Question 1

מהי ליגציה של DNA וכיצד היא פועלת בתאים?

Accepted Answer

ליגציה של DNA היא תגובה אנזימטית המחברת שתי מולקולות DNA על ידי יצירת קשר פוספודיאסטרי קוולנטי. DNA ליגאזים מזהים ואוטמים שברים בשלד ה-DNA על ידי זרז יצירת קשר בין קבוצת ה-3'-הידרוקסיל לקבוצת ה-5'-פוספט. בתאים, ליגציה מתרחשת במהלך השכפול של ה-DNA ומתקנת שברים בחוט בודד או כפול כחלק מתהליכים תאיים רגילים.

Question 2

מדוע קצוות דביקים (sticky ends) מועדפים על פני קצוות קטומים (blunt ends) בליגציה של DNA?

Accepted Answer

קצוות דביקים (Sticky ends) מכילים זוגות בסיסים משלימים הבולטים מעבר לקצה (overhangs), המייצבים את תגובת הליגציה, ובכך הופכים את התהליך ליעיל יותר ומקלים על האנזים בחיבור מקטעי ה-DNA. קצוות קטומים (Blunt ends) חסרים זיווג בסיסים משלים, מה שמוביל לליגציה פחות יעילה שהשלמתה קשה יותר עבור האנזים. קצוות דביקים וקטומים אינם יכולים לעבור ליגציה יחדיו בנסיבות רגילות.

Question 3

כיצד מקטע Klenow ממיר קצוות דבקים לקצוות קהים?

Accepted Answer

מקטע קלנו (Klenow fragment), המופק מ-DNA polymerase 1 שעבר עיכול באמצעות subtilisin, בעל פעילות exonuclease בכיוון 3' ל-5' וכן פעילות polymerase. פעילות ה-exonuclease מסירה בליטות (overhangs) בקיצון 3', בעוד שפעילות ה-polymerase מאריכה את קיצון 3' של הגדיל המשלים כדי להפוך בליטות בקיצון 5' לקצוות קטומים (blunt ends), ובכך ממירה ביעילות קצוות דביקים (sticky ends) לקצוות קטומים.

Question 4

מהי מטרת הטיפול באלקליין פוספטאז בתגובות ליגציה?

Accepted Answer

אלקלי פוספטאז מסיר קבוצות פוספט מקצה '5 של שני קצות ה-DNA של הווקטור לאחר עיכול באמצעות אנזימי הגבלה. פעולה זו מונעת ליגציה עצמית, תוצאה בלתי רצויה שבה הווקטור נסגר מחדש ללא שילוב של ה-DNA של המקטע המוכנס (insert), ובכך מגבירה את ההסתברות שהמקטע המוכנס ילווה בליגציה אל תוך הווקטור.

Question 5

מדוע נעשה שימוש ביחס של 3 ל-1 בין המקטע המוכנס (insert) לווקטור בתגובות ליגציה?

Accepted Answer

יחס מולרי של 3 ל-1 בין DNA המקור (insert DNA) לבין DNA הווקטור (vector DNA) מגדיל את ההסתברות שהמקור יקושר אל הווקטור, במקום שהווקטור יקושר לעצמו. יחס זה מחושב על בסיס ריכוזי ה-DNA שנמדדו באמצעות ספקטרופוטומטר והמשקלים המולקולריים של מקטעי הווקטור והמקור המופקים, כדי לקבוע את הנפחים המתאימים לתגובה.

Question 6

כיצד נבדלים הטמפרטורה ומשך הזמן בין ליגציות של קצוות דביקים (sticky ends) לבין ליגציות של קצוות קהים (blunt ends)?

Accepted Answer

ניתן לבצע ליגציות של קצוות דביקים (sticky ends) עם בליטות של שישה זוגות בסיסים בטמפרטורה קרובה לטמפרטורת החדר למשך כשעה אחת, מכיוון שקצוות משלימים מייצבים את חיבור הפסקמנטים. בליטות קצרות יותר או ליגציות של קצוות קטומים (blunt ends) דורשות טמפרטורות נמוכות יותר, בין 14 ל-20 מעלות צלזיוס, ויש להדגרינן למשך לילה כדי לאפשר זמן מספיק לתהליך החיבור הפחות יעיל.

Question 7

מהם היישומים הנפוצים של ליגציה של DNA במחקר בביולוגיה מולקולרית?

Accepted Answer

ליגציה של DNA משמשת להחדרת מקטעים שהוגברו ב-PCR לתוך פלסמידים לינאריים לצורך יצירת ספריות גנים, לחיבור לינקרים של אוליגונוקליאוטידים המכילים אתרי קישור של פריימרים ל-PCR למקטעי DNA מטוהרים לצורך רצף (sequencing), ולביצוע בדיקות ליגציה בקרבת מקום (proximity ligation assays) בתאים מקובעי פורמאלדהיד כדי לזהות אינטראקציות של כרומטין בקנה מידה שונה.

תגובות קשירת DNA - חידון הערכה