Name: Infinium Assay עבור יישומי Genotyping SNP בקנה מידה גדולה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 33 s
Description: למד את פרוטוקול Infinium Assay לגנוטיפינג בקנה מידה גדולה של מיליוני SNPs במדגמי DNA. שיטה זו מאפשרת זיהוי אללים בקצב גבוה תוך שלושה ימים לחקר קשרים גנטיים למחלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון עבור עבודה זו סופק על ידי NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959, ו-NIH R56 AI063274

<ol><li>Shi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+large-scale+pharmacogenetic+studies+by+high-throughput+mutation+detection+and+genotyping+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies.</a> Clin. Chem. 47 (2), 164-172 (2001).</li>
<li>Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+by+the+5%27-nuclease+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction.</a> Methods Mol. Biol. 212, 129-148 (2003).</li>
<li>Seeb, J. E., Pascal, C. E., Ramakrishnan, R., Seeb, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+by+the+5%27-nuclease+reaction%3A+advances+in+high+throughput+genotyping+with+non-model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction: advances in high throughput genotyping with non-model organisms.</a> Methods in Mol. Biol. 578, 277-292 (2009).</li>
<li>Bayés, M., Gut, I. G. Overview of Genotyping. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBay%C3%A9s%2C+M+%22Molecular+Analysis+and+Genome+Discovery%22">Molecular Analysis and Genome Discovery</a>. ed, , 2nd, John Wiley & Sons, Ltd. Chichester, UK. 1-23 (2011).</li>
<li>Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Nucleotide+Polymorphisms+for+High-Throughput+Genotyping+of+Anopheles+arabiensis+in+East+and+Southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Single-Nucleotide Polymorphisms for High-Throughput Genotyping of Anopheles arabiensis in East and Southern Africa.</a> J. Med. Entomol. 49 (2), 307-315 (2012).</li>
<li>Liu, Z. SNP Genotyping Platforms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+Z+%22Next+generation+sequencing+and+whole+genome+selection+in+aquaculture%22">Next generation sequencing and whole genome selection in aquaculture</a>. , Wiley-Blackwell. 123-132 (2011).</li>
<li>Shen, R., Fan, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+SNP+genotyping+on+universal+bead+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.%2FFundam+and+Mol.+Mech.+of+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">High-throughput SNP genotyping on universal bead arrays.</a> Mutat. Res./Fundam and Mol. Mech. of Mutagenesis. 573 (1), 70-82 (2005).</li>
<li>Ragoussis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+technologies+for+all%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%3A+Technol%22%5BJournal%5D)">Genotyping technologies for all.</a> Drug Discov. Today: Technol. 3 (2), 115-122 (2006).</li>
<li>Wu, C. C., Shete, S., Jo, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Genome+Detection+of+Disease-Associated+Deletions+or+Excess+Homozygosity+in+a+Case-Control+Study+of+Rheumatoid+Arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-Genome Detection of Disease-Associated Deletions or Excess Homozygosity in a Case-Control Study of Rheumatoid Arthritis.</a> Hum. Mol. Genet. , (2012).</li>
<li>Green, E. K., Hamshere, M., Forty, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+bipolar+disorder+susceptibility+alleles+and+identification+of+two+novel+genome-wide+significant+associations+in+a+new+bipolar+disorder+case-control+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Replication of bipolar disorder susceptibility alleles and identification of two novel genome-wide significant associations in a new bipolar disorder case-control sample.</a> Mol. Psychiatry. , (2012).</li>
<li>Shete, S., Hosking, F. J., Robertson, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+identifies+five+susceptibility+loci+for+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study identifies five susceptibility loci for glioma.</a> Nat. Genet. 41 (8), 899-904 (2009).</li>
<li>Inc Illumina. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Infinium+HD+Ultra+User+Guide+11328087+RevB-1%22">Infinium HD Ultra User Guide 11328087 RevB-1</a>. , 15-101 (2009).</li>
<li>Turner, S., Armstrong, L. orenL., Yuki Bradford,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+Control+Procedures+for+Genome+Wide+Association+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Quality Control Procedures for Genome Wide Association Studies.</a> Curr Protoc Hum Genet. , 1-19 (2011).</li>
</ol>

יש המחברים של מאמר זה אין אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.

