Name: מדידת מצב יציב, טרום מצב יציב, וחד מחזור קינטי לפעילות ה-DNA Glycosylase (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: חקור את קינטיקת האנזים של DNA glycosylase באמצעות טכניקות קינטיות מהירות. למדו למדוד מצב יציב, טרום מצב יציב ותורנות בודדת לפעילות תיקון ה-DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר ג&#39;ולי ק הורטון לקריאה ביקורתית של כתב היד וRajendra פראסאד ד&quot;ר להצעות ודיונים מועילים. חלקים ממחקר זה פורסמו במקור בכתב העת לכימיה ביולוגית, סאסא ואחרים. אל., &quot;השפעות רצף ה-DNA הקשר על פעילות Glycosylase של Glycosylase-DNA של 8 Oxoguanine האנושי&quot;. J Biol Chem. 287, 36,702-36,710 (2012) 2. עבודה זו נתמכה, במלואו או בחלקו, על ידי המכונים הלאומי לבריאות מחקר פרויקט גרנט Z01-ES050158 בתכנית המחקר העירוני, NIEHS.

1. הכנה של אנזים ומצע DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעל מפורש OGG1 כחלבון GST-היתוך בE. coli, לנצל GST, התגית לטיהור, ולאחר מכן להסיר את GST-תג על ידי מחשוף עם HRV-3C פרוטאז (איור 1) 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש מסונתז כימי oligonucleotide שכותרת גדיל oligonucleotide ללא תווית משלימה 5&#39;-6-carboxyfluorescein (6-FAM) המכיל שאריות של 8 oxoG אחת ו. את oligonucleotides 34-mer מכיל 8-oxoG במיקום 17 מ5&#39;-end. לטהר oligonucleotides אלה על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מצע גדילי הדנ&quot;א כפול המכיל 8-oxoG ידי oligonucleotide ערבוב 5&#39;-6-FAM שכותרתו עם הגדיל המשלים שלו ביחס טוחנת של 1:1.2 במאגר חישול (10 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5, 50 מ&quot;מ NaCl, 1 mM EDTA) בצינור 1.5 מיליליטר microfuge. מניחים את הצינור בלצוף במים רותחים למשך 5 דקות. השאר את הצינור למקום ולאחר מכן לתת את המים קרים באיטיות לימיןטמפרטורת Oom (זה לוקח כ 2 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הכנת מדגם והניסוי בתנאי תאורה נמוכה או מינימאלי כדי למזער photobleaching של תווית הניאון. </li></ol> 2. מדידה כמובן זמן מצב יציב וטיטרציה אתר פעילה של OGG1 2.1. הכנת מדגם וכמובן זמן מצב יציב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מצע ה-DNA ופתרוני OGG1 בנפרד במאגר התגובה (50 HEPES מ&quot;מ, pH 7.5, 20 מ&quot;מ KCl, 0.5 mM EDTA, ו -0.1% אלבומין בסרום שור) ב1.5 צינורות microfuge מ&quot;ל על קרח. הריכוז של ה-DNA של 400 ננומטר והריכוז לכאורה של OGG1 הוא 30, 60, 90, או 120 ננומטר, כפי שנקבעו על ידי assay חלבון ברדפורד. מניחים את צינורות התגובה בסט גוש חום על 37 ° C. אנזים טרום דגירה ופתרונות מצע DNA בנפרד על 37 מעלות צלזיוס במשך דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל את התגובה על ידי ערבוב כמויות שווה של את פתרונות מצע OGG1 וה-DNA על ידי pipetting. לאחר ערבוב solu אלהtions 1:1 (V / V), את הריכוזים הסופיים הם דנ&quot;א 200 ננומטר ו 15, 30, 45, או 60 ננומטר OGG1, בהתאמה. הסר aliquots (10 μl) במרווחי זמן ולהרוות את התגובה על ידי ערבוב עם μl 1 של 1 M NaOH. כשליטה לקורסים בזמן, 10 μl של תערובת התגובה ללא אנזים הוא מעורבב עם μl 1 של 1 M NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את דגימות תגובה ב90 ° גוש חום צלזיוס למשך 5 דקות לדבוק מוצר הסופי AP באתר. לאחר חימום, להוסיף μl 1 של 1 M HCl לנטרל מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה (12 μl) של חיץ טעינת ג&#39;ל (לפוראמיד 95%, 20 מ&quot;מ EDTA, 0.02% bromophenol, ו0.02% cyanol קסילן) לכל דגימת תגובה, ולאחר מכן הנח את התערובת בגוש חום נקבע על 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואז למקם את הצינור מייד על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הדגימות (5 μl) על גבי 15% ג&#39;ל המכיל אוריאה polyacrylamide denaturing ז 8 ב89 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 8.8, חומצה בור 89 מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ וEDTA. את המוצרים בקעו המצע ומופרדים היטב לאחרפועל ג&#39;ל. </li></ol> 2.2. הדמיה של ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את הג&#39;ל באמצעות imager שיכול לזהות את ה-DNA שכותרתו fluorescently ולדמיין את המצע ולהקות מוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את הלהקות לאחר ההדמיה ג&#39;ל. שים לב שחלק מחשוף רקע אפשר לראות לאחר טיפול של המצע עצמו עם NaOH (איור 2 א). לחסר רקע זה מכמות המדודה של כל מוצר תגובה. </li></ol> 2.3. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתוות את כמות המוצר שנוצרה בכל פעם תגובה (t) (איור 2). לנתח את נתוני הגלם באמצעות משוואה 1 כדי לקבוע את המשרעת של פרץ (0, חיתוך-y) והשיפוע של שלב המצב יציב ליניארית (V-SS). </li></ol><img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1.jpg" /><ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילהיחסית חיתוך-y לריכוז החלבון הכולל (ריכוז אנזים לכאורה כלומר; איור 2 ג), מתן מידה של החלק הפעיל של אנזים. השתמש בכושר ליניארי עם ליירט אפס לספק גורם התיקון לקביעת החלק של אנזים פעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה שיעור המצב יציב יחסית לריכוז האנזים הפעיל (איור 2 ד), מתן לדרג את מוצר הניתוק קבוע (כלומר שיפוע של הקו המצויד). </li></ol> 3. מדידה כמובן זמן טרום מצב יציב כפי שמוצג באיור 2, היווצרות מוצר בשלב פרץ הוא מהיר מדי למדידה על ידי ערבוב ומרווה ידני. לפיכך, מכשיר להרוות-זרימה מהירה יכול לספק שיטה רב עוצמה כדי למדוד תגובה מהירה המתרחשות בקנה מידת זמן אלפית השנייה (איור 3) 5. המכשיר משתמש במנוע מבוקר מחשב לערבב במהירותND להרוות את התגובות אחרי זמני תגובה מצוינים. כך, למשל, להשתמש באמצעי להרוות-Flow RQF-3 ראפיד Kintek למדוד את השלב הראשוני ושלב פרץ מצב יציב הבא של היווצרות מוצר catalyzed ידי OGG1. מכשירים להרוות-זרימה מהירות זמינים ממספר יצרנים. 