הפרדה של סוגי תאי Spermatogenic שימוש בשקיעה מהירות STA-PUT

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפריד בין סוגי התאים השונים הנמצאים באשכים. ראשית, קצרו אוכלוסייה מעורבת של תאים מהעכבר. האשכים מעמיסים את התאים ואת שיפוע ה-BSA לתוך מנגנון השהות.

כעת אפשר לתאים לשקוע דרך שיפוע ה-BSA. לאחר מכן אוספים את השברים ומשלבים אותם על סמך הרכב התאים. בסופו של דבר, שקיעת מהירות עם השהייה משמשת להפרדת סוגים שונים של תאים מהאשכים על סמך הבדלים בגודל ובצפיפות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו עובדות, הוא שניתן לבודד כמויות גדולות של סוגי תאים שונים בטוהר גבוה למדי באמצעות כלי זכוכית פשוטים וכוח משיכה. אבטח את שני הצילינדרים, שני ליטר ואת תא טעינת התאים לפלטפורמה העליונה וחבר את כולם עם שתי חתיכות קטנות של צינורות עם מהדקי צינור. מהדקים את כל הצינורות סגורים ואטומים את הזרבובית על הגליל הימני ביותר של שני ליטר.

הנח מוט ערבוב קטן בתא הטעינה של התא ומוט ערבוב גדול יותר בגליל השמאלי ביותר של שני ליטר. לאחר מכן הניחו את תא השקיעה של שני ליטר על הרציף. מקם את מבלבל המתכת ישירות על גבי הפתח בתחתית תא השיקוע כדי למנוע מערבולת של הנוזל ושיבוש שיפוע התא במהלך איסוף השברים.

כעת הניחו את המכסה על תא המשקעים. מרחו כמות קטנה מאוד של שומן ואקום על מפרק הזכוכית הטחון של זין העצירה התלת-כיווני. לאחר מכן מהדק את זין העצירה לתחתית תא השיקוע, ומחבר את מפרקי הזכוכית הקרקעית של זין העצירה ותא השיקוע.

לאחר מכן, חבר את תא טעינת התאים לשקע הימני של זין העצירה עם צינור. סגור את זין העצירה, ולאחר מכן חבר את צינור פיצול התאים לשקע השמאלי של זין העצירה והדק את הצינור הקטן בתחתית. יוצקים את תמיסת ה-2% BSA בצילינדר השמאלי של שני ליטר.

יוצקים את תמיסת ה-4% BSA בצילינדר הימני של שני ליטר. ודא שאין בועות גדולות בצינור המחבר את הצילינדרים הללו. יוצקים את מאגר קרבס לתא הטעינה של התאים וממלאים את הצינור המחבר את החדר הזה עם תא השיקוע.

ודא שאין בועות גדולות שעלולות להפריע למעבר ההדרגתי. במידת הצורך, סחטו או העבירו את הצינור בעדינות כדי להסיר את הבועות. ודא שכל החריצים נמצאים בצינור ולא בתא התא.

אפשר לכמות קטנה של מאגר קרבס לזרום לתוך תא השיקוע. לאחר מכן מסננים כמעט את כל המאגר לתוך צינור פיצול התאים. על מנת למלא את הצינור ולהסיר בועות גדולות, הנח את אספן השברים ישירות מתחת לתא המשקעים.

בדוק שכל צינורות השבר נמצאים במקומם וכסו בניילון נצמד כדי למנוע זיהום. הסירו את האשכים בצלחת נפרדת המכילה שמונה מיליליטר קרבס. בצע חתך בקרום הדק המקיף את צינורות הזרע בעזרת זוג מלקחיים אחד.

החזק את הממברנה עכשיו עם זוג מלקחיים נוסף. דחוף את הצינורות החוצה מהממברנה והרחק ממנה. העבירו ארבעה מיליליטר של קרבס המכילים את הצינוריות לכל צינור חרוטי המכיל 25 מיליליטר תמיסת קולגנאז.

יש לנער בחום של 33 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עד שהצינוריות מפתחות מראה דמוי ספגטי. לאחר מכן, הניחו לצינורות להתיישב במשך חמש דקות בתחתית הצינור. שפכו את הסופרנטנט ושטפו פעמיים עם 25 מיליליטר קרבס בטמפרטורת החדר, מה שמאפשר לצינורות להתיישב לתחתית הצינור בכל פעם.

