מבוא לתעתיק
טרנספקטיון הוא תהליך של החדרת חומר גנטי, כגון DNA ורנ"א נטוש כפול, לתאי יונקים. החדרת DNA לתא מאפשרת ביטוי, או ייצור, של חלבונים המשתמשים במכונות של ה…
טרנספקטיון הוא תהליך של החדרת חומר גנטי, כגון DNA ורנ"א נטוש כפול, לתאי יונקים. החדרת דנ"א מאפשרת ביטוי, או ייצור, של חלבונים המשתמשים במכונות של התאים עצמם. בעוד החדרת RNA כפול נטוש משמשת לכיבוי הייצור של חלבון מסוים על ידי הפסקת התרגום. כלי רב עוצמה זה איפשר לחוקרים לחקור טוב יותר את תפקוד הגנים ואת הביטוי, תפקוד החלבון והמוטציות הגנטיות.
אין ריאגנט או פעולת שירות יחיד של transfection פועל עבור כל סוגי התאים. למרבה המזל, שיטות רבות ריאגנטים פותחו בעשורים האחרונים כדי להקל על טרנספקטציה של מגוון רחב של תאים. ניתן להפריד שיטות אלה לשתי קבוצות עיקריות: עבירות כימיות ופיזיות.
בסרטון זה נתמקד במערכות האספקה הכימיות השונות, שכן הן הפכו שכיחות יותר ויותר בשנים האחרונות. שיטות אלה כוללות גישות מבוססות שומנים בדם, תעתיק מתווך סידן פוספט, ושימוש בפולימרים קטיקטיים אם להזכיר כמה.
העיקרון הבסיסי של כל שיטות ההדבקה הכימית דומה. כולם משתמשים במולקולות נושאות טעונות חיוביות המורכבות מחומצות גרעין כדי לארוז אותן לאספקה תאית. מולקולות נשא אלה להתגבר על המטען השלילי של מחסום קרום התא המאפשר להם לעבור דרך הממברנה כדי לספק את התוכן שלהם.
בהשתנות שומנים בדם, שומנים קטיונים יוצרים ליפוזום אשר לאחר מכן משלב עם חומצות גרעין כדי ליצור "קומפלקס transfection". בעוד סידן פוספט פשוט מחזק את ה- DNA ונותן לו מטען חיובי נטו. בנוסף, פולימרים קטיקטיים כגון פוליאתלנימין מעבים את ה- DNA לחלקיקים טעונים חיובית.
השלב הבא בתמור כימי הוא התקשרות של מתחמים טעונים חיובית לקרום התא הטעון שלילית באמצעות משיכה אלקטרוסטטית פשוטה.
לאחר מכן, המתחם נכנס לתא באמצעות אנדוציטוזיס - תהליך שבו מולקולות נכנסות לתא באמצעות שלשלות הקשורות לממברנה הנקראות אנדוזומים.
ברגע שנכנסים לתא, חומצות הגרעין חייבות לברוח מהאנדום על ידי תהליך שעדיין לא ידוע. ברגע שהם מחוץ לאנדוזום, חומצות הגרעין ימצאו את עצמן בציטופלזמה של התא ואז בסופו של דבר בגרעין, שבו המכונות של התא מסוגלות לייצר mRNA ואז חלבון ממנו. הציטופלסמה היא אתר הפעולה של הרנ"א המפריע הקטן, או siRNA שבו הוא מפחית את ייצור החלבון על ידי הפרעה לחלק ממכונות ייצור החלבון של התא.
דנ"א שהועבר יכול להתקיים ביציבות או ארעית. עבירות יציבות מתרחשות כאשר DNA שהועבר מועבר לגנום ולכן נמשך ככל שהתא מתחלק. עבירות חולפות מתרחשות כאשר ה- DNA אינו משולב בגנום והביטוי של החלבון המקודד הולך לאיבוד במהלך טווח של כ 24-96 שעות.
היעילות של טרנספקטציה DNA נמדדת בדרך כלל באמצעות מערכות עיתונאיות קשורות לגן המוחדר. אלה הן מערכות שניתן לזהות בקלות על ידי התבוננות ישירה בחלבון הכתב עצמו, כגון במקרה של חלבון פלואורסצנטי ירוק, או על ידי מדידת הפעילות האנזימטית שלו באמצעות בדיקת צבע, כמו במקרה של כתב אנזים לוציפראז. תעתיק דנ"א יציב נמדד בצורה הטובה ביותר על ידי ניתוח גנומי כגון RT-PCR.