3.1. הכנת המדגם בנפרד להכין את מצע ה-DNA ופתרוני OGG1 בצינורות 1.5 מ&quot;ל כפי שתואר ב2-1. הריכוזים של ה-DNA וOGG1 הפעיל הנן 400 ננומטר ו -80 ננומטר, בהתאמה. כתוצאה מכך ריכוזים סופיים של ה-DNA ו200 ננומטר 40 ננומטר OGG1 הפעיל לאחר ערבוב 1:1 (V / V). 3.2. הכנת המכשיר להרוות-זרימה מהירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר אמבט מים במחזור למכשיר להרוות-הזרימה המהיר לבקרת טמפרטורה (37 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את הפרמטרים של המכשיר ובחר את לולאת התגובה המתאימה לזמן הרצוי נקודות בהתאם להוראתו של היצרןtions. הלולאות הן התגובה של אורכים משתנים כדי לספק זמני תגובה חלופיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ תגובה וNaOH להרוות פתרונות ב10 מ&quot;ל מזרקים luer נעל חד פעמי ולצרף המזרקים האלה ליציאות הכונן ולטעון את מאגרי הכונן עם מאגר התגובה (מזרקים B) ו142 מ&quot;מ NaOH (מזרק ש) (שסתום טען מזרק בעמדת טעינה) . כדי להסיר את בועות אוויר מהמזרק, יעבדו פתרון הלוך ושוב כמה פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את מנוע צעד עד שהוא קשר העליון של המזרקים (שסתומים טען מזרק וטען שסתומים לדוגמה בעמדת אש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את לולאות לדוגמה, לולאת התגובה, ושורת סיום במים ומתנול. ייבש את האזורים הסמוקים לחלוטין (שסתומים בעמדת סומק). </li></ol> 3.3. כמובן זמן מראש מצב יציב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חור בחלקו העליון של צינור כתרים 1.5 מ&quot;ל באמצעות מחט 16 מד. צרף צינור בקו היציאה לאסוף את התגובה הרווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את reactio הרצויזמן n (בשניות) באמצעות לוח המקשים. מנוע צעד יהיה לגבות להתאים לנפח לולאה כדי לשמור על נפח להרוות מתמיד. בוכנות עמדה עבור B המזרק נגד פלטפורמת מנוע צעד על ידי הוספת חיץ עם המזרקים חד פעמיים המחוברים ליציאות הכונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא 1 מ&quot;ל מזרקים luer נעל חד פעמי עם מצע ה-DNA ופתרוני OGG1, בהתאמה (שסתומים לדוגמה בעמדת טעינה). צרף מזרקים עם מצע ה-DNA וOGG1 פתרונות לכל אחת מיציאות טעינת המדגם, ולאחר מכן למלא את לולאות לדוגמה עם מצע ה-DNA ופתרוני OGG1, בהתאמה (לדוגמה טען שסתום בעמדת טעינה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את כל השסתומים טען מזרק וטען שסתומים לדוגמה למצב האש. התחל את התגובה על ידי שבץ לוח מקשים (עיתונות לדוגמה של &quot;G&quot; או על מקש &quot;התחל&quot;). מצע ה-DNA ופתרוני OGG1 (18 μl כל אחד) מעורבבים באופן מיידי בלופ התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה עד שהתגובה הוא רווה באופן אוטומטי בזמן התגובה הרצוי על ידי ערבוב של 36 μl Rתערובת eaction עם 86 μl של 142 מ&quot;מ NaOH. לאחר מרווה התגובה, המדגם ריקה מהקו היציאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את סתום טען מזרק לעמדת הטעינה וטען שסתום לדוגמא לעמדת הסומק. לשטוף את לולאות לדוגמה, לולאת התגובה, ושורת סיום במים ומתנול ולייבש כמתואר ב3.2. חזור על התהליך לעיל לכל נקודת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניסוי שליטה ללא אנזים כדי לקבוע תיקון רקע, אשר יכול להיעשות באופן ידני או עם המכשיר מהיר להרוות. כדי לבצע בקרה עם המכשיר מהיר להרוות, למלא את לולאת דגימת DNA עם מצע לדנ&quot;א אבל לשמור לולאת דוגמה עבור OGG1 ריק. הגדר את זמן התגובה, לבצע את התמהיל ולהרוות כפי שמתואר ב3.3.4-3.3.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את לולאות לדוגמה ואת לולאת התגובה עם 2 M NaOH, 2 M HCl, מים ומתנול ולאחר מכן לייבש את קווי שטף. לאחר הגדרת מנוע צעד לעמדת הבית, לעבור את סתום טען מזרק כדי positio העומסn ולשטוף את הכונן עם מאגרי מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את הדגימות הרווות תגובה עם חום, ולאחר מכן מצע נפרד וה-DNA של המוצר ב -15% denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide כפי שמתואר ב2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזות ולכמת את הלהקות על הג&#39;ל כמתואר ב2.2. </li></ol> 3.4. ניתוח נתונים להתאים את הקורסים בזמן של היווצרות מוצר על ידי ניתוח רגרסיה ליניארי למשוואה עם עלייה במונחי מעריכי וליניארית (משוואה 2) מספקים שיעור מהסדר הראשון הקבוע (K obs), המשרעת של פרץ (0), ו שיעור ליניארי (V-SS). <img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2.jpg" /> 4. כמובן זמן יחיד מחזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה-DNA ומצע OGG1 בצינורות 1.5 מ&quot;ל נפרד כמתואר ב2-1. הריכוזtions של ה-DNA וOGG1 הפעיל הנן 100 ננומטר ו 500 ננומטר, בהתאמה; זה מניב ריכוזים סופיים של ה-DNA ננומטר 50 ננומטר ו250 OGG1 לאחר ערבוב 1:1 (V / V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המכשיר להרוות-הזרימה המהירה ולהכין את דגימות התגובה, כמתואר ב3.2 ו -3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את דגימות תגובה הרווות עם חום ולייחד להם עד 15% denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide למוצרי מצע ונפרד כמתואר ב2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזות ולכמת את הלהקות על הג&#39;ל כמתואר ב2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את הקורסים בזמן של היווצרות מוצר לאחד מעריכי לקבוע שיעור קבוע מהסדר הראשון (K obs) כנתון במשוואה 3. </li></ol><img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3.jpg" />

