Question 1

מהם שלושת השלבים העיקריים בטכניקת ה-Western blot?

Accepted Answer

שלושת השלבים העיקריים הם Electroblotting, Immunoblotting וזיהוי (detection). ב-Electroblotting מועברים חלבונים מג'ל פוליאקרילאמיד אל ממбраנה באמצעות שדה חשמלי. ב-Immunoblotting נעשה שימוש בנוגדנים כדי לבחון את הממбраנה לאיתור חלבונים ספציפיים. בשלב הזיהוי נעשה שימוש באנזימי דשייר (reporter enzymes) הקשורים לנוגדנים, אשר מייצרים אותות מדידים באמצעות שינויים בצבע או באור.

Question 2

כיצד פועל ה"סנדוויץ'" של ההעברה החשמלית (electroblotting sandwich) במהלך העברת החלבונים?

Accepted Answer

סנדוויץ' האלקטרובלוטינג (electroblotting sandwich) מורכב מג'ל ומממברנה ייעודית, הלכודים בין שני דפים של נייר סינון. שדה חשמלי מעביר את החלבונים דרך הג'ל, שם הם נלכדים על הממברנה באמצעות אינטראקציות הידרופוביות וחשמליות. יש להסיר בועות אוויר במהלך ההרכבה, שכן הן קוטעות את מעבר החלבונים וגורמות לתוצאות חלקיות על הממברנה.

Question 3

מדוע נוגדנים מונוקלונליים מועדפים עבור Western blotting?

Accepted Answer

נוגדנים מונוקלונליים מזהים אפיתופ אחד, או חלק ספציפי של חלבון, ובכך מספקים סגוליות גבוהה לזיהוי חלבונים מטרות. נוגדנים מונוקלונליים המזהים אפיתופים לינאריים מועדפים במיוחד מכיוון שהם נקשרים לחלבונים דנטורטיים. דבר זה עומד בניגוד לנוגדנים פוליקלונליים, המכוונים למספר אפיתופים, ולנוגדנים קונפורמציונליים, המזהים רק מבני חלבון תלת-ממדיים טבעיים.

Question 4

מהי מטרת החסימה (blocking) בתהליך האימונובלוטינג?

Accepted Answer

חסימה (Blocking) מכסה את שטחי הממברנה הנותרים באמצעות תמיסת חלבון מדוללת כדי להפחית קישור לא-ספציפי של נוגדנים. תמיסות חסימה מכילות בדרך כלל אלבומין מסרום בקר או חלב רזה בשבבים המומסים בתמיסת סלין חוצבת (buffered saline). שלב זה, המבוצע במשך שעה אחת ועד ללילה עם ערבוב עדין, מונע צביעת רקע ומשפר את ספציפיות האות.

Question 5

כיצד מאפשרים אנזימי דווח (reporter enzymes) את זיהוי החלבונים ב-Western blots?

Accepted Answer

אנזימי דווח (reporter enzymes) כגון פוספטאז אלקלי (alkaline phosphatase) או פרוקסידאז מחרשן (horseradish peroxidase) מקושרים לנוגדנים דרך אזור ה-Fc שלהם. עם הוספת תסבסב (substrate), אנזימים אלו מייצרים אותות קולורימטריים או כימילומניסצנטיים שניתן לצלם. עוצמת האות המתקבלת נמדדת לאחר מכן באמצעות דנסיטומטריה, המכמתת את צפיפות פסי החלבון באמצעות תוכנה לניתוח תמונות.

Question 6

איזה מידע מספק סולם החלבונים (protein ladder) ב-Western blot?

Accepted Answer

סולם החלבונים מספק סימני ייחוס לגודל המאפשרים לחוקרים להעריך את המשקל המולקולרי של כל חלבון שזוהה, בהתבסס על מרחק הנדידה בג'ל. דבר זה מסייע לאמת כי הנוגדן מזהה את החלבון הנכון וקובע האם נוכח מונומר או עותקים מרובים של החלבון, ובכך מאשר את הספציפיות של קישור הנוגדן.

Question 7

כיצד יכולת Western blotting לחשוף אינטראקציות בין חלבונים?

Accepted Answer

חלבונים מועברים מג'ל אל ממбраנת ניטרוצלולוז, ולאחר מכן נסרקים באמצעות חלבונים נוספים. אימונובלוטינג (Immunoblotting) מזהה אם החלבונים שהתווספו יוצרים קומפלקס עם חלבונים המקובעים לממбраנה. גישה זו, בשילוב עם אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדי (2D gel electrophoresis) המפרידה קומפלקסים של חלבונים לפי גודל ואז חלבונים בודדים, מאפשרת להדגים אינטראקציות בין חלבונים ולזהות את הרכב הקומפלקס.

הכתם המערבי - חידון הערכה