יישומי גנוטיפ בקנה מידה גדול שנוצלו כדי להבין את המנגנון הגנטי שבבסיס מחלות רבות אדם טוב יותר. הגילוי של כל גרסה משמעותית באמצעות ניתוח עמותה הגנום יכול דגל אזור מועמד למחקר נוסף. בנוסף, נתוני גנוטיפ הוא כלי טוב לבקרת איכות בפרויקטים לקביעת רצף. כדי למקסם את תפוקת מדגם, יכולות להיות מוגברות צלחות מדגם מרובות ומאוחסנות במדינות מקוטעות, המושעות שלהם. שמונה צלחות עשויות להיות מוגברות ביום אחד, המשלבות את 24 שעות הראשונות של הפרוטוקול לקבוצות מרובות ומספקים מספיק חומר ל~ 2-8 ימים לעיבוד שבבים. אם צלחות מוגברות במאגרי נשק לפני כן, ואם הדגימות חדשות הם הכלאה לשבבים מייד לאחר הסריקה מתחילה בריצה הקודמת, עיבוד יכול לרוץ ברציפות ללא הצורך להשהות להכנת מדגם נוספת. לכן, למרות שהדגימות ייקחו שלושה ימים לעבור מלאassay, יכול להיות שנוצרו נתונים יומיים. שבבי Assuming24 מעובדים בכל יום, שבוע עבודה של 5 ימים מאפשר ללמעלה מ 1,000 דגימות ה-DNA שיופעל על 12 מדגם שבב חרוז. אם כל צעד או מגיב נכשל, לעומת זאת, קבוצות מרובות עלולות להיות בסיכון לביצועים גרועים לפני שניתן יהיה ליישם בכל תיקון. שגיאות עלולות להימלט הודעה עד למערכים נסרקים או נותחו, ולכן, אם התפוקה מוגדלת, מאות דגימות בשלבים שונים של הפרוטוקול אולי כבר קיבלו את אותו טיפול פגום עם גילוי. כפי שלא ניתן לשחזר חומרים כימיים והנתונים שאבדו, המשתמש חייב לשקול את הסיכונים הללו כנגד הצורך בעבודה מואצת. תוכנת ניתוח GenomeStudio היא ההזדמנות הראשונה באמת כדי לאמוד את ההצלחה של תהליך גנוטיפ. אם הנור-R לעומת חלקות עוצמת הנור תטא מקובצים כראוי, שיעור השיחה הממוצע (אחוזים מסך SNPs הוקלדו בהצלחה) של הדגימות צריך גישת 99%, למרות שערך זה משתנה SLIghtly בהתאם לסוג מערך. נתונים מכל דגימה עם שיעור שיחה נמוך יותר מאשר 85-90% הוא לא אמינים וצריכים להיות מושלך. למטרות בקרת איכות, יש להשוות את תוצאות לכל גנוטיפים בכל הזדמנות אפשריים ידועים קודם לכן. אין נתונים כאלה, אם קיימים, שכפול מדגם מכוון הוא כלי שימושי באימות מיקומי צלחת או מערך. זוגות כפולים אלה צריכים להיות ממוקמים על שבבים נפרדים, צלחות, קבוצות, או פרויקטים; גנוטיפים שלהם בדקו על דור. אמנם אילוצי QC ספציפיים משתנים בהתאם להעדפתו של החוקר, אילוצי SNP משותפים מבוססים על הצלחה שיחת מדגם, שיווי משקל הארדי-ויינברג, או missingness בין המקרים ובקרות, ואילו אילוצי מדגם נפוצים מתבססים על שיעורי שיחה, חוסר עקביות מנדל, או הפניות מקושרות הטרוזיגוטיות כרומוזום ה-X לנתוני מגדר קליניים [13]. אם מתעוררת בעיה כלשהי, לוח המחוונים הפקדים, שנמצאו בחבילת הניתוח, ניתן להגיש לחברה על מנת לקבוע גורם. בקרות אלה יכולים לעתים קרובות לצמצם את הנושא לצעד הסביר ביותר או הכישלון מגיב. אם כל SNPs של עניין נמצא בניסוי גנוטיפ Infinium, חלקות העצמה שלהם צריכה להיות בGenomeStudio לשגיאות באשכולות לפני מחקר נוסף שנערך בדק כפולות. ניסוי גנוטיפ Infinium נכשל הוא כנראה עקב שגיאת עיבוד אנושית או DNA קלט באיכות ירודה. כימות מדגם חייבת להיות מדויקות ומדויקות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, כל חומרים כימיים הוסיפו לכל מדגם או שבב חייב להימכר בהיקף שנקבע על ידי הפרוטוקול. טפטפות חייבת להיות מכוילת כראוי. ריאגנטים לא צריכים לרוץ אחרי פקיעה ולא צריך להיות refrozen פעם מופשרת, לחסוך למגיב RA1. על מנת למזער טעויות מכתים והארכה אפשריות, תערובת פוראמיד / EDTA צריכה להיות מוכנה טרי בכל חודש. כל -20 ריאגנטים C ° צריכים להיות מאוחסנים במקפיאים ידני להפשיר בלבד. כל מעבדתי בשימוש בstaining, סיומת, ולשטוף את החלקים בפרוטוקול יש לשטוף היטב במים וסבון עדין מייד עם חוסר שימוש. מאגרי humidifying בתא היב צריכים להשתפשף עם מברשת מבחנה וחומר ניקוי עדין. שקופיות הזכוכית יש לשטוף עם אקונומיקה 10%, כפי שהורו על ידי המדריכים למשתמש שלהם, פעם בשבוע.