כדי למדוד את ההצלחה של השתקת siRNA, רמות החלבון הממוקדות בכל דגימה יכולות להיקבע על ידי אימונובלוט. טרנספקטציה מוצלחת של siRNA אמורה להקטין את הביטוי של חלבון היעד בתוך התאים בעוד שרמות הגן של משק הבית, GAPDH, נשארות יציבות.
כדי למקסם את יעילות ההדבקה, תאים צריכים להישמר בצמיחת שלב היומן ולהיות בין 40 ל -80% מפגש, בזמן ההדבקה. על מנת להשיג זאת, תאים בתרבית צריכים להיות נקצרים יום קודם לכן... נספר... וזרע לתוך צלחת רבת באר בריכוז שיניב את הרמה הנכונה של מפגש בזמן transfection.
לאחר מכן, ריאגנטים כימיים וחומצות גרעין מעורבבים וניתן זמן כדי ליצור את קומפלקסים חומצה-ריאגנט גרעין. עבור כל מערכת משלוח כימית הריכוזים הספציפיים של כל רכיב חייבים להיות ממוטבים.
מתחמי חומצת גרעין ריאגנט מתווספים לאחר מכן לתאים מצופים ודגר לעתים קרובות בן לילה כדי לתת שפע של זמן עבור המתחמים להתחבר לתאים ולתווך transfection. לאחר 24 שעות, יש להסיר את המדיה ולהחליף אותה במדיה תרבותית טרייה.
קיימים וריאציות ויישומים רבים של טרנספקטציה. שיתוף פעולה יכול לאפשר לחוקר לחקור את ההשפעה של מוטציות missense על הפונקציה של חלבונים תאיים. כאן, RNAi היה transfected לתוך תאי HeLa על מנת למטה-לווסת את חלבון BRCA1 אנדוגני, אשר גורם לירידה במספר תאים חיוביים GFP. באותו זמן חלבון BRCA1 מוטציה גם הועבר והופק על ידי התא. אם החלבון שעבר מוטציה היה פונקציונלי לחלוטין זה גרם להתאוששות במספר התאים החיוביים GFP, אבל אם המוטציה השפיעה לרעה על התפקוד, אז מספר התאים החיוביים GFP נשאר נמוך.
כחלופה לשיטות טרנספקטציה כימיות, חוקר, המוצג כאן, משתמש באקדח גנים כדי לירות חלקיקי זהב מעורבבים עם DNA בתאים בתרבית. לתאים שמסתיימת עם הכדורים הקטנים מצופים הדנ"א בתוך הציטופלסמה שלהם יש סיכוי טוב להיות מודבקים.
שיטה חלופית נוספת לתמרה היא אלקטרופורציה. אלקטרופורציה היא שימוש בזרם חשמלי כדי לפגוע בקרום התא ומאפשר לדנ"א או לרנ"א להיכנס לתא לזמן קצר לפני שלתאים יהיה זמן לתקן. כאן, אלקטרודות פינצטה ממוקמות סביב מוח עכבר ופולסים קצרים של חשמל מועברים דרך המוח כדי ליזום transfection ex-vivo של מולקולות RNAi מוזרק בתוך הפתרון הכחול. ההשפעות של השתקת גנים על המבנה של קליפת המוח המתפתחת הוא ציין לאחר מכן.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על טרנספקטציה. כמו תמיד, תודה שצפית!
טרנספקטיון הוא תהליך של החדרת חומר גנטי, כגון DNA ורנ"א נטוש כפול, לתאי יונקים. החדרת דנ"א מאפשרת ביטוי, או ייצור, של חלבונים המשתמשים במכונות של התאים עצמם. בעוד החדרת RNA כפול נטוש משמשת לכיבוי הייצור של חלבון מסוים על ידי הפסקת התרגום. כלי רב עוצמה זה איפשר לחוקרים לחקור טוב יותר את תפקוד הגנים ואת הביטוי, תפקוד החלבון והמוטציות הגנטיות.
אין ריאגנט או פעולת שירות יחיד של transfection פועל עבור כל סוגי התאים. למרבה המזל, שיטות רבות ריאגנטים פותחו בעשורים האחרונים כדי להקל על טרנספקטציה של מגוון רחב של תאים. ניתן להפריד שיטות אלה לשתי קבוצות עיקריות: עבירות כימיות ופיזיות.
בסרטון זה נתמקד במערכות האספקה הכימיות השונות, שכן הן הפכו שכיחות יותר ויותר בשנים האחרונות. שיטות אלה כוללות גישות מבוססות שומנים בדם, תעתיק מתווך סידן פוספט, ושימוש בפולימרים קטיקטיים אם להזכיר כמה.
