Name: Assay exonuclease הקרינה מבוסס לאפיין DmWRNexo, Orthologue של האדם Progeroid WRN exonuclease, ויישומו nucleases אחר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: למדו שיטת סיוע פלואורסצנטית לבדיקת פעילות אקסונוקלאז ב-DmWRNexo, האורתולוג של WRN האנושי. השיטה מאפשרת ניתוח תנאי ריאקציה וספציפיות למצעים בצורה בטוחה וחוזרת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לתוכנית הדינמיקה החדשה של ההזדקנות על מימון עבודה זו [ES/G037086/1] ולפרופ' דייב שראט (המחלקה לביוכימיה, אוניברסיטת אוקספורד) על הגישה לפוג'י FLA-3000.

<ol><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%22%5BJournal%5D)">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr. 34, 1317-1340 (2012).</li>
<li>Payne, M., Hickson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+instability+and+cancer%3A+lessons+from+analysis+of+Bloom%27s+syndrome%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Genomic instability and cancer: lessons from analysis of Bloom's syndrome).</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 553-559 (2009).</li>
<li>Yu, C. E., Oshima, J., Fu, Y. H., Wijsman, E. M., Hisama, F., Alisch, R., Matthews, S., Nakura, J., Miki, T., Ouais, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+of+the+Werner%27s+syndrome+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Positional cloning of the Werner's syndrome gene.</a> Science. 272, 258-262 (1996).</li>
<li>Huang, S., Li, B., Gray, M. D., Oshima, J., Mian, I. S., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+premature+ageing+syndrome+protein%2C+WRN%2C+is+a+3%27--%3E5%27+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The premature ageing syndrome protein, WRN, is a 3'-->5' exonuclease.</a> Nat. Genet. 20, 114-116 (1998).</li>
<li>Goto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndrome-causing+mutations+in+Werner+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Trends%22%5BJournal%5D)">Syndrome-causing mutations in Werner syndrome.</a> Biosci. Trends. 2, 147-150 (2008).</li>
<li>Perry, J. J., Yannone, S. M., Holden, L. G., Hitomi, C., Asaithamby, A., Han, S., Cooper, P. K., Chen, D. J., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+exonuclease+structure+and+molecular+mechanism+imply+an+editing+role+in+DNA+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">WRN exonuclease structure and molecular mechanism imply an editing role in DNA end processing.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 414-422 (2006).</li>
<li>Opresko, P. L., Laine, J. P., Brosh, R. M., Seidman, M. M., Bohr, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+action+of+the+helicase+and+3%27+to+5%27+exonuclease+of+Werner+syndrome+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coordinate action of the helicase and 3' to 5' exonuclease of Werner syndrome protein.</a> J. Biol. Chem. 276, 44677-44687 (2001).</li>
<li>Plchova, H., Hartung, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+an+exonuclease+from+Arabidopsis+thaliana+reveals+similarities+to+the+DNA+exonuclease+of+the+human+Werner+syndrome+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of an exonuclease from Arabidopsis thaliana reveals similarities to the DNA exonuclease of the human Werner syndrome protein.</a> J. Biol. Chem. 278, 44128-44138 (2003).</li>
<li>Hartung, F., Plchova, H., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterisation+of+RecQ+homologues+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular characterisation of RecQ homologues in Arabidopsis thaliana.</a> Nucleic Acids Res. 28, 4275-4282 (2000).</li>
<li>Saunders, R. D., Boubriak, I., Clancy, D. J., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+Drosophila+ortholog+of+WRN+exonuclease+that+is+required+to+maintain+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a Drosophila ortholog of WRN exonuclease that is required to maintain genome integrity.</a> Aging Cell. 7, 418-425 (2008).</li>
<li>Cox, L. S., Boubriak, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Instability+in+Premature+Aging%2C+in+DNA+Damage+Repair%2C+Repair+Mechanisms+and+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Thomas%2C+A.E.%2C+Eds.+Nova+Science+Publishers%22%5BJournal%5D)">DNA Instability in Premature Aging, in DNA Damage Repair, Repair Mechanisms and Aging.</a> Thomas, A.E., Eds. Nova Science Publishers. , 1-34 (2010).</li>