<ol><li>Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-turnover+and+pre-steady-state+kinetics+of+the+reaction+of+the+adenine+glycosylase+MutY+with+mismatch-containing+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates.</a> Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).</li>
<li>Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+context+effects+on+the+glycosylase+activity+of+human+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).</li>
<li>Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presteady-state+analysis+of+a+single+catalytic+turnover+by+Escherichia+coli+uracil-DNA+glycosylase+reveals+a+%22pinch-pull-push%22+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a "pinch-pull-push" mechanism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+transient-state+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in transient-state kinetics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 9, 87-89 (1998).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+kinetic+analysis+of+mechanochemical+adenosinetriphosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases.</a> Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).</li>
<li>Kovtun, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OGG1+initiates+age-dependent+CAG+trinucleotide+expansion+in+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells.</a> Nature. 447, 447-452 (2007).</li>
<li>Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+by+AP-endonuclease%3A+potential+coordination+of+the+initial+steps+in+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair.</a> Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).</li>
<li>Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+and+reaction+mechanism+of+murine+8-oxoguanine-DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).</li>
<li>Waters, T. R., Swann, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+the+action+of+thymine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).</li>
<li>Nilsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excision+of+deaminated+cytosine+from+the+vertebrate+genome%3A+role+of+the+SMUG1+uracil-DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase.</a> The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).</li>
<li>Gill, S. C., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+protein+extinction+coefficients+from+amino+acid+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.</a> Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).</li>
<li>Van de Berg,, Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+structure+and+aspartate+276+influence+nucleotide+binding+to+human+DNA+polymerase+beta.+Implication+for+the+identity+of+the+rate-limiting+conformational+change%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).</li>
<li>Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. M., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+removal+of+formamidopyrimidines+by+8-oxoguanine+glycosylases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient removal of formamidopyrimidines by 8-oxoguanine glycosylases.</a> Biochemistry. 47, 1043-1050 (2008).</li>
<li>Leipold, M. D., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+hydantoin+products+of+8-oxoguanine+oxidation+by+the+Escherichia+coli+DNA+repair+enzyme%2C+FPG%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG.</a> Biochemistry. 39, 14984-14992 (2000).</li>
<li>Zhao, X., Krishnamurthy, N., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+versus+repair%3A+NEIL1+removal+of+hydantoin+lesions+in+single-stranded%2C+bulge%2C+bubble%2C+and+duplex+DNA+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts.</a> Biochemistry. 49, 1658-1666 (2010).</li>
<li>Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+removal+of+oxidized+guanines+in+duplex+DNA+by+the+base+excision+repair+enzymes+hOGG1%2C+yOGG1%2C+and+yOGG2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2.</a> Biochemistry. 42, 11373-11381 (2003).</li>
<li>Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+acetobutylicum+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+%28Ogg%29+differs+from+eukaryotic+Oggs+with+respect+to+opposite+base+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination.</a> Biochemistry. 47, 7626-7636 (2008).</li>
<li>Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-dependent+DNA+damage+and+repair+in+a+trinucleotide+repeat+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence.</a> Biochemistry. 48, 6655-6663 (2009).</li>
<li>Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+roles+of+tyrosine+82+and+glycine+253+in+the+Escherichia+coli+adenine+glycosylase+MutY%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY.</a> Biochemistry. 44, 14179-14190 (2005).</li>
<li>Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenine+removal+activity+and+bacterial+complementation+with+the+human+MutY+homologue+%28MUTYH%29+and+Y165C%2C+G382D%2C+P391L+and+Q324R+variants+associated+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer.</a> DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).</li>
<li>Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+mammalian+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+by+cadmium%28II%29%3A+implications+for+cadmium+genotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity.</a> DNA Repair. 1, 661-670 (2002).</li>
<li>Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+persistence+of+8-oxo-7%2C8-dihydroguanine+within+a+hairpin+intermediate+exacerbates+a+toxic+oxidation+cycle+associated+with+trinucleotide+repeat+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion.</a> DNA Repair. 10, 887-896 (2011).</li>
<li>Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+DNA+glycosylase+activity+of+OGG1+by+NEIL1%3A+functional+collaboration+between+two+human+DNA+glycosylases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases.</a> Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).</li>
<li>Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+interaction+between+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+and+AP+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease.</a> DNA Repair. 6, 317-328 (2007).</li>
</ol>

יש מחברים אין לחשוף.

את הקינטית הגישות מתוארות כאן מתארים שיטות להגדרת קבועים קינטיים יסודיים. אם מהלך זמן של היווצרות המוצר הוא biphasic עם המחזור הראשון האנזימטית מתרחש במהירות, ולאחר מכן צעד אחרי הכימיה הוא שיעור הגבלה במהלך מחזורים קטליטיים שלאחר מכן. במקרה של OGG1, ניתן למדוד את המחזור הראשון באמצעות ריכוזי אנזים גבוהים עם או הגבלה (S &lt;E) או (S&gt; E גבוהה) ריכוזי ה-DNA. במקרה הראשון, התגובה מוגבלת ל &#39;יחיד מחזור&#39; ומספקת מדד של שיעור קטליטי באתר הפעיל של האנזים. במקרה האחרון, מחזורים אנ...

