ה- DNA הנפוץ ביותר, דן במנגנון הביופיסי שנחשב כבסיס לאלקטרופורציה, הראה הליך כללי לביצוע אלקטרופורציה, ותיאר כיצד ניתן להשתמש באלקטרפורציה במערכת היונקים. תודה שצפיתם!
המונח "טרנספורמציה" מתייחס בליעה תאית של DNA זר. בטבע, טרנספורמציה יכולה להתרחש בסוגים מסוימים של חיידקים. בביולוגיה מולקולרית, לעומת זאת, טרנספורמציה…
טרנספורמציה חיידקית היא תהליך טבעי, שבו חיידקים בולעים דנ"א זר ואז מגבירים או משכפלים אותו. במעבדה, תהליך זה יכול להיות מושרה באופן מלאכותי, באמצעות פולסים שדה חשמלי מתח גבוה כדי ליצור נקבוביות בקרום התא החיידקי, שדרכו DNA plasmid יכול לעבור. Electroporation מתייחס לשיטה זו והסרטון הבא ידגים את עקרונותיו, הליך שלב אחר שלב ויישומים.
לפני שנדבר על אלקטרופורציה של חיידקים, חשוב להבין את סוג הדנ"א המשמש בניסויים אלה: הפלסמיד. פלסמיד הוא פיסת דנ"א קטנה, מעגלית, חוץ-כרומוסומלית, הפועלת כווקטור, נושאת של רצף הדנ"א הספציפי שלך.
בין אם רצף זה הוא גן לחלבון פלואורסצנטי במדוזות או אנזים מצמחים, הוא מוחדר לפלסמיד דרך אזור הנקרא אתר השיבוט המרובה או MCS. אזור זה מכיל רצפים ספציפיים המבקעים על ידי אנדונקולאזים מגבילים או אנזימי הגבלה. ניתן להשתמש באותם אנזימי הגבלה כדי לחתוך את רצף העניין שלך, כך שהקצוות משלימים את הקצוות החתוכים החדשים של הפלסמיד.
Plasmids מכילים גם מקור של שכפול, ORI מקוצר, המציין את הנקודה שבה הוא ישוכפל. כשמדובר בטרנספורמציה הגן עמיד לאנטיביוטיקה הוא בעל חשיבות חיונית. כפי ששמו מרמז על גן זה מאפשר לחיידקים לייצר אנזים המנטרל אנטיביוטיקה המאפשרת להם לשרוד באנטיביוטיקה המכילה מדיה.
אלקטרופורציה עושה שימוש במכשיר מיוחד שנקרא אלקטרופורטור. בדרך כלל תאים ממוקמים לתוך cuvette אלקטרופורציה, אשר יש אלקטרודות בכל צד כי ליצור מגע חשמלי עם המכונה פעם מוכנס.
תאים חיידקיים מעורבבים עם DNA נטענים לתוך cuvette אלקטרופורציה ושדה חשמלי על הסדר 1000 עד 10,000 וולט לסנטימטר מוחל במשך כמה אלפיות השנייה. זה גורם למתח על פני הממברנה להגיע 0.5-1 וולט, אשר הוא האמין להוביל ארגון מחדש של bilayer פוספוליפיד הכולל את קרום התא כך נקבוביות ייווצרו. במצב זה DNA plasmid יעבור דרך הממברנה וכאשר פעימה הושלמה bilayer יתקן את עצמו.
לאחר שלקח את plasmid, חיידקים יכולים אז לגדול על לוחות אגר המכילים אנטיביוטיקה.
עכשיו שלמדנו על פלסמידים ומנגנון האלקטרופורציה. בואו נסתכל על איך ההליך מתנהל.
תאים שיכולים בקלות לקחת DNA מכונים תאים מוסמכים. הסוג הנפוץ ביותר של חיידקים מוסמכים שמשתנה במחקר ביולוגיה מולקולרית הוא E. coli, שהם החיידקים הפרוקריוטים שהופכים את ביתם במעי התחתון. E. coli המוכנים אלקטרופורציה מכונים תאים אלקטרו-קומפטנטיים.
בכל פעם שאתם מטפלים בחיידקים, ודאו שאזור העבודה נקי ככל האפשר.
טיפול בחיידקים דורש גם טכניקה אספטית בפועל אחת. בדרך כלל זה כרוך בשימוש במבער Bunsen כדי לעקר מכשירים וליצור זרם convection - אשר שומר מזהמים באוויר הרחק מסביבת העבודה.