הקלדת פולימורפיזמים נוקלאוטיד בודדים (SNPs) היא שיטה העיקרית של זיהוי וריאנטים סיכון הקשורים למחלות. מבחינה היסטורית, את היקף ניסויי גנוטיפ היה מוגבל על ידי הטכנולוגיה זמינה. שיטות גנוטיפ מבוססות ג&#39;ל אלקטרופורזה מוגבלות במדגם וSNP תפוקה [1]. פיתוח מבחני אלה לעתים קרובות יכול להיות עתיר עבודה, בהסתמך על האיפור ומבנה באזור המקיף את הגרסה לאופטימיזציה [1]. מבחני גנוטיפ TaqMan, שפותחו על ידי חיים טכנולוגיים, יכולים להריץ מספר גדול של דגימות במהירות ועם מעורבות מינימאלית טכנאי [2], אבל הגבלות SNP-ריבוב ימשיכו להגביל את המספר הכולל של גנוטיפים להיטב תחת מיליון ליום [3,4 ]. פלטפורמת iPlex של Sequenom יכולה לרוץ גם דגימות רבות בבת אחת, אבל, כפי שניתן multiplexed פחות ממאה SNPs יחד, התפוקה היא נמוכה comparably כללי [5]. טכנולוגית זרם SNP של בקמן קולטרבאופן תיאורטי יכול לייצר יותר משלושה מיליון גנוטיפים ליום, אבל טווח פרויקט גבולות טכנולוגיה זו עד למקסימום של רק ארבעים ושמונה SNPs לכל תגובה [4,6]. בעוד assay GoldenGate יכול לעבד כמעט מאתיים דגימות DNA בכל יום במאה או אלפי SNPs לפי מדגם, המחיר לכל גנוטיפ הוא לא תחרותי עם טכניקות מתקדמות, Ultra-תפוקה גבוהה בעת הקלדה למעלה משלושה אלף SNPs בפעם אחת [4,7 ]. כדי לעבד כמה מיליוני גנוטיפים ליום, בקנה מידה הנדרשת ללימודי עמותה הגנום גדולים, מבחני מערך כלאה הפכו את האפשרות חסכונית ביותר בשוק. הקו של Affymetrix של מערכי הכלאה והשורה של Illumina של מערכים מבוססי Infinium יאפשר פוטנציאל של מאות דגימות להיות מוקלדים במאה אלפים או מיליון של SNPs ב[ 4,8] המקביל. יכול להיות מפוזר SNPs אלה על פני הגנום כולו, מקומי באזורים של אינטרסים, כגון לשעברomes, או מותאם אישית להעדפותיו של המשתמש. יש מערכים אלה את היתרון של להיות לא רק מסוגל גנוטיפ במדויק מיליון SNPs לדגימה בבת אחת, אלא גם כדי למדוד וריאציה עותק מספר, פגמים בכרומוזומים פוטנציאלי הסרת לוט. יש מערכי OMNI BeadChip מיושרים-Infinium כיום היכולת גנוטיפ עד כמעט חמישה מיליון סמנים לדגימה, כוללים חצי מיליון לוקוסים מותאמים אישית, על עד כמעט מאה דגימות בכל יום. כמו רוב המחלות מרכיב גנטי, ניסויים בקנה מידה גדולה אלה יכולים להיות מכריעים במציאת גנים הקשורים למחלה. גנוטיפ תפוקה גבוהה מאפשר לדור גנוטיפ יעיל במדגם קבוצות גדולים מספיק כדי לזהות קשר גנטי בצורה משכנעת בתדרי אלל קטין נמוכים יותר. פרויקטי גנוטיפ הגנום כולו ניתן להשתמש כדי לאתר אזורים בתדירות משמעותית מבחינה סטטיסטית שליטה במקרה אלל או הבדלי עותק מספר [9,10,11]. לדברי גה האדם הלאומינומו מכון מחקר, מחקרי עמותה הגנום הובילו ל1,490 פרסומים נפרדים בין 25 נובמבר 2008 ו -25 ינואר 2013, הנובע מגילוי 8,283 SNPs עם p-value של פחות מ 1 x 10 -5 (ראה http:// www.genome.gov/gwastudies/). מחקרים אלה, שחקרו תנאים החל גובה לסרטן אשכים, נהנה מהגישה הרחבה המוענקת על ידי ניתוח הגנום כולו. במקרים כגון אלה, אזורים שלמים של עניין שאולי חמקו מתשומת לב שההיקף של הקלדה היה מגביל מדי. לפיכך, לעמותה בקנה מידה גדולה מנתח, טכניקת גנוטיפ הגנום היא הטכניקה של בחירה. גרסאות שונות של assay Infinium קיימות, שכל אחד מיועדת לשימוש עם סוגים מסוימים של מערכים. Assay InfiniumUltra, דן לעומק בהמשך, הוא מתאים עבור רבים 12 - או שבבי מערך 24 מדגם. אלה לעתים קרובות גנוטיפ למעלה ממאה אלף SNPs לדגימה ה-DNA ולהתמקד בלאאזורי argeted, כגון על לוחות exome או מותאמים אישית. גרסאות assay אחרות ייתכן שתידרשנה לסוגי שבבים אחרים, כגון מערכי גנוטיפ הגנום כולו. עם זאת, כמו כל מבחני Infinium חולקים בסיס משותף ובעיקר שונים רק על ידי השמות מגיב, כרכים מגיב, או הליך מגיב מכתים המדויק, טכניקות שיכללו בגרסת assay אחד יכולה לעתים קרובות להיות מיושמות באופן אוניברסלי. מערכים אחרים, כגון מערכי מתילציה, עלולים להשתמש בפרוטוקול כמעט זהה, גם כן. יש להקפיד להשתמש אך ורק את הגרסה של assay הנדרש לסוג השבב בשימוש. סוגים מסוימים, כגון אלה מדידת רמת ביטוי גנים, עלולים לדרוש שימוש בפרוטוקול nonInfinium. דגימות חייבות להיות מעובד בקבוצות. לדוגמא, עם assay InfiniumUltra, צינורות מגיב prehybridization מכילים מספיק נפח לרוץ 96 דגימות, ולא ניתן refrozen הצינורות. לכן, דגימות חייבות להיות מנוהלות בקבוצות של 96 דגימות בכל פעם. הדגימות יהיו מוגברות בעצי האשוחיום לא. לאחר כ 1 שעות של benchwork, הדגימות חייבות להיות מחוממות בתנור הסעה ל20-24 שעה. למחרת היום, כמעט 4 שעות יוקדש פיצול, מזרז, וresuspending הדגימות, ובשלב זה יכול גם להיות קפוא הדגימות לשימוש עתידי, או הכלאה לשבב. טוען שבבים לוקח כמעט שעה 2, לאחר שהדגימות יהיו הכלאה בין לילה ל16-24 שעה. ביום השלישי, שלב הצביעה והסיומת לוקח ~ 4 שעות. שעה נוספת יוקדש כביסה, ציפוי, ומייבש את השבבים. לבסוף, המערכים נסרקים, אשר עשוי להימשך 15-60 דקות / שבב, תלוי בסוג שימוש. אמצעי בטיחות במעבדה וניקיון התקן חלים. למרות שאינה מבוססת-PCR ההגברה, תחנות עבודה נפרדות ולמראש postamplification נהלים נחוצות כדי למזער את הסיכוי לזיהום. מספר זיהוי של כל מגיב-סיפק ערכה בשימוש חייב להיות מחובר גיליון מעקב. ריאדNTS צריך להיות מופשר מייד לפני השימוש והפוך כמה פעמים בעבר מחלק. ה-DNA להיות מוקלדים חייבת להיות DNA באיכות גבוהה גנומית (260/280 יחס ספיגה 1.6-2.0, 260/230 יחס ספיגה מתחת 3.0), שבודד על ידי שיטות סטנדרטיות ולכמת עם fluorometer. השפלה של ה-DNA היא לעתים קרובות גורם תורם בassay תוצאות באיכות נמוכה. בדרך כלל, 200 ng של DNA הנדרש, אם כי סכום זה עשוי להשתנות בהתאם לסוגים מסוימים שבב. רובוט טיפול נוזלי טקאן יכול להפוך שלבים רבים של הפרוטוקול ולמזער טעויות אנושות כגורם.