סביבה אירובית ממהרת חוסר יציבות גנומית. נגע DNA promutagenic גדול כתוצאה מלחץ חמצוני הוא 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG). זאת בשל פוטנציאל הקידוד המעורפל של 8-oxoG. אדם 8-DNA oxoguanine glycosylase (OGG1) הוא אחראי לייזום תיקון כריתת בסיס של 8-oxoG. פעילות glycosylase של OGG1 בולה בסיס 8-oxoG וכתוצאה מכך ה-DNA של המוצר עם אתר apurinic (AP באתר). פעילות lyase חלשה של OGG1 יכולה לחתוך את AP באתר במקרים מסוימים. אפיון הקינטית של glycosylases DNA בדרך כלל מגלה שהם מפגינים קורסי זמן biphasic. לאחר שלב ראשוני של היווצרות מהירה של מוצר (כלומר פרץ), שלב מצב יציב ליניארי הוא ציין 1-3. התנהגות זו מעידה על צעד בעקבות כימיה (שינוי קונפורמציה כלומר או שחרור מוצר) ששיעור הגבלה במהלך החלק ליניארית של הזמן כמובן, ואילו ספחתרח שלב, המכונה לעתים קרובות את השלב החולף, מתאים להיווצרות מוצר באתר הפעיל אנזים במהלך המחזור של התגובה הראשונה. כאשר שחרור המוצר הוא שיעור הגבלה בשלב המצב יציב, מדידות פעילות לספק מידה איכותית של זיקה המחייבת DNA של מוצר, אך אינו מספקות מידע בנוגע לאירועים בהקינטית אנזים האתר הפעיל (כלומר כימיה). בהתאם לכך, שיטות לבודד ולמדוד את שלב פרץ מראש מצב יציב מעריכי יש צורך לחקור אירועים במהלך המחזור האנזימטית הראשון בשעה 4 האתר הפעיל של האנזים. קיימות שלוש גישות סטנדרטיות להקינטית מאפיינות את ההתנהגות הקטליטית של OGG1, (1) מצב יציב, (2) מראש מצב יציב, וכן (3) חד המחזור. גישות אלה שונות זו מזו על ידי הריכוז של אנזים בתערובת התגובה ואת האנזים ליחס מצע מנוצל בכל גישה. בגישת מצב יציב טיפוסי,מכונה קינטיקה תחלופה מרובות לפעמים, ריכוזים נמוכים של אנזים המשמשים למעקב היווצרות מוצר. ריכוז המצע עולה בהרבה על ריכוז האנזים כך שאיבודים אנזימטיות מרובים אינם משפיעים על ריכוז מצע באופן משמעותי. במצב זה, קורסי זמן צריכים להיות ליניארי, ולעתים קרובות קשה להבחין אם פרץ התרחש במהלך המחזור הראשון בשל ריכוז האנזים הנמוך בשימוש בגישה זו; לב שהמשרעת פרץ היא שווה ערך לריכוז האנזים. זו ניתן להתגבר על ידי שימוש בריכוז גבוה יותר והשערת אנזים כמובן הזמן ליניארי לאפס זמן כדי לזהות אם המחזור האנזימטית הראשון התרחש במהירות. ליירט בordinate (ציר y) צריך להיות פרופורציונלי לריכוז האנזים ומספק מידה מסוימת של האנזים מעורב באופן פעיל עם מצע. למרות שגישה זו יכולה באופן עקרוני לספק ראיות לקיומו של שלב פרץ, אונטערשיידגישה שונה שממפה נדרש למדוד את הקינטיקה של שלב פרץ. במקרים רבים שלב פרץ הוא מהיר מדי למדידה על ידי טכניקות ערבוב ומרווה ידניות. במצב זה, הקינטית מראש מצב יציב וחד מחזור (כלומר הקינטית חולף) מתקרב לעתים קרובות דורש מכשיר ערבוב מהיר ומרווה לעקוב אחרי נקודות זמן מוקדמות של תגובה 5. בגישה מראש מצב יציב ריכוזים גבוהים של אנזים נמצאים בשימוש, כך שכמות משמעותית של מוצר נוצר במהלך המחזור הראשון. מאז מחזורים מרובים ואחרי רכיבה על אופניים כדי לבחון קטליטי (כלומר השלב ליניארי שאחרי פרץ), ריכוז מצע גדול מריכוז האנזים ([אנזים] &lt;[מצע]). לבודד אירועים באתר הפעיל של האנזים ללא רכיבה על אופניים קטליטי, תנאים יחיד מחזור מנוצלים. במקרה זה, מצע רווי באנזים (E &gt;&gt; S) כך שכל המצע ישתתףn &#39;התחלופה היחידה &quot;, ובדרך כלל תפגין כמובן זמן יחיד מעריכים. כפי שצוין לעיל לאנזימים כי תערוכת שלב פרץ, שחרור מוצר (k כבוי) לעתים קרובות מגביל את השיעור של השלב היציב של מהלך הזמן. קצב השחרור של מוצר (. / שעת V ss, קונצרט כלשהו) ניתן לקבוע מן המדרון של שלב המצב יציב ליניארי. ריכוז האנזים הפעיל (ה) יש צורך להמיר את קצב שחרור מוצר לקצב פנימי מתמיד כאשר k = v את ss / [E]. חשוב לציין, ריכוז האנזים הפעיל הוא בדרך כלל נמוך יותר מהריכוז שנמדד החלבון בשל זיהומים, האנזים פעיל, אנזים שאינם פרודוקטיבית חייב מצע, ואת השיטה המשמשת לקביעת ריכוז חלבון. ריכוז האנזים הפעיל ניתן לקבוע ממשרעת פרץ, כאשר שחרורו של המוצר הוא איטי. לפיכך, חיוץ כמובן זמן מצב יציב לזמן אפס מספק אומדן של האנזים הפעיל הדרושים כדי לחשב את K (שחרור מוצר) מהשיעור שנצפה המצב יציב. כדי למדוד את הקינטיקה של פרץ, גישה מראש מצב יציב היא צורך לעקוב אחר היווצרות המוצר במהלך המחזור הראשון המתרחש לפני שלב המצב יציב ליניארי. קינטיקה הפרץ כדלקמן היווצרות אנזימים מוצר ביניים. ברגע שהתגובה היא שיזמה אנזים ערבוב עם מצע, את כמות אנזים התוצר מגבירה במהירות עד שהתגובה מגיעה שלב מצב יציב. אם קטליזה היא הרבה יותר מהיר מאשר שחרור מוצר, את המשרעת של פרץ שווה לאנזים מעורב באופן פעיל וגישת מעריכי שנצפו לשיווי משקל (K obs) מתאימה לשיעור ההמרה כימית של מצע למוצר, בהנחת שהשיעור ההפוך של כימיה היא זניחה. בכמה מקרים CY קטליטינאחזים מפריע לניתוח מראש מצב יציב, כגון כאשר הבהירויות של שיעורי כימיה ושחרור המוצר אינן שונות באופן משמעותי. במקרה זה, העסקת קרוב משפחה אנזים עודף לרכיבה על אופניים מונעת מצע הקטליטי ומצע מגבלות כרוכות באנזים למחזור אחד. בהתאם לכך, הצעד הכימי הראשון של התגובה יכול להיות מבודד ונקבע במדויק כקבוע קצב מהסדר ראשון (k תצפיות). שיעור זה קבוע צריך להיות דומה לK obs נקבע מהגישה מראש המצב יציב שתוארה לעיל. כאן אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש בגישות אלה הקינטית לנתח את פעילות glycosylase של OGG1.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>5'-6-FAM ניתן להשתמש גם באוליגונוקלאוטידים עם תווית רדיו של 8-oxoG</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>5'-P32. מומלץ דרגת טיהור ג'ל פוליאקרילאמיד. </td></tr><tr><td>אוליגונוקלאוטידים ללא תווית (גדיל משלים)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>Polyacrylamide ג'ל דרגת טיהור מומלצת. </td></tr><tr>ניתן להשתמש גם <td>במזרק חד פעמי BD Luer Lock</td> BD <td>Medical</td><td>309628</td><td>Lue Lock של ספקים אחרים.</td></tr><tr>ניתן להשתמש גם <td>במזרק חד פעמי BD Luer Lock</td><td>BE Medical</td><td>309604</td><td>Luer Lock מזרק חד פעמי מספקים אחרים.</td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>אמבט מים במחזור</td> ניתן להשתמש גם <td>בכל מוכר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument</td><td>KinTek Corporation</td><td></td><td>Rapid Quench-Flow Instrument מספקים אחרים.</td></tr><tr>ניתן להשתמש גם <td>ב-Typhoon Phosphorimager 8600</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td>Imager מספקים אחרים.</td></tr><tr>תוכנת <td></td><td></td><td>KaleidaGraph</td><td>Synergy</td></tr></tbody></table>