העיקרון הבסיסי של כל שיטות ההדבקה הכימית דומה. כולם משתמשים במולקולות נושאות טעונות חיוביות המורכבות מחומצות גרעין כדי לארוז אותן לאספקה תאית. מולקולות נשא אלה להתגבר על המטען השלילי של מחסום קרום התא המאפשר להם לעבור דרך הממברנה כדי לספק את התוכן שלהם.
בהשתנות שומנים בדם, שומנים קטיונים יוצרים ליפוזום אשר לאחר מכן משלב עם חומצות גרעין כדי ליצור "קומפלקס transfection". בעוד סידן פוספט פשוט מחזק את ה- DNA ונותן לו מטען חיובי נטו. בנוסף, פולימרים קטיקטיים כגון פוליאתלנימין מעבים את ה- DNA לחלקיקים טעונים חיובית.
השלב הבא בתמור כימי הוא התקשרות של מתחמים טעונים חיובית לקרום התא הטעון שלילית באמצעות משיכה אלקטרוסטטית פשוטה.
לאחר מכן, המתחם נכנס לתא באמצעות אנדוציטוזיס - תהליך שבו מולקולות נכנסות לתא באמצעות שלשלות הקשורות לממברנה הנקראות אנדוזומים.
ברגע שנכנסים לתא, חומצות הגרעין חייבות לברוח מהאנדום על ידי תהליך שעדיין לא ידוע. ברגע שהם מחוץ לאנדוזום, חומצות הגרעין ימצאו את עצמן בציטופלזמה של התא ואז בסופו של דבר בגרעין, שבו המכונות של התא מסוגלות לייצר mRNA ואז חלבון ממנו. הציטופלסמה היא אתר הפעולה של הרנ"א המפריע הקטן, או siRNA שבו הוא מפחית את ייצור החלבון על ידי הפרעה לחלק ממכונות ייצור החלבון של התא.
דנ"א שהועבר יכול להתקיים ביציבות או ארעית. עבירות יציבות מתרחשות כאשר DNA שהועבר מועבר לגנום ולכן נמשך ככל שהתא מתחלק. עבירות חולפות מתרחשות כאשר ה- DNA אינו משולב בגנום והביטוי של החלבון המקודד הולך לאיבוד במהלך טווח של כ 24-96 שעות.
היעילות של טרנספקטציה DNA נמדדת בדרך כלל באמצעות מערכות עיתונאיות קשורות לגן המוחדר. אלה הן מערכות שניתן לזהות בקלות על ידי התבוננות ישירה בחלבון הכתב עצמו, כגון במקרה של חלבון פלואורסצנטי ירוק, או על ידי מדידת הפעילות האנזימטית שלו באמצעות בדיקת צבע, כמו במקרה של כתב אנזים לוציפראז. תעתיק דנ"א יציב נמדד בצורה הטובה ביותר על ידי ניתוח גנומי כגון RT-PCR.
כדי למדוד את ההצלחה של השתקת siRNA, רמות החלבון הממוקדות בכל דגימה יכולות להיקבע על ידי אימונובלוט. טרנספקטציה מוצלחת של siRNA אמורה להקטין את הביטוי של חלבון היעד בתוך התאים בעוד שרמות הגן של משק הבית, GAPDH, נשארות יציבות.
כדי למקסם את יעילות ההדבקה, תאים צריכים להישמר בצמיחת שלב היומן ולהיות בין 40 ל -80% מפגש, בזמן ההדבקה. על מנת להשיג זאת, תאים בתרבית צריכים להיות נקצרים יום קודם לכן... נספר... וזרע לתוך צלחת רבת באר בריכוז שיניב את הרמה הנכונה של מפגש בזמן transfection.
לאחר מכן, ריאגנטים כימיים וחומצות גרעין מעורבבים וניתן זמן כדי ליצור את קומפלקסים חומצה-ריאגנט גרעין. עבור כל מערכת משלוח כימית הריכוזים הספציפיים של כל רכיב חייבים להיות ממוטבים.
מתחמי חומצת גרעין ריאגנט מתווספים לאחר מכן לתאים מצופים ודגר לעתים קרובות בן לילה כדי לתת שפע של זמן עבור המתחמים להתחבר לתאים ולתווך transfection. לאחר 24 שעות, יש להסיר את המדיה ולהחליף אותה במדיה תרבותית טרייה.