<table><tbody><tr><td><חזק>מתכלה או ציוד</חזק></td><td><חזק>יצרן</חזק></td><td><חזק>מספר חלק</חזק></td><td><חזק>מינימום נדרש עבור 96 דגימות</חזק></td></tr><tr><td>0.8 מ"ל צלחת באר עמוקה</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0765</td><td>1</td></tr><tr><td>מחצלות צלחת</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0674</td><td>2</td></tr><tr><td>מגיב אגן</td><td>פישר Scientific</td><td>13-681-502</td><td>9</td></tr><tr><td>יריעות איטום חום</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0559</td><td>1</td></tr><tr><td>Flow-through</td><td>Spacer Fisher Scientific</td><td>NC9563984</td><td>6</td></tr><tr><td>טיפים לפיפטה - 200 &mu; l</td><td>Rainin</td><td>GP-L200F</td><td>192</td></tr><tr><td>קצות פיפטה - 10 &mu; l</td><td>Rainin</td><td>GP-L10F</td><td>16</td></tr><tr><td>קצות פיפטות - 1,000 &mu; l</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000F</td><td>16</td></tr><tr><td>DNA מאגר תרחיף</td><td>Teknova</td><td>T0220</td><td>0.5 מ"ל</td></tr><tr><td>0.1 N NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12419-0010</td><td>0.5 מ"ל</td></tr><tr><td>איזופרופנול (דרגת HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451</td><td>15 מ"ל</td></tr><tr><td>אתנול (200 הוכחה)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>330 מ"ל</td></tr><tr><td>פורממיד (100%)</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>C001K38</td><td>15 מ"ל</td></tr><tr><td>EDTA (0.5 מ')</td><td>אמרסקו</td><td>E177</td><td>0.2 מ"ל</td></tr><tr><td>10 &mu; l פיפטה 8 ערוצים</td><td>Rainin</td><td>L8-10XLS</td><td>1</td></tr><tr><td>200 &mu; l 8 ערוצים פיפטה</td><td>Rainin</td><td>L8-200XLS</td><td>2</td></tr><tr><td>1,000 &mu; l פיפטה חד ערוצית</td><td>Rainin</td><td>L-1000XLS</td><td>1</td></tr><tr><td>שייקר מיקרופלייט</td><td>VWR</td><td>13500-890</td><td>1</td></tr><tr><td>צנטריפוגה מיקרופלייט מקוררת</td><td>VWR</td><td>BK369434</td><td>1</td></tr><tr><td>תנור היברידיזציה</td><td>Illumina</td><td>SE-901-1001</td><td>1</td></tr><tr><td>חממת מיקרו-דגימה Hybex</td><td>SciGene</td><td>1057-30-0</td><td>1</td></tr><tr><td>Hybex MIDI הכנס</td> <td>בלוק חוםIllumina</td><td>BD-60-601</td><td>1</td></tr><tr><td>אוטם חום</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0384</td><td>1</td></tr><tr><td>תא Hyb עם הכנסה ומחצלת</td><td>Illumina</td><td>BD-60-402</td><td>2</td></tr><tr><td>מספריים כירורגיות</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-804-20</td><td>1</td></tr><tr><td>זרימה דרך חלקי הרכבה</td><td>Illumina</td><td>WG-10-202</td><td>8</td></tr><tr><td>מתלה כביסה וכלים</td><td>Illumina</td><td>BD-60-450</td><td>1</td></tr><tr><td>מתלה תא Genepaint</td><td>Tecan</td><td>760-800</td><td>1</td></tr><tr><td>בדיקת טמפרטורה</td><td>Illumina</td><td>A1-99-109</td><td>1</td></tr><tr><td>מתלה מכתים וכלים</td><td>Illumina</td><td>WG-10-207</td><td>1</td></tr><tr><td>פינצטה עם סגירה עצמית</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>5374-NM</td><td>1</td></tr><tr><td>סעפת ואקום</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>2240</td><td>1</td></tr><tr><td>iScan או HiScan</td><td>Illumina</td><td>- </td><td>1</td></tr></tbody></table>

infinium assay עבור יישומי genotyping snp בקנה מידה גדולה

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

גרסאות Genotyping בגנום האנושי הוכיחו להיות שיטה יעילה לזיהוי קשרים גנטיים עם פנוטיפים. ההפצה של גרסאות בתוך משפחות או אוכלוסיות יכולה להקל על זיהוי של הגורמים הגנטיים של מחלה. הפנל של Illumina של BeadChips גנוטיפ מאפשר לחוקרי גנוטיפ אלפים או מיליונים פולימורפיזמים נוקלאוטיד בודדים (SNPs) או לצורך ניתוח וריאנטים אחרים גנומי, כגון העתקת מספר, על פני מספר גדול של דגימות דנ&quot;א. ניתן להפיץ SNPs אלה לאורך כל הגנום או ממוקד באזורים מסוימים על מנת למקסם את פוטנציאל הגילוי. Assay Infinium עבר אופטימיזציה כדי להניב איכות גבוהה, תוצאות מדויקות במהירות. עם התקנה נכונה, טכנאי אחד יכול לעבד מכמה מאה ליותר מאלף דגימות DNA בשבוע, תלוי בסוג של מערך. assay זה מנחה את המשתמשים בכל שלב, החל מהדנ&quot;א הגנומי וכלה בסריקה של המערך. שימוש בריאד התקינותNTS, דגימות הם מוגברות, מקוטעים, זירז, resuspended, הכלאה לשבב, הוארכה בסיס יחיד, מוכתם, ונסרק שתי מערכת הדמיה אופטית ברזולוציה גבוהה iScan או היי סריקה. צעד לילה אחד נדרש כדי להגביר את ה-DNA. ה-DNA הוא מפוגל ומוגבר isothermally ידי הגברה הגנום כולו, ולכן לא נדרש-PCR. דוגמאות הם הכלאה למערכים במהלך צעד הלילה שני. ביום השלישי, הדגימות מוכנות לסריקה ונותח. ה-DNA המוגבר עשויה להיות מאגרי הנשק בכמויות גדולות, ומאפשר למערכי חרוז להיות מעובד בכל יום בשבוע, ובכך למקסם את התפוקה.