מדידת מצב יציב, טרום מצב יציב, וחד מחזור קינטי לפעילות ה-dna glycosylase

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

אדם 8-DNA oxoguanine glycosylase (OGG1) בולה נגע DNA חמצוני מוטגניות 8-אוקסו 7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) מ-DNA. אפיון הקינטית של OGG1 נעשה כדי למדוד את שיעורי הכריתה 8-oxoG ושחרור מוצר. כאשר ריכוז OGG1 הוא נמוך יותר מאשר ה-DNA המצע, קורסים בזמן של היווצרות המוצר הם biphasic; שלב מעריכי מהיר (כלומר פרץ) של היווצרות מוצר ואחריו שלב מצב יציב ליניארי. פרץ הראשוני של היווצרות המוצר מתאים לריכוז של אנזים עוסק כראוי על המצע, ואת המשרעת פרץ תלויה בריכוזו של אנזים. השיעור ראשון הסדר הקבוע של פרץ מתאים לקצב הפנימי של כריתת 8-oxoG וקצב איטי יותר מצב יציב מודד את קצב שחרור מוצר (מוצר ה-DNA שיעור קבוע דיסוציאציה, K כבוי). כאן, אנו מתארים מצב יציב, מראש מצב יציב, ואחת גישות מחזור לבודד ולמדוד SPצעדי ecific במהלך רכיבה על אופניים OGG1 קטליטיים. Oligonucleotide המכיל נגע שכותרת ניאון וOGG1 מטוהרים משמשים כדי להקל על מדידות מדויקות הקינטית. מאז ריכוזי אנזים נמוכים משמשים לביצוע מדידות מצב יציב, הוראות ערבוב של חומרים כימיים ומרווה של התגובה ניתן לבצע כדי לברר את שיעור המצב יציב (k כבוי). בנוסף, ניפוח של שיעור המצב יציב לנקודה על ordinate בזמן אפס מציין כי פרץ של היווצרות מוצר התרחש במהלך המחזור הראשון (כלומר חיתוך-y הוא חיובי). ניתן למדידה בשיעור הקבוע מהסדר הראשון של שלב פרץ מעריכי בטכניקת ערבוב ומרווה מהירה הבוחנת את כמות המוצר שנוצר במרווחי זמן קצרים (&lt;1 שניות) לפני שלב המצב יציב ומתאים לשיעור של 8 oxoG-כריתה (כלומר כימיה). הצעד הכימי גם ניתן למדוד באמצעות גישה יחידה שבו רכיבה על אופניים מחזור הקטליטי הואלמנוע על ידי דנ&quot;א מצע להרוות עם אנזים (E&gt; S). גישות אלו יכולות למדוד את קבועי קצב יסודיים המשפיעים על היעילות של הסרת נגע ה-DNA.

ניתוח הקינטית מצב יציב בוצע על ידי שימוש במצע DNA ננומטר 200 וארבעה ריכוזים שונים של OGG1 לכאורה (15, 30, 45, ו -60 ננומטר), כפי שנקבע על ידי רדפורד assay חלבון 2. את הקורסים בזמן של היווצרות מוצר שיתאימו למשוואה ליניארית כדי לקבוע 26 ננומטר, בהתאמה, ביחס לכל ריכוז חלבון (איור 2) החיתוך-y, שהיו 2.2, 11, 15, ו. ה-Y מיירט נוסף היו זמם ביחס לכל ריכוז חלבון בפועל (איור 2 ג). החלק של אנזים פעיל נקבע להיות 38% מהשיפוע של הקו באיור 2 ג...

קורסי זמן לפעילות glycosylase של glycosylase-DNA של 8 oxoguanine הם biphasic מפגין פרץ של היווצרות מוצר ושלב מצב יציב ליניארי. תוך שימוש בטכניקות להרוות-זרימה, פרץ וניתן למדוד את שיעורי המצב יציב, אשר תואמות לכריתה של 8-oxoguanine ושחרורו של glycosylase מ-DNA של המוצר, בהתאמה.