מיד לפני אלקטרופורציה, מדיה חמה מראש לטמפרטורת החדר, להביא לוחות אגר המכילים אנטיביוטיקה ל 37 מעלות צלזיוס, ו cuvettes אלקטרופורציה מגניב על קרח.
לאחר מכן, להפשיר תאים אלקטרו-קומפטנטיים שטפו על קרח.
מוסיפים 1-5uL של פלסמיד קר 1ng/μL שהוא ללא מלח לתאי חיידקים, מערבבים בעדינות ומוסיפים את התערובת לתערובת הקרה. תוודא שאין בועות.
הגדר את המתח ואת עוצמת השדה של האלקטרופורטור להגדרות הנכונות עבור התאים שלך. כאן אתה רואה אלקטרופורטור מוגדר 1700 וולט ומפיק כוח שדה של 17kV / ס"מ.
נגב את החלק החיצוני של הקובט יבש והכניס אותו לתוך האלקטרופורטור. פעם את התאים עד שאתה שומע צפצוף.
פעימה לא מוצלחת גורמת לפריקה חשמלית, אשר ניתן להבחין כמו ניצוץ גלוי פופ נשמע. פריקה זו, המכונה קשתות, יכולה להיות תוצאה של יותר מדי מלח בתאים המוכשרים שלך או DNA.
ניתן לחזות את הצלחת השינוי שלך על ידי ציין את קבוע הזמן, שהוא משך הזמן שלוקח למתח להתפורר לאחר החלת הדופק. כאשר מלח קיים ואת פתרון electroporation הוא מוליך מאוד, הריקבון קורה במהירות, גרימת הפריקה, ובכך להרוג רבים של התאים שלך. עבור חיידקים, קבועי זמן טובים נעים בין 5-10 אלפיות השנייה.
מיד לאחר פעימות, להסיר את cuvette ולהוסיף 1 מ"ל של מדיה ישירות לתאים. תא זה המכיל מדיה ממוקם בצינור ודגורה ב 37 °C במשך 1 שעה, עם רועד, על מנת התאים להתאושש.
לאחר מכן, באמצעות טכניקה אספטית להוסיף 20-200uL של התא לאנטיביוטיקה המכילה צלחת אגר. הפוך את הצלחות כך אגר הוא על גבי ולכן עיבוי לא נופל לתוך התאים שלך לדגורת לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
חיידקים שעברו טרנספורמציה עם הפלסמיד אמורים ליצור מושבות. לספור את המושבות ולחשב את יעילות הטרנספורמציה, שהוא מספר טרנספורמטים מוצלחים חלקי הכמות הכוללת של DNA מצופה.
אגר ומדיה, המספקים את התזונה עבור החיידקים שלך, צריך להיות מוכן מראש מעוקר באמצעות autoclaving. אפשרו למדיה נוזלית להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש ולתת לאגר להתקרר ל-50-55 מעלות צלזיוס – הטמפרטורה שבה ניתן להוסיף אנטיביוטיקה ולשפוך צלחות. לאחר מכן, אפשר לצלחות להתקרר לטמפרטורת החדר כדי להתמצק.
מאז חיידקים המשמשים טרנספורמציה מאוחסנים במקפיא, הם חייבים להיות מופשרים תחילה על קרח, להתפשט על צלחת אגר ללא אנטיביוטיקה ולאחר מכן גדל לילה ב 37°C.
באמצעות טכניקה אספטית לבחור מושבה חיידקית מן צלחת אגר ולהגדיל אותו בתרבות גדולה יותר 500mL לילה ב 37 °C באינקובטור רועד.
בזמן שהתאים גדלים, להכין על ליטר מים deionized ולהוות 10% גלילצל ומים, נפח לפתרון נפח. יש לאבודד את הפתרונות ולתת להם להתקרר ב-4°C.
מדידות ספיגה משמשות כדי לקבוע אם החיידקים נמצאים בשלב אמצע יומן הצמיחה שלהם, מה שאומר שהם בקלות לקחת DNA. ברגע שהתאים הגיעו לשלב זה, הנח אותם על קרח ולשמור אותם שם לאורך כל ההליך.