<li>Cox, L. S., Clancy, D. J., Boubriak, I., Saunders, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Werner+Syndrome+in+Drosophila+melanogaster%3A+hyper-recombination+in+flies+lacking+WRN-like+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling Werner Syndrome in Drosophila melanogaster: hyper-recombination in flies lacking WRN-like exonuclease.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1119, 274-288 (2007).</li>
<li>Boubriak, I., Mason, P. A., Clancy, D. J., Dockray, J., Saunders, R. D., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DmWRNexo+is+a+3%27-5%27+exonuclease%3A+phenotypic+and+biochemical+characterization+of+mutants+of+the+Drosophila+orthologue+of+human+WRN+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">DmWRNexo is a 3'-5' exonuclease: phenotypic and biochemical characterization of mutants of the Drosophila orthologue of human WRN exonuclease.</a> Biogerontology. 10, 267-277 (2009).</li>
<li>Mason, P. A., Boubriak, I., Robbins, T., Lasala, R., Saunders, R., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+orthologue+of+progeroid+human+WRN+exonuclease%2C+DmWRNexo%2C+cleaves+replication+substrates+but+is+inhibited+by+uracil+or+abasic+sites+%3A+Analysis+of+DmWRNexo+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">The Drosophila orthologue of progeroid human WRN exonuclease, DmWRNexo, cleaves replication substrates but is inhibited by uracil or abasic sites : Analysis of DmWRNexo activity in vitro.</a> Age (Dordr). , (2012).</li>
<li>Machwe, A., Xiao, L., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Length-dependent+degradation+of+single-stranded+3%27+ends+by+the+Werner+syndrome+protein+%28WRN%29%3A+implications+for+spatial+orientation+and+coordinated+3%27+to+5%27+movement+of+its+ATPase%2Fhelicase+and+exonuclease+domains%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Length-dependent degradation of single-stranded 3' ends by the Werner syndrome protein (WRN): implications for spatial orientation and coordinated 3' to 5' movement of its ATPase/helicase and exonuclease domains.</a> BMC Mol. Biol. 7, 6 (2006).</li>
<li>Mangerich, A., Veith, S., Popp, O., Fahrer, J., Martello, R., Bohr, V. A., Burkle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+WRN+exonuclease+activity+by+isotope+dilution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of WRN exonuclease activity by isotope dilution mass spectrometry.</a> Mech. Ageing Dev. 133, 575-579 (2012).</li>
<li>Xue, Y., Ratcliff, G. C., Wang, H., Davis-Searles, P. R., Gray, M. D., Erie, D. A., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+exonuclease+domain+of+WRN+forms+a+hexamer+on+DNA+and+possesses+both+3%27-+5%27+exonuclease+and+5%27-protruding+strand+endonuclease+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A minimal exonuclease domain of WRN forms a hexamer on DNA and possesses both 3'- 5' exonuclease and 5'-protruding strand endonuclease activities.</a> Biochemistry. 41, 2901-2912 (2002).</li>
<li>Machwe, A., Ganunis, R., Bohr, V. A., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockage+of+the+3%27--%3E5%27+exonuclease+activity+of+WRN+protein+by+certain+oxidative+modifications+and+bulky+lesions+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selective blockage of the 3'-->5' exonuclease activity of WRN protein by certain oxidative modifications and bulky lesions in DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28, 2762-2770 (2000).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

קביעת פעילות אקסונוקלאז של חלבונים מטוהרים מחייבת ניתוח של תוצרי מחשוף DNA. ניתן לדמיין מחשוף רציף של DNA על ידי אקסונוקלאזים על ידי הפרדה של מוצרי מחשוף מסומנים על ג'ל אקרילאמיד. מבחינה היסטורית זה היה כרוך בתיוג קצה של מצע ה-DNA עם תווית רדיו (למשל 32P או 35S), אך עם החסרונות הגלומים בשימוש בתווית רדיו (עלות, בעיות בטיחות וחוסר יציבות לאורך זמן). כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו בדיקת אקסונוקלאז המשתמשת במצעי DNA עם תווית פלואורסצנטית, ומראים את התועלת של מערכת הבדיקה בקביעת פעילות הנוקלאז...