מדידת מצב יציב, טרום מצב יציב, וחד מחזור קינטי לפעילות ה-DNA Glycosylase

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבוע את קצבי החיתוך של eight OXO Guine ושחרור התוצרים עבור DNA glycosylate מסוג human eight OXO Guine, באמצעות טכניקות קינטיות מהירות. דבר זה מושג תחילה על ידי מדידת מהלך זמן במצב יציב בריכוז אנזים נמוך, כדי לקבוע אם מתרחשת פאזה מהירה במהלך המחזור הראשון (turnover). אם המחזור הראשון הוא מהיר, מהלך הזמן במצב יציב אינו מועמד לחיזוי (extrapolate) לאפס, אלא משקף את ריכוז האנזים הפעיל כשלב שני.ניתן למדוד את קצב היווצרות המוצר במהלך מצב קדם-יציב (pre steady state) באמצעות טכניקות של ערבוב וכיבוי מהירים עם ריכוז אנזים גבוה יותר, כדי להבחין בכמות משמעותית של מוצר במהלך המחזור הראשון. לאחר מכן, ניתן לנטר את השלב הכימי גם בתנאי מחזור בודד (single turnover), שבהם התסבסב רווי באנזים. כדי לבודד את האירועים באתר הפעיל של האנזים ללא מחזוריות קטליטית, התוצאות מראות כי שחרור המוצר מהאנזים הוא השלב המגביל את הקצב במהלך המצב היציב, בהתבסס על התצפית לפיה מהלך הזמן אינו מביא להשחאה של אפס מוצר בזמן אפס.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום תיקון קצות ה-DNA. אלה כוללות את השפעת מבנה ה-DNA, תפקידם של שאריות באתר הפעיל, השפעתם של יוני מתכת וחלבונים עזרי-תא על הכימיה ועל שחרור התוצר. ראשית, הכין את תשת ה-DNA דו-גדילי המכילה שמונה OXO G על ידי ערבוב של אוליגונוקלאוטיד מסומן ב-fam באורך חמישה פריימים עם הגדיל המשלים לו ביחס מולרי של 1 ל-1.2 בבופר annealing בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter.הנח את המבחנה בתוך צף במים רותחים למשך חמש דקות. השאר את המים להתקרר באיטיות לטמפרטורת החדר לפני הוצאת המבחנה מהצף. הכן את תמיסות תשת ה-DNA וה-OG G1 בנפרד בתוך באפר תגובה במבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר על קרח.שימו לב כי ריכוז ה-DNA הוא 400 nanomolar והריכוז הנראה של Ogg1 הוא 30, 60, 90 או 120 nanomolar, כפי שנקבע באמצעות בדיקת חלבון בשיטת Bradford. לאחר הוצאת מבחנות התגובה מהקרח, בצעו דגירה מוקדמת של כל תמיסה על ידי הנחת המבחנה בבלוק חימום המכוון ל-37 °C למשך דקה אחת. לאחר מכן, התחילו את התגובה על ידי ערבוב נפחים שווים של תמיסת מצע ה-DNA ותמיסות ה-Ogg1, כדי להגיע לריכוזים סופיים של 200 nanomolar DNA ו-15, 30, 45 או 60 nanomolar Ogg1. הסירו מנות של 10 µL במרווחי הזמן המפורטים ועצרו את התגובה על ידי ערבוב עם 1 µL של sodium hydroxide בריכוז 1 molar כביקורת עבור מסלולי הזמן.ערבבו 10 µL מתערובת התגובה ללא האנזים עם 1 µL של נתרן הידרוקסיד בריכוז 1 M. הניחו את דגימות התגובה בבלוק חימום בטמפרטורה של 90 °C למשך חמש דקות כדי לבצע שבירה של אתר ה-AP במוצר שהתקבל. לאחר החימום, הוסיפו 1 µL של חומצה כלורית בריכוז 1 M כדי לנטרל כל דגימה.לאחר מכן, הוסף 12 µL של בופר טעינה לג'ל לכל דגימה של תגובה, ולאחר מכן הנח את התערובת בבלוק חימום המכוון ל-95 °C. לאחר שתי דקות, הוצא את המבחנה מבלוק החימום והנח אותה על קרח. טען 5 µL מכל דגימה על ג'ל פוליאקרילאמיד דנטורנטי בריכוז 15%.לאחר הרצת הג'ל, סרקו אותו באמצעות מכשיר הדמיה המסוגל לזהות את ה-DNA המסומן פלואורסצנטית ולהציג את פסי התשתית (substrate) והתוצר. לאחר הדמיית הג'ל, ביצעו כימות של הפסים; אם נצפתה פיצול רקע (background cleavage) לאחר טיפול בתשתית באמצעות sodium hydroxide, הפחיתו רקע זה מהכמות שנמדדה עבור כל תוצר תגובה. לאחר מכן, שרטטו את כמות התוצר שנוצרה בכל נקודת זמן של התגובה.נתחו את הנתונים הגולמיים באמצעות המשוואה הבאה כדי לקבוע את נקודת השבירה (knot), את אמפליטודת הפריצה (burst) ואת VSS, שיפוע של פאזת המצב היציב הליניארית. שרטטו את נקודת החיתוך עם ציר ה-Y ביחס לריכוז החלבון הכולל, כדי לספק מדד לחלק הפעיל של האנזים. השתמשו בהתאמה ליניארית עם נקודת חיתוך באפס כדי לספק את מקדם התיקון לקביעת חלקו של האנזים הפעיל.לאחר מכן, שרטט את המצב היציב ביחס לריכוז האנזים הפעיל, תוך מתן קבוע קצב הקישור של המוצר בשני מבחנות מיקרו-צנטריפוגה נפרדות של 1.5 מיליליטר. הכן תמיסות של 400 nanomolar DNA substrate ו-80 nanomolar active ogg one בבופר תגובה כפי שתואר קודם לכן. חבר אמבט מים עם סירקולציה למכשיר ה-rapid quench flow והגדר את הטמפרטורה ל-37 °C.לאחר מכן, כוון את פרמטרי המכשיר ובחר את לולאת התגובה המתאימה לנקודות הזמן הרצויות. בהתאם להוראות היצרן, הכן את בופר התגובה ו-142 תמיסות כיבוי של sodium hydroxide, במזרקים חד-פעמיים מסוג lure lock בנפח 10 milliliter.חברו מזרק עם נתרן הידרוקסיד לפתחי ההנעה והעבירו את השסתומים למצב טעינה. טענו את מאגרי ההנעה בנתרן הידרוקסיד במזרק Q כדי להוציא את בועות האוויר מהמזרק. דחפו ומשכו את התמיסה הלוך וחזור מספר פעמים.