לאחר מכן, לשטוף תאים על ידי הפרדתם בשני צינורות צנטריפוגה גדולים להסתובב ב 4 מעלות צלזיוס, לשפוך את supernatant ו resuspend במים סטריליים 100mL עקר. חזור על שלב זה לפחות עוד פעם אחת. מטרת צעד זה היא להסיר מלח, אשר ישפיע מאוד על טכניקת electroporation.
בצע שתי שטיפות נוספות ב 50 מ"ל של 10% גלילצל במים ולבסוף resuspend החיידקים באותה פתרון.
הוסף 50μL של תאים לתוך צינורות אפנדורף מרובים. תאים אלה מוכנים כעת לשימוש אלקטרופורציה ויש לשמור על 4°C. או שהם יכולים להיות קפואים מהבהבים ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס.
כפי שאתה עומד לראות, אלקטרופורציה יש יישומים רבים.
חלופה לאלקטרופורציה היא טרנספורמציה של הלם חום, הנשענת על חשיפת החיידקים הן לסידן כלוריד והן לחום על מנת להכניס DNA לתאים שלך.
באופן כללי, הלם חום הוא עדין יותר על החיידקים שלך מאשר אלקטרופורציה ואינו דורש מלח נמוך. תגובות קשירה, אלה הכרוכות בהכנסת גן היעד שלך לתוך plasmid, ניתן להשתמש ישירות טרנספורמציה הלם חום. טרנספורמציית הלם חום זולה יותר מאלקטרופורציה ולא מסתמכת על ציוד יקר או cuvettes. מצד שני, הלם חום מוביל ליעילות טרנספורמציה נמוכה יותר מאשר אלקטרופורציה ולוקח יותר זמן. כמו כן הוא מוגבל חיידקים, שמרים ופרוטופלסטים צמחיים בעוד אלקטרופורציה ניתן להחיל על תאים יונקים.
כאן אתה רואה פיברובלסטים עובריים של עכבר נטענים לתוך cuvette אלקטרופורציה. לאחר השלמת האלקטרופורציה, יעילות הטרנספורמציה יכולה להיקבע על ידי התבוננות במידת החלבון הפלואורסצנטי הירוק המקודד על ידי הפלסמיד. טרנספקטיון הוא המונח שניתן לשינוי של תאי יונקים, אשר בדרך כלל דורש עוצמות שדה נמוכות יותר מאשר תאים חיידקיים וקבועי זמן גבוהים יותר.
אלקטרופורציה יכולה להתבצע גם בבעלי חיים שלמים כמו עובר העוף המתפתח שראית כאן. DNA Plasmid מוזרק למוחו של האפרוח ולאחר מכן בדיקה אלקטרופורציה משמשת כדי להחיל שדה חשמלי על רקמת המוח. לאחר יום או יומיים, חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים - המקודדים על ידי הפלסמיד - מיוצרים על ידי נוירונים, ומדענים יכולים לצפות בשינויים מבניים במוח האפרוח המתפתח.
הרגע צפיתם בהקדמה של JoVE לשינוי חיידקי על ידי אלקטרופורציה. וידאו זה הציג את הפלסמיד כסוג ה- DNA הנפוץ ביותר, דן במנגנון הביופיסי שנחשב כבסיס לאלקטרופורציה, הראה הליך כללי לביצוע אלקטרופורציה, ותיאר כיצד ניתן להשתמש באלקטרפורציה במערכת היונקים. תודה שצפיתם!
טרנספורמציה חיידקית היא תהליך טבעי, שבו חיידקים בולעים דנ"א זר ואז מגבירים או משכפלים אותו. במעבדה, תהליך זה יכול להיות מושרה באופן מלאכותי, באמצעות פולסים שדה חשמלי מתח גבוה כדי ליצור נקבוביות בקרום התא החיידקי, שדרכו DNA plasmid יכול לעבור. Electroporation מתייחס לשיטה זו והסרטון הבא ידגים את עקרונותיו, הליך שלב אחר שלב ויישומים.
לפני שנדבר על אלקטרופורציה של חיידקים, חשוב להבין את סוג הדנ"א המשמש בניסויים אלה: הפלסמיד. פלסמיד הוא פיסת דנ"א קטנה, מעגלית, חוץ-כרומוסומלית, הפועלת כווקטור, נושאת של רצף הדנ"א הספציפי שלך.