השאירו כחמישה מיליליטר קרבס בכל צינור. לאחר דגירה של הצינוריות עם טריפסין. השתמש בפיפטה רחבה כדי לעורר את התמיסה המכילה את הצינורות.

מכניס אותם פנימה והחוצה כ -10 פעמים. הפתרון אמור להתחיל להיראות יותר כמו תרחיף תא בודד. כעת סנן כל מתלה של 30 מיליליטר תא יחיד דרך מסננת תאי רשת של 100 מיקרון.

לאחר שילוב מתלי התאים, ספור את מספר התאים הכולל. ודא שזין העצירה ממוקם כדי לכוון את הזרימה מתא התא לתא השיקוע. הופכים את שתי צלחות מוט הערבוב להגדרה נמוכה.

לאחר מכן שפכו את תרחיף התא לתא התא. פתח את זין העצירה כדי שהתאים יזרמו לאט לתוך תא השיקוע בקצב של 10 מיליליטר לדקה. לאחר מכן סגור את זין העצירה כדי לשטוף את התאים מתא התא.

יוצקים חמישה מיליליטר של תמיסת BSA של 0.5% ומסננים לתא השקיעה בקצב של 10 מיליליטר לדקה. סגור את תא העצירה וחזור על שטיפת ה-BSA ארבע פעמים נוספות. כעת פתח את המהדקים בין תא התא לשני גלילי שני ליטר כדי לנקז מיד את הנוזל לתא השקיעה בקצב של 40 מיליליטר לדקה, התאם את קצב הזרימה כך שייקח בערך 20 עד 30 דקות לטעון את שיפוע ה-BSA לתא השיקוע.

עקוב אחר שכבה דקה ללא הפרעה של תאים המונחים על גבי שיפוע ה-BSA. לאחר טעינת רוב ה-BSA, סגור את זין העצירה וסובב אותו למצב שיאפשר לנוזל להתנקז מתא השיקוע לתוך צינור הפיצול. כעת כבו את צלחות הערבוב ואפשרו לתאים לשקוע למשך שעה ו -45 דקות.

לאחר השלמת המשקעים, חבר את צינור השבר לקולט השבר. התאם את קצב הזרימה עם זין העצירה כך שייאספו 10 מיליליטר לצינור איסוף כל 45 שניות. לאחר איסוף כל השברים, נתח מיקרוסקופית את השברים עבור אוכלוסיות תאים שונות.

ניתן להבחין בין סוגי תאים שונים על סמך גודל התא והמורפולוגיה הגרעינית כדי לקבוע את הטוהר של כל שבר. העבירו 10 מיקרוליטר של תאים מוכתמים DPI לשקופית. הנח תלוש כיסוי ונתח בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

משוך את השברים הדומים בגודלם ובמורפולוגיה הגרעינית כדי ליצור אוכלוסיות של תאים. תכשיר טיפוסי של כ-22 אשכים. עם הליך שהייה זה מניב כ -10 עד התאים השמיניים.

ניתן לנתח במהירות שברים מסוג תא מטגני פרפר באמצעות שילוב של מיקרוסקופ אור ופלורסנט. תאים מיוטיים, זרעונים ודיפלואידים סומטיים הם התאים הגדולים ביותר שנמצאים באשכים ויכילו גרעינים גדולים שנצבעו בצורה הומוגנית יחסית ב-dpi. זרעונים עגולים הם תאים קטנים יותר עם גרעינים עגולים קטנים יותר, בדרך כלל עם מרכז כרומו מכתים בהיר המתעבה זרעונים מוארכים הם תאים קטנים בעלי גרעינים בצורת מגל.

לאחר שילוב שברי התאים, ניתן לקבוע את הטוהר עוד יותר על ידי ניתוח דם מערבי של הליזטים של התאים. סמנים נפוצים של תאים מיוטיים הם חלבוני Synap Neal Complex one. סמנים נפוצים של עיבוי זרעונים הם חלבוני מעבר או פרוטמין.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבע שעות אם היא מבוצעת כראוי לאחר פיתוחה. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הזרע לחקור תהליכים תאיים בסוגי תאים שונים מהאשכים.