שבב חרוז כראוי מעובד צריך להציג עוצמות לייזר האור אדומות וירוקות בהירות וברורות בעת הסריקה. באיור 6, תוכנת סריקת iScan מציגה דגימת DNA הגנומי סטנדרטית הכלאה בהצלחה למערך genotyping SNP מותאם אישית בלוח. נוקלאוטידים שהכותרת שצורפו במהלך שלבי הרחבה ומכתים לזרוח תחת האורות של שני לייזרים. כנוקלאוטידים אלה באופן סלקטיבי להאריך שרשרת oligonucleotide של חרוז הכלאת גדיל DNA המקוטע, וכמו שרשרות oligonucleotide נועדו לסיים באתר של הגרסה, את הצבע ואת עוצמת האות וכתוצאה מכך יכולים לשמש כדי לקבוע את אללים נוכחים ב אתר SNP. גיליון נוצר על ידי משתמש מדגם, אשר תואמה את תעודות זהות של מדגם ומידע קליני לchipID ועמדה, ומניפסט SNP מערך ספציפי, המתקבל ישירות מהחברה, שניהם הכרחיים על מנת לייבא את SCAקבצי פלט nner לתוך תוכנת ניתוח GenomeStudio. ניתן למצוא גיליונות מדגם דוגמא באתר האינטרנט של החברה. ברגע שפרויקט GenomeStudio בנוי, ניתן להשיג גנוטיפים מהאשכולות בעוצמה וכתוצאה מכך נוצרים באופן אוטומטי על ידי התוכנה. למרות שאפשרויות תצוגה מרובות קיימות, תצוגת ברירת המחדל, הנור-R (ערך עוצמת מנורמל) לעומת הנור-תטא (יחס עוצמת allelic), היא לעתים קרובות את העלילה הכי הקלה להבדיל שלושה אשכולות נפרדים. רוב SNPs צריך להראות אחד, שניים, או שלושה אשכולות, בהתאם לתדירות אלל הקטין. שלושה האשכולות מייצגים דגימות הוכחת AA, AB, או אללים BB (ראה איור 7). אשכולות אלה ניתן להקצות גנוטיפים או על ידי יבוא תבנית עמדת קיבוץ באשכולות סטנדרטית ישירות מהחברה, על ידי בחירה &quot;מקבץ את כל SNPs&quot; מסרגל כלי ניתוח של התוכנה, או על ידי לחיצה וגרירה של העיגולים הצבעוניים על מגרשי עוצמתו של אדי ידני<html> לא קורא. הצבע של המדגם על המגרש העצמה (אדום, סגול או כחול) מציין את השיחה (AA, AB, או BB, בהתאמה); שחור מציין שאין שיחה. על ידי דפדוף בSNPs מופיע בחלונית נתונים המלא של התוכנה, באשכולות לכל SNP ניתן לראות או נזכרו. ברגע האשכולות מוקצים שיחות משביעות רצון, חלונית הנתונים המלאה של התוכנה מפרטת את גנוטיפים עבור כל דגימה בודדת בכל SNP מסוים. האפשרות לבחירת העמודות שמעל לטבלה יכולה לעבור פורמטי נתונים. הנתונים ניתן לייצא או דרך סרגל הכלים של ניתוח או ישירות מטבלת נתונים המלאה לניתוח מעמיק. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1.jpg" width="600px" /> איור 1. סקירה - Infinium Assay פרוטוקול.683/50683fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2.jpg" width="600px" /> איור 2. בסיס ומזרן, בתוספת מכסה היב הקאמרי שלמים. [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3.jpg" width="600px" /> איור 3 טוען Beadchip -.. לוותר על המדגם ביציאות המפרצון [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה גדולה יותר</a><html> תמונה. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4.jpg" width="600px" /> איור 4 הסרת Coverseal Beadchip -.. אחוז בחותם בפינה ולקלף בעדינות באלכסון [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5.jpg" width="600px" /> איור 5. עצרת Beadchip זרימה דרך שלמה - BeadChip מופרד משקופיות זכוכית עם spacer וקשר עם אבזמים.<html> &gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6.jpg" width="600px" /> איור 6. BeadChip סריקה מוצלחת -) BeadChip נסרק עם שני לייזר אדום וירוק; מציג תוכנת סריקה הן בו זמנית. סעיפים שעוברים QC עוצמת ידגישו ירוקים בתצוגת BeadChip לשמאל. סעיפים שלא הצליחו QC עוצמת ידגישו אדומים בתצוגת BeadChip. ב &#39;) לאחר שהסריקה הושלמה, התוכנה כיסוי מציגה האדום וירוק. תמונה מוגדלת ב מוצגת. הצבע והעוצמה של כל חרוז בודד מציין את הווה אלל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> דק page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7.jpg" width="500px" /> איור 7. SNP NORM-R לעומת NORM תטא פרופילי Cluster -) SNP חוקי עם שלושה אשכולות נפרדים המייצגים את AA, AB, וגנוטיפים BB, בצבע אדום, סגולה, כחולה וארוחת בוקר) עריכה דורשת SNP.. האשכול באמצע, שאמורה להיות AB הומוזיגוטים, נותר בלתי נקרא. אשכול BB נקרא בטעות AB. C) SNP ביצועים ירוד. ניתן להשיג לא גנוטיפים מעלילה בעוצמה זו, שכן אין אשכולות שונים קיימים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

פרוטוקול מתואר המשתמש במבחני Infinium של Illumina לבצע גנוטיפ בקנה מידה גדולה. מבחני אלה יכולים אמין גנוטיפ מיליונים SNPs על פני מאות דגימות DNA בודדות בשלושה ימים. נוצר פעם אחת, יכולים לשמש גנוטיפים הבאים כדי לבדוק לעמותות עם מגוון רחב של מחלות או פנוטיפים שונים.