בשלב הבא, חברו מזרקים עם תמיסת ריאקציה (reaction buffer) לפתחי ההנעה ומלאו את המזרקים בתמיסה. בדומה לכך, כאשר כל השסתומים נמצאים במצב הפעלה (fire position), הורידו את מנוע הצעדים עד שייגע בחלקן העליון של המזרקים. כאשר שסתומי טעינת הדגימה נמצאים במצב שטיפה (flush position), שטפו את לולאות הדגימה, לולאת הריאקציה וקו היציאה באמצעות מים ומתנול.לאחר מכן, ייבשו את הלולאות ואת קו היציאה לחלוטין על ידי שטיפה באוויר. צרו חור בחלקו העליון של מבחנה עם פקק בנפח 1.5 milliliter. באמצעות מחט בכילור (gauge) 16, חברו את המבחנה לקו היציאה באמצעות צינורית כדי לאסוף את התגובה המעוכבת.בשלב הבא, הגדירו את זמן התגובה הרצוי בשניות באמצעות לוח המקשים. לאחר נסיגת מנוע הפסעות (stepper motor), מקמו את הבוכנות של מזרק B אל מול פלטפורמת מנוע הפסעות על ידי הוספת בופר באמצעות המזרקים החד-פעמיים המחוברים לפתחי ההנעה.מלאו מזרקים חד-פעמיים של 1 mL עם lure lock בתמיסת תשתית ה-DNA ובתמיסות ogg one בהתאמה. כאשר שסתומי הדגימה נמצאים בעמדת הטענה (load), חברו את המזרקים עם תשתית ה-DNA ותמיסות ה-ogg one לכל אחד מפתחי טעינת הדגימות, ולאחר מכן מלאו את לולאות הדגימה בתמיסות. העבירו את כל שסתומי טעינת המזרקים ושסתומי טעינת הדגימות לעמדת הפעלה (fire). התחילו את התגובה על ידי לחיצה על מקש G.לאחר לחיצה על מקש G, מנוע פסע דוחף את החלק העליון של המזרקים כדי להתחיל ולעצור את התגובה. לאחר ש-36 µL של תערובת התגובה נעצרו באופן אוטומטי עם 86 µL של Sodium hydroxide בריכוז 142 mM, יש לאסוף את הדגימה מקו היציאה.עם השלמת התגובה, העבירו את שסתומי טעינת המזרק למצב טעינה (load) ואת שסתומי טעינת הדגימה למצב שטיפה (flush). שטפו את לולאות הדגימה, לולאת התגובה ואת קו היציאה במים ובמתנול, ויבשו את האזורים שנשטפו לחלוטין. חזרו על השלבים הקודמים עבור כל נקודת זמן.לקביעת תיקון רקע. בצע ניסוי ביקורת ללא אנזים באמצעות מכשיר ה-rapid quench. מלא את לולאת דגימת ה-DNA בתשת DNA, אך השאר את לולאת דגימת ה-ogg ריקה.קבע את זמן התגובה. בצע את הערבוב והעצירה (quench) תחת אותם תנאים כפי שבוצעו קודם לכן. שטוף את לולאות הדגימה בנתרן הידרוקסיד 2 molar, חומצה כלורית 2 molar במים ובמתנול, ולאחר מכן ייבש את הקווים שנשטפו.לאחר הגדרת מנוע הפסעות (stepper motor) למצב הבית (home), העבירו את שסתומי טעינת המזרק למצב טעינה ושטפו את מיכלי ההנעה במים. לאחר חימום דגימות התגובה שהוקפאו (quenched), הפרידו בין ה-DNA של התסבסט לבין ה-DNA של התוצר באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד דנטורטיבי בריכוז 15%. לאחר מכן, בצעו ויזואליזציה וכימות של הפסים על הג'ל כפי שמתואר.בעבר בוצע התאמה של מסלולי הזמן של היווצרות המוצר באמצעות ניתוח רגרסיה לא-ליניארית למשוואה הבאה, הכוללת איברים אקספוננציאליים עולים וליניאריים, המספקים את קבוע הקצב מסדר ראשון K שנצפה, את אמפליטודת ה-burst, נקודת קשר (knot) וקצב ליניארי VSS. עבור ניסוי מסלול הזמן של מחזור בודד (single turnover), הכין תמיסות של 100 nanomolar של סובסטרט DNA ו-500 nanomolar של ogg1 פעיל במבחנות נפרדות של 1.5 milliliter.תוך שימוש בתנאים שתוארו קודם לכן, הכינו את מכשיר ה-rapid quench flow ובצעו את התגובה באופן דומה לניסוי של מהלך הזמן במצב קדם-יציב (pre steady state). לאחר שדגימות ה-quench חוממו והופרדו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד, הדמיזו וכמתו את הפסים על הג'ל כפי שתואר קודם לכן. לבסוף, התאימו את מהלכי הזמן של היווצרות המוצר לאקספוננט יחיד כדי לקבוע את קבוע הקצב מסדר ראשון, כפי שמופיע במשוואה הבאה.ניתוח קינטיקה במצב יציב בוצע באמצעות 200 nanomolar של תסבסב DNA וארבעה ריכוזים שונים של ogg. הריכוז נקבע באמצעות בדיקת חלבון בשיטת Bradford. התוצר השבוי והתסבסב השבוי הופרדו באמצעות אלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילאמיד.מהלכי הזמן של היווצרות המוצר הותאמו למשוואה ליניארית כדי לקבוע את נקודת החיתוך עם ציר ה-y, שהיו 2.2 1115 ו-26 nanomolar בהתאמה ביחס לכל ריכוז חלבון; נקודות החיתוך עם ציר ה-Y שורטטו בהמשך ביחס לכל ריכוז חלבון בפועל. חלק האנזים הפעיל נקבע כ-38% משיפוע הקו לקביעת קצב המצב היציב. ערכי VSS שנקבעו קודם לכן שורטטו ביחס לנקודות החיתוך עם ציר ה-Y.שיפוע הקו היה 0.0028 לשנייה, ערך השקול לקבוע קצב הדיסוציאציה של התוצר הנוצר מפעילות של DNA Glycosylate liaise. מהלך זמן של מצב קדם-יציב (pre steady state) נבחן תוך שימוש ב-200 nano molar של תסבסב DNA ו-40 nano molar של OG one פעיל. ניתן להתאים את מהלכי הזמן של היווצרות התוצר למשוואה הכוללת איברים אקספוננציאליים עולים ואיברים ליניאריים.Kobs ו-koff נקבעו כ-0.75 ו-0.0055 לשנייה, בהתאמה. תחת תנאי מחזור בודד (single turnover), תגובת החיתוך של Oxo g הסתיימה תוך שש שניות. מהלך הזמן של היווצרות התוצר הותאם למשוואה מעריכית בודדת והניב Kobs של 0.74 לשנייה.לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לבודד את השלבים המרכזיים במהלך מחזור קטליטי ולמדוד את קצבי התגובות הכימיות ומספר התחלופויות האנזימים.