נוקלאזות ממלאות תפקיד חיוני בתאים בהסרת DNA פגום, פתרון מבנים לא-דופלקסיים כגון צומתי הולידיי ומתן יכולת קריאת הגהה במהלך שכפול ה-DNA, הן מהותי בתוך DNA פולימראז והן חיצוני להם1. נוקלאזות יכולות לפעול על ידי פירוק רציף של DNA מקצוות חופשיים (אקסונוקלאזים) או על ידי פיצול קשרי פוספודיאסטר פנימיים בתוך מולקולת DNA ארוכה יותר (אנדונוקלאזות). אובדן פעילות נוקלאז יכול לגרום לפנוטיפים ספציפיים ביותר של חוסר יציבות גנום. בעוד שמוטציה של בן משפחת הליקאז RecQ BLM גורמת לשיעורים גבוהים מדי של חילופי כרומטידים אחות ושיעורי סרטן גבוהים בעולם (נבדק על ידי פיין והיקסון2), מוטציה של חלבון WRN הקשור מאוד מובילה להזדקנות מוקדמת3; ההבדל המשמעותי העיקרי בין שני בני המשפחה הללו הוא הנוכחות של תחום אקסונוקלאז 3'-5' עם WRN4. עדויות לתפקיד קריטי של האקסונוקלאז WRN בשמירה על יציבות הגנום הצטברו מניתוח גנוטיפים בחולי WS5, יחד עם מחקרי מוטציה נקודתית ומחיקה בתאים אנושיים, המגובים במחקרים קריסטלוגרפיים של תחום האקסונוקלאז המבודד6. עם זאת, שיתוף פעולה ודיבור צולב בין פעילות האקסונוקלאז של WRN לבין פעילות ההליקאז המרכזית שלו7 מקשה על הפרדת הפונקציונליות של כל אחד מהם ותרומתם היחסית ליציבות הגנום. בצמחים ובבעלי חיים מטזואים נמוכים יותר, פעילות אקסונוקלאז WRN קיימת על פוליפפטיד יחיד חסר פעילות הליקאז8-10 (נסקר בקוקס ובובריאק11); הוכח ביוכימית ב-Arabidopsis כי אקסונוקלאז זה פועל בתיאום עם הליקאז WRN הקוגנטי, ולמעשה משחזר את פעילויות האנזים המשולבות שנצפו ב-WRN9 של בעלי חוליות. חקרנו אקסונוקלאז WRN בדרוזופילה מכיוון שהכלים הגנטיים המצוינים מאפשרים ניתוח של ההשפעה של מוטציה אקסונוקלאז (מבלי להשפיע על ההליקאז הקוגנטי המשוער) ברמת האורגניזם השלם ובמהלך ההתפתחות10,12. יתר על כן, שיבטנו, ביטאנו וטהרנו אקסונוקלאז רקומביננטי של Drosophila WRN (DmWRNexo) המאפשר ניתוח ביוכימי מלא של תכונות האנזים שלו13,14.