Infinium Assay עבור יישומי Genotyping SNP בקנה מידה גדולה

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להשתמש בהצלחה בבדיקת ה-Infinium על מנת לעבד שבב חרוזי לטיפוס גנטי (genotyping bead chip). דבר זה מושג תחילה על ידי הגברה, פרגמנטציה ובידוד של ה-DNA. השלב השני הוא היברידיזציה של גדיל ה-DNA הדנטורי לאוליגו-נוקלאוטידים המחוברים לחרוזים במערך.בשלב הבא, האוליגונוקליאוטיד המחובר לחרוד נצבע ומוארך באופן סלקטיבי בבסיס אחד. השלב הסופי הוא סריקה של שבבי החרודים כדי לזהות את הנוקלאוטיד המסומן. בסופו של דבר, תוצאות הגנוטיפ משמשות לקביעת האלילים הנוכחים באתר הנבדק.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון ששלבים רבים בצביעה ובטעינה של שבבי הדבורים קשים ללמידה. תמרונים רבים אינם נפוצים בשיטות גנוטיפיקה אחרות, ולציוד רב יש שמות דומים מאוד. יום אחד לפני ההגברה, הכין את ה-DNA והעבר 200 nanograms של DNA לכל באר לתוך פלטת דגימות 96 באערים עמוקים.יש להניח לפחות 96 דגימות בלוחית כדי להבטיח שלא יבוזבז ריאגנט. סמנו את הלוחית במדבקת ברקוד המסופקת בערכה וסבבו אותה בצנטריפוגה כדי לנרמל את הנפחים. השאירו את הדגימות במגירה או במנדף למשך הלילה כדי לאפשר לנוזל להתאדות.כסו את הפלטה באופן רופף בעזרת מכסה או נייר סופג כדי למנוע חדירת אבק עד למחרת בבוקר. ודאו שהבארות יבשות; השתמשו במיכל ריאגנטים ובפיפט רב-ערוצי (שמונה ערוצים) של 10 µL כדי להעביר 4 µL של DNA Resus buffer לכל בארה לצורך רהידרטציה של הדגימות. אם מקפידים לא לגעת בנוזל, אין צורך להחליף את טיפי הפיפט בין עמודה לעמודה.בשלב הבא, העבירו 20 µL של רכיב MA one לכל באר בלוח באמצעות פיפט בעל שמונה ערוצים ואגן ריאגנטים נקי. כסו את הלוח עם אטם רב-פעמי, בצעו סנטריפוגה קצרה (pulse centrifuge) וערבוב ב-vortex למשך דקה אחת ב-1600 RPM על מערער מיקרו-לוחות (microplate shaker), והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות. השלבים הנותרים להגברה לא יוצגו בסרטון זה, אך ניתן למצוא את הפרוטוקול במאמר המלווה.לאחר הוספת כל הרכיבים, יש להניח את הפלטה בתנור מכויל כראוי שמוגדר ל-37 °C למשך 20 עד 24 שעות. לאחר ההגברה, דגימות ה-DNA עוברות פרגמנטציה והשקעה כפי שמתואר במאמר, ולאחר מכן השקעה בצנטריפוגה במהירות גבוהה. יש לבחון את תחתית הפלטה מבלי להפוך אותה.כדי לוודא שהדגימות שקעו לכדור כחול, השליכו את המכסה והסילו במהירות את הנוזל על ידי היפוך הפלטה והקשה חזקה עליה על משטח העבודה המכוסה בנייר סופג. לאחר היפוך הפלטה, יש להיזהר שלא להחזירה למצבה המקורי. כל עוד נותר נוזל, הקשו שוב ושוב על הפלטה כנגד משטח העבודה עד להסרת כל הנוזל.הניחו את הפלטה על מעמד למבחנות בצורה הפוכה לייבוש באינקובציה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר מכן, יש לבצע רספנסיה (resuspension) של ה-DNA כדי להתחיל בהליך ההיברידיזציה. הניחו פלטה של 96 בארות המכילה DNA שעבר רספנסיה על בלוק חימום בטמפרטורה של 95 °C למשך 20 דקות.כדי לדנטור את ה-DNA לאחר 20 דקות, הוציאו את פלטת הדגימות מבלוק החימום והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בזמן שפלטת הדגימות מתקררת, הכינו את תא הכוורת. יידרש תא אחד עבור כל ארבעה שבבי דבורה (bee chips) המעובדים. הניחו משטח גומי על החלק העליון של בסיס תא הכוורת, כאשר החור העבה מיושר עם חזית הבסיס.סמל הברקוד החרוט בבסיס צריך להישאר גלוי. בעזרת פיפט של 1000 µL, העבירו 400 µL של ריאגנט PB two לכל אחד משמונת מאגרי הלחות החרוטים בבסיס. הניחו את מכסה תא ה-hi על הבסיס והדקו את שני הקצוות על ידי הצבת שני תפסים בצדדים נגדיים באלכסון.ראשית, הניחו על השולחן ארבעה תבתי Hi chamber עבור כל תבת Hi chamber המשמשת, רגע לפני סיום זמן הקירור של 30 דקות. פתחו את מארזי שבבי חרוזי הכסף.הוצא את השבבים מהכיסויים השקופים שלהם מבלי לגעת בחרוזים. הנח כל שבב דבורה על תומך לתא (chamber insert). כוון את ברקוד השבב כך שיהיה מול סמל הברקוד החרוט על פני השטח העליונים של התומך.השלב הבא, הכולל את טעינת שבבי הדבורים (bee chips), עשוי להיות השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול. ביצוע נכון של שלב זה דורש תכנון מוקדם של ויזואליזציית העברת הדגימות מפלטת ה-DNA לשבב הדבורים. הסר והשלך את המכסה של פלטת הדגימות. ניתן להשתמש בפיפט רב-ערוצי כדי לחלק את הנוזל על השבבים, אך יש לתכנן מראש לשאוב רק את מספר הדגימות שניתן להניח בבטחה על שבב הדבורים, שכן מספר השורות בפלטה לא תמיד תואם למספר השורות בשבב.יש לקחת 15 µL של דגימה מלוחית הדגימות ולהעביר אותן באיטיות לכניסה של המערך. יש להקפיד בצורה יוצאת דופן להניח את הדגימה הנכונה על שבב החרוצים הנכון ובמיקום הנכון, בהתאם לסדר שבב החרוצים שנרשם קודם לכן.פתח את תא ה-hi והנח את התבניות מעל מאגרי הלחות. יש להניח את הברקוד של השבב מעל חריטת הברקוד בבסיס תא ה-hive. החזר את מכסה תא ה-hive וסגור את ארבעת התפסים על ידי סגירת התפסים בצדדים נגדיים באלכסון.