בין אם רצף זה הוא גן לחלבון פלואורסצנטי במדוזות או אנזים מצמחים, הוא מוחדר לפלסמיד דרך אזור הנקרא אתר השיבוט המרובה או MCS. אזור זה מכיל רצפים ספציפיים המבקעים על ידי אנדונקולאזים מגבילים או אנזימי הגבלה. ניתן להשתמש באותם אנזימי הגבלה כדי לחתוך את רצף העניין שלך, כך שהקצוות משלימים את הקצוות החתוכים החדשים של הפלסמיד.
Plasmids מכילים גם מקור של שכפול, ORI מקוצר, המציין את הנקודה שבה הוא ישוכפל. כשמדובר בטרנספורמציה הגן עמיד לאנטיביוטיקה הוא בעל חשיבות חיונית. כפי ששמו מרמז על גן זה מאפשר לחיידקים לייצר אנזים המנטרל אנטיביוטיקה המאפשרת להם לשרוד באנטיביוטיקה המכילה מדיה.
אלקטרופורציה עושה שימוש במכשיר מיוחד שנקרא אלקטרופורטור. בדרך כלל תאים ממוקמים לתוך cuvette אלקטרופורציה, אשר יש אלקטרודות בכל צד כי ליצור מגע חשמלי עם המכונה פעם מוכנס.
תאים חיידקיים מעורבבים עם DNA נטענים לתוך cuvette אלקטרופורציה ושדה חשמלי על הסדר 1000 עד 10,000 וולט לסנטימטר מוחל במשך כמה אלפיות השנייה. זה גורם למתח על פני הממברנה להגיע 0.5-1 וולט, אשר הוא האמין להוביל ארגון מחדש של bilayer פוספוליפיד הכולל את קרום התא כך נקבוביות ייווצרו. במצב זה DNA plasmid יעבור דרך הממברנה וכאשר פעימה הושלמה bilayer יתקן את עצמו.
לאחר שלקח את plasmid, חיידקים יכולים אז לגדול על לוחות אגר המכילים אנטיביוטיקה.
עכשיו שלמדנו על פלסמידים ומנגנון האלקטרופורציה. בואו נסתכל על איך ההליך מתנהל.
תאים שיכולים בקלות לקחת DNA מכונים תאים מוסמכים. הסוג הנפוץ ביותר של חיידקים מוסמכים שמשתנה במחקר ביולוגיה מולקולרית הוא E. coli, שהם החיידקים הפרוקריוטים שהופכים את ביתם במעי התחתון. E. coli המוכנים אלקטרופורציה מכונים תאים אלקטרו-קומפטנטיים.
בכל פעם שאתם מטפלים בחיידקים, ודאו שאזור העבודה נקי ככל האפשר.
טיפול בחיידקים דורש גם טכניקה אספטית בפועל אחת. בדרך כלל זה כרוך בשימוש במבער Bunsen כדי לעקר מכשירים וליצור זרם convection - אשר שומר מזהמים באוויר הרחק מסביבת העבודה.
מיד לפני אלקטרופורציה, מדיה חמה מראש לטמפרטורת החדר, להביא לוחות אגר המכילים אנטיביוטיקה ל 37 מעלות צלזיוס, ו cuvettes אלקטרופורציה מגניב על קרח.
לאחר מכן, להפשיר תאים אלקטרו-קומפטנטיים שטפו על קרח.
מוסיפים 1-5uL של פלסמיד קר 1ng/μL שהוא ללא מלח לתאי חיידקים, מערבבים בעדינות ומוסיפים את התערובת לתערובת הקרה. תוודא שאין בועות.
הגדר את המתח ואת עוצמת השדה של האלקטרופורטור להגדרות הנכונות עבור התאים שלך. כאן אתה רואה אלקטרופורטור מוגדר 1700 וולט ומפיק כוח שדה של 17kV / ס"מ.
נגב את החלק החיצוני של הקובט יבש והכניס אותו לתוך האלקטרופורטור. פעם את התאים עד שאתה שומע צפצוף.
פעימה לא מוצלחת גורמת לפריקה חשמלית, אשר ניתן להבחין כמו ניצוץ גלוי פופ נשמע. פריקה זו, המכונה קשתות, יכולה להיות תוצאה של יותר מדי מלח בתאים המוכשרים שלך או DNA.
ניתן לחזות את הצלחת השינוי שלך על ידי ציין את קבוע הזמן, שהוא משך הזמן שלוקח למתח להתפורר לאחר החלת הדופק. כאשר מלח קיים ואת פתרון electroporation הוא מוליך מאוד, הריקבון קורה במהירות, גרימת הפריקה, ובכך להרוג רבים של התאים שלך. עבור חיידקים, קבועי זמן טובים נעים בין 5-10 אלפיות השנייה.