קיימים וריאציות ויישומים רבים של טרנספקטציה. שיתוף פעולה יכול לאפשר לחוקר לחקור את ההשפעה של מוטציות missense על הפונקציה של חלבונים תאיים. כאן, RNAi היה transfected לתוך תאי HeLa על מנת למטה-לווסת את חלבון BRCA1 אנדוגני, אשר גורם לירידה במספר תאים חיוביים GFP. באותו זמן חלבון BRCA1 מוטציה גם הועבר והופק על ידי התא. אם החלבון שעבר מוטציה היה פונקציונלי לחלוטין זה גרם להתאוששות במספר התאים החיוביים GFP, אבל אם המוטציה השפיעה לרעה על התפקוד, אז מספר התאים החיוביים GFP נשאר נמוך.
כחלופה לשיטות טרנספקטציה כימיות, חוקר, המוצג כאן, משתמש באקדח גנים כדי לירות חלקיקי זהב מעורבבים עם DNA בתאים בתרבית. לתאים שמסתיימת עם הכדורים הקטנים מצופים הדנ"א בתוך הציטופלסמה שלהם יש סיכוי טוב להיות מודבקים.
שיטה חלופית נוספת לתמרה היא אלקטרופורציה. אלקטרופורציה היא שימוש בזרם חשמלי כדי לפגוע בקרום התא ומאפשר לדנ"א או לרנ"א להיכנס לתא לזמן קצר לפני שלתאים יהיה זמן לתקן. כאן, אלקטרודות פינצטה ממוקמות סביב מוח עכבר ופולסים קצרים של חשמל מועברים דרך המוח כדי ליזום transfection ex-vivo של מולקולות RNAi מוזרק בתוך הפתרון הכחול. ההשפעות של השתקת גנים על המבנה של קליפת המוח המתפתחת הוא ציין לאחר מכן.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על טרנספקטציה. כמו תמיד, תודה שצפית!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between transfecting DNA and RNA into cells?
DNA transfection enables protein expression using the cell's machinery, while RNA transfection, particularly double-stranded RNA or siRNA, shuts down specific protein production by stopping translation. DNA must reach the nucleus for effective expression, whereas RNA acts in the cytoplasm. DNA can be stably incorporated into the genome or transiently expressed, while RNA effects are temporary.
Q2: How do chemical transfection methods deliver genetic material into cells?
Chemical transfection uses positively charged carrier molecules—such as cationic lipids, calcium phosphate, or polymers—that complex with negatively charged nucleic acids. These complexes attach to the negatively charged cell membrane through electrostatic attraction, then enter via endocytosis in membrane-bound vesicles called endosomes. The nucleic acids escape the endosome and reach their destination in the cytoplasm or nucleus.
Q3: What cell conditions optimize transfection efficiency?
Cells should be in log phase growth and between 40 and 80% confluent at transfection time. Prepare cells by harvesting them the day before, counting them, and seeding at appropriate concentration. After adding nucleic acid-reagent complexes, incubate overnight to allow attachment and transfection. Replace media with fresh culture after 24 hours to support cell recovery and gene expression.
Q4: How is transfection efficiency measured in cells?
Reporter systems tethered to inserted genes measure DNA transfection efficiency. Green fluorescent protein can be directly observed, while luciferase enzyme activity is measured using colorimetric assays. Stable transfection is verified by genomic analysis such as RT-PCR. For siRNA silencing success, immunoblot analysis determines target protein levels; successful transfection decreases target protein while housekeeping genes like GAPDH remain stable.
Q5: What is the difference between stable and transient transfection?
Stable transfection occurs when transfected DNA integrates into the genome and persists through cell division, creating permanent genetic changes. Transient transfection involves DNA that remains outside the genome, resulting in temporary protein expression lasting 24 to 96 hours before being lost. Stable transfection is measured by genomic analysis, while transient effects are detected through reporter systems.
Q6: What are alternative physical methods for transfecting cells?
Electroporation uses electrical current to temporarily damage the cell membrane, allowing DNA or RNA entry before cells repair. A gene gun fires gold particles coated with DNA directly into cells; particles reaching the cytoplasm enable transfection. These physical methods complement chemical approaches and are useful for cell types resistant to chemical reagents or for in vivo applications like brain tissue transfection.
Q7: How can co-transfection be used to study protein mutations?
Co-transfection simultaneously introduces interfering RNA and mutant DNA into the same cell. RNAi down-regulates the endogenous protein while the transfected mutant version is produced. Comparing functional outcomes—such as recovery of fluorescent reporter signals—reveals whether the mutation preserves or impairs protein function. This approach enables direct assessment of mutation effects on cellular processes.