ראשית, דגרו את תא ה-hi בתנור בטמפרטורה של 48 degrees Celsius למשך 16 עד 24 שעות. עם סיום ההכלאה (hybridization), הוציאו את תאי ה-hi מהתנור דגרו אותם בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות לצורך קירור. לאחר שתאי ה-hi התקררו, פתחו תא hi אחד. הסירו את אטום הכיסוי משבב bee על ידי תפיסת האטום באחת הפינות וקילופו בעדינות באלכסון.מיד לאחר הסרת האטם, הניחו את השבב על מגש לשבבי דבורה (bee chip tray) ושקעו אותו ב-PB one מבלי לגעת בחרוזים. חזרו על הפעולה עד שהמגש יתמלא בשבבי חרוזים. הקפידו ששום שבב לא יתייבש.נערה בעדינות את המגש כדי להסיר בועות אוויר והשאירי את השבבים טבולים למשך דקה אחת. נערה שוב את המגש. העבירי את מגש שבבי הדבורים לכלי שטיפה שני מלא ב-PB.One, נערה בעדינות והשאירי את השבבים בסבון למשך דקה אחת.לאחר מכן, ערבבו שוב בתחנת הרכבת זרימה של הנוזל. מקמו ארבעה תומכי זרימה מפלסטיק שחור בחריצים. מלאו את התחנה ב-PB one, אחד אחרי השני, עד שהנוזל כמעט מגיע לגובה שמונת תומכי ההרכבה.הוציאו את שבבי החרוצים מהמגש והניחו אותם בתחנת ההרכבה על תומך זרימה מפלסטיק; על ברקוד השבב להיות מיושר מעל סמל הברקוד החרוט בתחנת ההרכבה. לאחר שהנחתם ארבעה שבבים בתחנת ההרכבה, הניחו ספייסר פלסטיק שקוף מעל כל שבב חרוצים. הקצוות החיצוניים של הספייסר צריכים להקיף את התומכים בתוך תחנת ההרכבה.הנח את מוט ההרכבה מפלסטיק בתחנת ההרכבה על ידי התאמתו לחריצים. הנח בעדינות זכוכית כיסוי על גבי המרווח מפלסטיק, תוך דחיפת הקצה האחורי של הזכוכית אל מול מוט ההרכבה והורדה איטית של החלק הקדמי אל תוך הנוזל. החריץ בחלק העליון של הזכוכית צריך לפנות כלפי מטה, ישירות מעל הברקוד של השבב, כך שיישאר מרווח בין שבב הדבורה (bee chip) לבין הזכוכית בקצה הברקוד.לאחר בדיקה שאין בועות בין השבב לסלייד, הצמדו שני תפסים מתכתיים סביב הזכוכית. החליקו תפס אחד לכיוון קוד הבארקוד ואחד לכיוון החלק האחורי. קצוות התפסים מפלסטיק צריכים להחזיק את תומך הזרימה מפלסטיק שנמצא מתחת לשבב.איור זה מציג תרשים מלא של הרכבת זרימה חופשית (flow through assembly). לאחר שכל החרוצים נמצאים בהרכבות הזרימה החופשית שלהם, יש להשתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך את שני קצות המרווח (spacer) קרוב ככל האפשר לשקופית הזכוכית. כאשר מתקן התאים נמצא בזווית של 44 מעלות, יש להתחיל בפרוצדורה זו על ידי הצבת הרכבת זרימה חופשית של bee chip על מתקן התאים, באמצעות החלקת ההרכבה כלפי מטה ותליית התומך בחלק העליון. גבו של ה-bee chip צריך להיות במגע עם מתקן התאים.יש להפנות את זכוכית העמדה כלפי חוץ, כאשר החריץ נמצא למעלה כדי להוות מאגר ריאגנטים. לאחר שכל מכלולי שבבי הדבורים הוצבו על מתקן התאים, השתמשו בפיפט של 200 microliter כדי להוסיף 150 microliters של ריאגנט RA one למכלולי הזרימה. על ידי מזיגה של הנוזל למאגר הזכוכית, הריאגנט יזרום באופן טבעי במורד העמדה וייצא בבסיס המכלול, מה שיאפשר להוסיף ריאגנטים עתידיים ישירות למאגר.השלבים הנותרים לצביעת התבססות לא יוצגו. אנא עיינו בפרוטוקול שבכתב היד הנלווה עם סיום הצביעה וההתבססות. פרקו את מכלול הזרימה על ידי החדרת מוט מתכת דק בין התפסים לבין התומך.לאחר מכן ביצוע פיווט (pivoting). הניחו בצד את הפס הזכוכית והוציאו את שבב הדבורה; הניחו מיד שבב דבורה במגש שבבי דבורה אנכי והטביעו אותו ב-PB one, חזרו על הפעולה עבור כל מכלול של flow through. יש להקפיד להפנות כל שבב דבורה לאותו כיוון ולמזער את חשיפתם לאוויר.לאחר מכן השלימו הליך זה. על פי הפרוטוקול בטקסט המלווה, שבב דבורה שעובד כראוי אמור להציג עוצמות אור לייזר אדום וירוק בהירות ומובחנות בעת סריקה, מכיוון שהנוקלאוטידים המסומנים שהצמידו במהלך שלבי ההארכה והצביעה יפלוורסנסו תחת אורות שני הלייזרים. מוצגת כאן דגימת genomic DNA סטנדרטית שההוibrid-ציה שלה למערך SNP genotyping מותאם אישית הצליחה, בחלקים שעברו את סף העוצמה.במקרה של בקרת איכות (QC) תקינה, יסומנו באור ירוק החלקים השמאליים בתצוגת ה-bee chip. במקרה של עוצמה נמוכה מדי, יסומנו באור אדום בתצוגת ה-bee chip.בסיום הסריקה, המערכת תטמיע את התצוגות האדומות והירוקות זו על זו. כאן מוצגת תמונה מוגדלת, שכן נוקלאוטידים אלו מאריכים באופן סלקטיבי את שרשרת האוליגו-נוקלאוטידים של החרוזים שהשקיפה אל גדיל ה-DNA המגומש. מכיוון ששרשראות הנוקלאוטידים תוכננו להסתיים באתר הווריאנט, ניתן להשתמש בצבע ובעוצמה של האות שנוצר כדי לקבוע את האללים הנמצאים באתר ה-SNP.קבצי הפלט של הסורק מיובאים לתוכנת Genome Studio Analysis, המייצרת פרופילי אשכולות. זוהי דוגמה ל-SNP תקין עם שלושה אשכולות נבדלים המייצגים את הגנוטיפים aa, A, B ו-B, B, הצבועים באדום, סגול וכחול בהתאמה. תרשים עוצמה זה מציג את ה-SNP שדרש עריכה של האשכול המרכזי השחור, שאמור להיות הומוזיגוטי.AB נותר ללא זיהוי. אשכול ה-BB זוהה בטעות כ-ab. גרף העוצמה האחרון מראה SNP בעל ביצועים נמוכים.לא ניתן להפיק גנוטיפים מגרף עוצמה זה כיוון שאינם קיימים אשכולות מובחנים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לעבד את שבבי הדבורים במהירות. אין לחשוף אותם לאוויר למשך פרקי זמן ממושכים.