steady-state-pre-steady-state-single-turnover-kinetic-measurement-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

אנו מתארים שיטה התבוננות שכפול בזמן אמת של מולקולות דנ"א בודדות מתווכת על ידי חלבונים של מערכת שכפול bacteriophage.

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

Msh2-MSH6 אחראית ליזום תיקון של טעויות שכפול ה-DNA. כאן אנו מציגים גישה קינטיקה חולף לקראת הבנה איך זה עובד חלבון קריטי. הדו"ח ממחיש הפסיקה זרימת ניסויים למדידת מחייב DNA מצמידים ו קינטיקה ATPase הבסיסית Msh2-MSH6 מנגנון הפעולה של תיקון דנ"א.

יישום הופסק זרימה שיטות קינטיקס לחקור את מנגנון הפעולה של חלבון תיקון DNA

Kinesins מתאפיין באינטראקצית נוקלאוטיד תלוי עם microtubules: מחזור של מחזור ATP מצמידים את מעגל האינטראקציה microtubule. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לנתח את קינטיקה של מעברי נוקלאוטיד בודדים במחזור מחזור ATP של kinesin באמצעות נוקלאוטידים שכותרתו fluorescently והפסיקה זרימת הקרינה.

שימוש בנוקלאוטידים פסיקת זרימת הקרינה ותווית לניתוח מחזור מחזור ATP של Kinesins

אנו מתארים מבחנים לא רציפים רגישים מבוססי ג'ל כדי לבחון את הקינטיקה של התחלת גדיל מפגר באמצעות חלבוני השכפול של בקטריופאג' T7.

קינטיקה של סינתזת DNA מפגר גדיל<em&gt; במבחנה</em&gt; על ידי חלבונים שכפול bacteriophage T7

פרוטוקול זה מתאר את האפיון של ה-DNA פולימראז סינתזה של דנ א שונה דרך התבוננות שינויים-סגול fluorescently שכותרתו הדנ א באמצעות אלקטרופורזה בג'ל ג'ל הדמיה. ג'לים אקרילאמיד משמשים עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של ההפרדה של חומצות גרעין קצר, אשר נודדים בקצב שונה בהתאם לגודל.

DNA פולימראז פעילות Assay באמצעות DNA שכותרתו פלורסנט-סגול, דמיינו ידי אקרילאמיד אלקטרופורזה בג'ל

שיטה מקבילה מאוד למדידת המחשוף הספציפי לאתר של ה-DNA ברמת מולקולה אחת מתוארת. פרוטוקול זה מדגים את הטכניקה באמצעות ההגבלה אנדונוקלאז Nde. ניתן לשנות את השיטה בקלות כדי ללמוד כל תהליך שתוצאות מחשוף DNA ספציפי לאתר.

תפוקה גבוהה מקבילה מולקולה קינטית Assay עבור מחשוף DNA ספציפי לאתר

באמצעות DNA המסומן בנקודות קוונטיות ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת, אנו יכולים לחקור את מנגנון התגובה של אנדונוקלאזות הגבלה תוך שימוש בחלבון ללא תווית. טכניקה זו של מולקולה בודדת מאפשרת תצפית מאסיבית מרובבת של אינטראקציות חלבון-דנ"א בודדות, וניתן לאסוף נתונים כדי ליצור התפלגות זמן מגורים מאוכלסת היטב.

ניתוח זמן שהייה של מולקולה בודדת של מחשוף DNA בתיווך אנדונוקלאז הגבלה

מתיל-טרנספראזות דנ"א הן מטרות פוטנציאליות לתרופות לסרטן. כאן מוצג פרוטוקול להערכת מולקולות קטנות לעיכוב מתיל-טרנספראז של DNA. בדיקה זו משתמשת באנדונוקלאז למתילציה זוגית של דנ"א ליצירת פלואורסצנציה ומאפשרת לנטר את פעילות האנזים בזמן אמת.

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

כאן מוצג פרוטוקול לבדיקת אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין, תוך שימוש בדוגמאות של אנזימי ליגאז, נוקלאז ופולימראז. הבדיקה משתמשת באוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית ולא מסומנים שניתן לשלב ליצירת דופלקסים המחקים נזקי RNA ו/או DNA או מתווכי מסלול, ומאפשרים אפיון התנהגות אנזימים.

שימוש באוליגונוקלאוטידים סינתטיים שעברו שינוי כדי להעריך אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין

פרוטוקול זה מדגים ביצוע בדיקת מולקולה בודדת להדמיה חיה של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG. הוא מתאר (1) הכנת מצע דנ"א, (2) טיהור פלואורסצנטי המסומן כמנחת מסוקים Drosophila melanogaster CMG, (3) הכנת תא זרימה מיקרופלואידי למיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), ו-(4) בדיקת שחרור DNA של מולקולה יחידה.

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

פרוטוקול זה מתאר בדיקת שכפול DNA חד-מולקולה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרת הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות בין פולימראזות DNA ומכשולים כגון מבני G-quadruplex.

הדמיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת של דינמיקת DNA פולימראז ב-G-quadruplexes

חקור את קינטיקת האנזים של DNA glycosylase באמצעות טכניקות קינטיות מהירות. למדו למדוד מצב יציב, טרום מצב יציב ותורנות בודדת לפעילות תיקון ה-DNA.

מדידת מצב יציב, טרום מצב יציב, וחד מחזור קינטי לפעילות ה-DNA Glycosylase

גלה סרטונים נוספים