מיד לאחר פעימות, להסיר את cuvette ולהוסיף 1 מ"ל של מדיה ישירות לתאים. תא זה המכיל מדיה ממוקם בצינור ודגורה ב 37 °C במשך 1 שעה, עם רועד, על מנת התאים להתאושש.
לאחר מכן, באמצעות טכניקה אספטית להוסיף 20-200uL של התא לאנטיביוטיקה המכילה צלחת אגר. הפוך את הצלחות כך אגר הוא על גבי ולכן עיבוי לא נופל לתוך התאים שלך לדגורת לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
חיידקים שעברו טרנספורמציה עם הפלסמיד אמורים ליצור מושבות. לספור את המושבות ולחשב את יעילות הטרנספורמציה, שהוא מספר טרנספורמטים מוצלחים חלקי הכמות הכוללת של DNA מצופה.
אגר ומדיה, המספקים את התזונה עבור החיידקים שלך, צריך להיות מוכן מראש מעוקר באמצעות autoclaving. אפשרו למדיה נוזלית להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש ולתת לאגר להתקרר ל-50-55 מעלות צלזיוס – הטמפרטורה שבה ניתן להוסיף אנטיביוטיקה ולשפוך צלחות. לאחר מכן, אפשר לצלחות להתקרר לטמפרטורת החדר כדי להתמצק.
מאז חיידקים המשמשים טרנספורמציה מאוחסנים במקפיא, הם חייבים להיות מופשרים תחילה על קרח, להתפשט על צלחת אגר ללא אנטיביוטיקה ולאחר מכן גדל לילה ב 37°C.
באמצעות טכניקה אספטית לבחור מושבה חיידקית מן צלחת אגר ולהגדיל אותו בתרבות גדולה יותר 500mL לילה ב 37 °C באינקובטור רועד.
בזמן שהתאים גדלים, להכין על ליטר מים deionized ולהוות 10% גלילצל ומים, נפח לפתרון נפח. יש לאבודד את הפתרונות ולתת להם להתקרר ב-4°C.
מדידות ספיגה משמשות כדי לקבוע אם החיידקים נמצאים בשלב אמצע יומן הצמיחה שלהם, מה שאומר שהם בקלות לקחת DNA. ברגע שהתאים הגיעו לשלב זה, הנח אותם על קרח ולשמור אותם שם לאורך כל ההליך.
לאחר מכן, לשטוף תאים על ידי הפרדתם בשני צינורות צנטריפוגה גדולים להסתובב ב 4 מעלות צלזיוס, לשפוך את supernatant ו resuspend במים סטריליים 100mL עקר. חזור על שלב זה לפחות עוד פעם אחת. מטרת צעד זה היא להסיר מלח, אשר ישפיע מאוד על טכניקת electroporation.
בצע שתי שטיפות נוספות ב 50 מ"ל של 10% גלילצל במים ולבסוף resuspend החיידקים באותה פתרון.
הוסף 50μL של תאים לתוך צינורות אפנדורף מרובים. תאים אלה מוכנים כעת לשימוש אלקטרופורציה ויש לשמור על 4°C. או שהם יכולים להיות קפואים מהבהבים ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס.
כפי שאתה עומד לראות, אלקטרופורציה יש יישומים רבים.
חלופה לאלקטרופורציה היא טרנספורמציה של הלם חום, הנשענת על חשיפת החיידקים הן לסידן כלוריד והן לחום על מנת להכניס DNA לתאים שלך.
באופן כללי, הלם חום הוא עדין יותר על החיידקים שלך מאשר אלקטרופורציה ואינו דורש מלח נמוך. תגובות קשירה, אלה הכרוכות בהכנסת גן היעד שלך לתוך plasmid, ניתן להשתמש ישירות טרנספורמציה הלם חום. טרנספורמציית הלם חום זולה יותר מאלקטרופורציה ולא מסתמכת על ציוד יקר או cuvettes. מצד שני, הלם חום מוביל ליעילות טרנספורמציה נמוכה יותר מאשר אלקטרופורציה ולוקח יותר זמן. כמו כן הוא מוגבל חיידקים, שמרים ופרוטופלסטים צמחיים בעוד אלקטרופורציה ניתן להחיל על תאים יונקים.