infinium-assay-for-large-scale-snp-genotyping-applications

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

רצפי DNA ונקווה היא אסטרטגיה מהיר וחסכוני לזהות גרסאות נדירים הקשורים פנוטיפים מורכבים של קבוצות גדולות. כאן אנו מתארים את ניתוח חישובי של רצפי נקווה הדור הבא, של 32 גנים הקשורים בסרטן באמצעות חבילת תוכנה ספלינטר. שיטה זו היא מדרגית, והיא חלה על כל הפנוטיפ של עניין.

זיהוי גנטי של וריאנטים נדירים מן הרצף נקווה שימוש Splinter

אנחנו מתארים שיטה חדשה של בידוד הדנ"א הגנומי מכל הדם שנאסף לפלזמה / סרולוגיה. לאחר איסוף פלזמה, הדם הדחוס בדרך כלל מושלך. השיטה החדשה שלנו מהווה שיפור משמעותי על פני שיטות קיימות והופכת את ה-DNA ופלזמה זמינה מאוסף אחד, מבלי לבקש דם נוסף.

שיטה מעשית ורומן לחלץ הדנ&quot;א הגנומי מערכות דם אוסף לשימור חלבון פלזמה

Periventricular קשרי הטרוטופיה (PNH) היא הצורה הנפוצה ביותר של מום ההתפתחות בקליפת המוח (MCD) בבגרות אבל את הבסיס הגנטי שלה אינו ידוע במקרים ספורדיים ביותר. לאחרונה פיתחנו אסטרטגיה לזיהוי גנים מועמדים חדשניים עבור MCDs וכדי לאשר ישירות שלהם תפקיד סיבתי בתוך vivo.

אסטרטגיה רומן המשלב מערך-CGH, רצף שלם-exome and בתוך הרחם אלקטרופורציה בחולדות לזיהוי גנים סיבתי של מומים המוח

מתוארת מערכת משולבת לריצוף ממוקד של הדור הבא של דגימות אונקולוגיות. מערכת חוצת פלטפורמות זו מותאמת לביופסיות גידול באיכות נמוכה ובכמות נמוכה, מתאימה לתשומות DNA נמוכות, כוללת בקרות מרובות וריאנטים מאופיינות היטב, וכוללת מתקשר וריאנט חדש המבוסס על אמצעי בקרת איכות כמותיים טרום-אנליטיים.

אינטגרציה של Wet ותהליכי ספסל יבשים מבצעת אופטימיזציה ממוקד רצף הדור הבא של איכות נמוכה וביופסיות גידול נמוכה כמות

יישוב הדור הבא רצפי היא גישה זמן - ו וחסכוניים זה נהיה יותר ויותר פופולרי לחקר מחלות והן אבחון קליני. הפרוטוקול המתואר כאן מציג את זרימת העבודה המורכבים הדרושים עבור רצף והתהליך ביואינפורמטיקה המשמש לזיהוי גנטי גרסאות שתורמים למחלות.

ממוקד הדור הבא רצפי וכן ביואינפורמטיקה צינור להעריך גורמים גנטיים של המחלה החוקתי

זיהוי של וריאציות גנטיות לתרום מחלות אנושיות מורכבות מאפשר לנו לזהות מנגנונים חדשניים. . הנה, נדגים הגישה מולטיפלקס genotyping של המועמד גנים או מסלול מפענוח ממקסם את הכיסוי במחיר נמוך, הוא נוטה מחקרי עוקבה מבוסס.

ג'ין המועמד בדיקות במחקרים קליניים עוקבה ועם Genotyping מרובבת ספקטרומטר מסה

הפרוטוקול מציג את ההליכים הכוללים במעבדה הנדרשים בבדיקות גנטיות טרום השרשה לאנופלואידיה על פלטפורמת ריצוף מבוססת מוליכים למחצה מהדור הבא. כאן אנו מציגים את השלבים המפורטים של הגברה גנומית שלמה, בחירת מקטעי DNA, בניית ספרייה, הכנת תבניות וזרימת עבודה של ריצוף עם תוצאות מייצגות.

בדיקות גנטיות טרום השרשה לאנופלואידיה על פלטפורמת ריצוף מבוססת מוליכים למחצה מהדור הבא

פיתחנו גישה אונקוגנומית השוואתית חוצת מינים המשתמשת בניתוחים גנומיים ובמסכים גנומיים פונקציונליים כדי לזהות ולהשוות מטרות טיפוליות בגידולים הנובעים ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית וסוג הגידול האנושי המתאים.

פרופיילינג גנטי וסינון נשירה בקנה מידה גנומי לזיהוי מטרות טיפוליות במודלים עכבריים של גידול ממאיר במעטפת עצב היקפית

בקנה מידה גדול של מסכי ספריות Metagenomic

Pyrosequencing (R) היא אחת מהשיטות יסודית ביותר עד כה פשוט עד כה נעשה שימוש כדי לנתח פולימורפיזמים. שיטה זו הובילה הערכה נוקלאוטיד יחיד מהיר ויעיל פולימורפיזם כולל פולימורפיזמים רלוונטיות קלינית רבים. הטכניקה והמתודולוגיה של Pyrosequencing הוא הסביר.

Pyrosequencing: שיטה פשוטה genotyping מדויק

למד את פרוטוקול Infinium Assay לגנוטיפינג בקנה מידה גדולה של מיליוני SNPs במדגמי DNA. שיטה זו מאפשרת זיהוי אללים בקצב גבוה תוך שלושה ימים לחקר קשרים גנטיים למחלות.

Infinium Assay עבור יישומי Genotyping SNP בקנה מידה גדולה

גלה סרטונים נוספים