כאן אתה רואה פיברובלסטים עובריים של עכבר נטענים לתוך cuvette אלקטרופורציה. לאחר השלמת האלקטרופורציה, יעילות הטרנספורמציה יכולה להיקבע על ידי התבוננות במידת החלבון הפלואורסצנטי הירוק המקודד על ידי הפלסמיד. טרנספקטיון הוא המונח שניתן לשינוי של תאי יונקים, אשר בדרך כלל דורש עוצמות שדה נמוכות יותר מאשר תאים חיידקיים וקבועי זמן גבוהים יותר.
אלקטרופורציה יכולה להתבצע גם בבעלי חיים שלמים כמו עובר העוף המתפתח שראית כאן. DNA Plasmid מוזרק למוחו של האפרוח ולאחר מכן בדיקה אלקטרופורציה משמשת כדי להחיל שדה חשמלי על רקמת המוח. לאחר יום או יומיים, חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים - המקודדים על ידי הפלסמיד - מיוצרים על ידי נוירונים, ומדענים יכולים לצפות בשינויים מבניים במוח האפרוח המתפתח.
הרגע צפיתם בהקדמה של JoVE לשינוי חיידקי על ידי אלקטרופורציה. וידאו זה הציג את הפלסמיד כסוג ה- DNA הנפוץ ביותר, דן במנגנון הביופיסי שנחשב כבסיס לאלקטרופורציה, הראה הליך כללי לביצוע אלקטרופורציה, ותיאר כיצד ניתן להשתמש באלקטרפורציה במערכת היונקים. תודה שצפיתם!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a plasmid and why is it used in bacterial transformation?
A plasmid is a small, circular, extrachromosomal piece of DNA that acts as a vector to carry your specific DNA sequence into bacterial cells. It contains a multiple cloning site where restriction enzymes insert your target gene, an origin of replication for DNA copying, and an antibiotic resistance gene that allows transformed bacteria to survive on antibiotic-containing media.
Q2: How does electroporation create pores in bacterial cell membranes?
Electroporation applies a high-voltage electric field of 1,000 to 10,000 volts per centimeter for milliseconds, causing the voltage across the membrane to reach 0.5-1 volts. This rearranges the phospholipid bilayer, creating temporary pores through which plasmid DNA passes. Once pulsing stops, the bilayer repairs itself, trapping the DNA inside the cell.
Q3: What are electrocompetent cells and how are they prepared?
Electrocompetent cells are bacteria prepared to readily take up DNA during electroporation. E. coli cells are grown to mid-log phase, then washed multiple times in deionized water and 10% glycerol solution to remove salt. Salt removal is critical because high salt content causes arcing, an electrical discharge that kills cells and indicates transformation failure.
Q4: Why is the time constant important in predicting electroporation success?
The time constant measures how quickly voltage decays after the electric pulse is applied. Good time constants for bacteria range from 5-10 milliseconds. Rapid decay indicates high salt concentration, causing arcing and cell death. Monitoring the time constant helps predict whether your transformation will succeed before observing colony growth.
Q5: How does electroporation compare to heat shock transformation?
Heat shock transformation uses calcium chloride and heat exposure instead of electrical pulses, making it gentler on bacteria and cheaper than electroporation. However, heat shock produces lower transformation efficiencies, takes longer, and works only on bacteria, yeast, and plant protoplasts. Electroporation achieves higher efficiency and applies to mammalian cells through a process called transfection.
Q6: What steps follow electroporation to identify successfully transformed bacteria?
After pulsing, add recovery media to cells and incubate at 37°C for one hour with shaking. Plate cells on antibiotic-containing agar and incubate overnight at 37°C. Only bacteria that successfully took up the plasmid survive the antibiotic. Count resulting colonies and calculate transformation efficiency by dividing successful transformants by total DNA plated.
Q7: What are the applications of electroporation beyond bacterial transformation?
Electroporation applies to mammalian cells through transfection, using lower field strengths and higher time constants than bacterial cells. Scientists also use electroporation in whole organisms like developing chicken embryos by injecting plasmid DNA into brain tissue and applying an electric field. This allows observation of fluorescent protein expression and structural changes in developing neural tissue.
Browse More Videos
פרקים בסרטון זה
0:00
Overview
0:47
The Plasmid
2:17
Electroporation Basic Principles
3:26
Electroporating Bacteria
7:07
Preparing Electrocompetent Cells
9:36
Applications
11:43
Summary