ניתוח נוקלאז במבחנה נערך באופן מסורתי באמצעות אוליגונוקלאוטידים עם תווית רדיו, הערכת פירוק על ידי חיפוש סולם של מוצרים על ג'ל אקרילאמיד4,8,15. למרות שהן רגישות, בדיקות כאלה אינן ניתנות לשחזור כמותי מדי יום בגלל דעיכה רדיואקטיבית של המצעים המסומנים. בנוסף, טיפול וסילוק ריאגנטים רדיואקטיביים מהווים בעיות סביבתיות ובריאותיות משמעותיות; גם המקור של רדיו לייבל הופך לבעייתי יותר ויותר. שיטה חלופית עדכנית מעריכה את כמות תוצר הפירוק הסופי על ידי ספקטרומטריית מסה16. עם זאת, זה גוזל זמן (לוקח מספר ימים), דורש ציוד מיוחד, והקריאה היא כמות התוצר הסופי (נוקלאוטיד בודד) ולכן אינו מתאים למדידה רגישה של היבטים כגון עיבוד אנזים או לקביעה אם נוקלאוטידים, רצפים או שינויים מסוימים מובילים להפסקה או עצירה של נוקלאז. כדי להתגבר על בעיות אלה, התאמנו את הבדיקות המסורתיות מבוססות הג'ל לשימוש עם מצעי אוליגונוקלאוטידים פלואורסצנטיים, ויצרנו מצעים מסומנים ביציבות שניתן להשתמש בהם באופן שחזורי לאורך תקופות זמן ארוכות ובכך לאפשר השוואה ישירה של פעילויות נוקלאז בתנאים שונים.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr>Custom <tr><td>oligonucleotides</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>יש צורך להשיג אותם בטוהר גבוה למשל עם טיהור PAGE.</td></tr><tr><td></td><td></td><td>5'FLO</td><td>fluoresescein-5' GAACTATGGCTCTC GAGTGCTAGGACATGTCTGA CTACGTACAAGTCACC - 3'bubble</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>5'- GGTGACTTGTACGT AGTCAGACATGTCCTAGCAC TCGAGAGCCATAGTTC-3'40</td></tr><tr><td>% 19:1 תמיסת אקרילאמיד</td><td>Severn Biotech</td><td>20-2400-05</td><td>זהירות: נוירוטוקסין חזק ולכן יש ללבוש כפפות בכל עת</td></tr><tr><td>עמודות His-Trap (1 מ"ל)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>כל שאר הריאגנטים</td><td>כל ספק</td><td></td> מכובד <td>דרגת ביולוגיה מולקולרית נחוצה (ללא DNase); צינורות מיקרופוגה באופן דומה צריכים להיות נטולי DNase ו-RNase<</td></tr>td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק>Hoefer SE400 מכשיר ג'ל Hoefer SE400-15-1.5 FLA-3000 (זרחן ופלואורסצנטי <tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> imager)</td><td>קורא תמונות Fuji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V2.02</td><td>FujiFilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מד תמונה V3.3</td><td>FujiFilm</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assay exonuclease הקרינה מבוסס לאפיין dmwrnexo, orthologue של האדם progeroid wrn exonuclease, ויישומו nucleases אחר

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

WRN exonuclease מעורב בפתרון נזק ל-DNA המתרחש במהלך שכפול DNA או בעקבות חשיפה לגנוטוקסינים אנדוגניים או אקסוגניים. סביר להניח שהוא ישחק תפקיד במניעת הצטברות של תוצרי ביניים רקומבינוגניים שאחרת היו מצטברים במזלגות שכפול שנתקעו באופן חולף, בהתאם לפנוטיפ היפר-רקומביננטי של תאים חסרי WRN. בבני אדם, תחום האקסונוקלאז מורכב מחלק N-terminal של חלבון גדול בהרבה שיש לו גם פעילות הליקאז, יחד עם אתרים נוספים החשובים לאינטראקציה של DNA וחלבון. לעומת זאת, בדרוזופילה, פעילות האקסונוקלאז של WRN (DmWRNexo) מקודדת על ידי לוקוס גנטי מובהק מההליקאז המשוער, המאפשר דיסקציה ביוכימית (וגנטית) של תפקיד פעילות האקסונוקלאז במנגנוני יציבות הגנום. כאן, אנו מדגימים שיטה פלואורסצנטית לקביעת פעילות אקסונוקלאז WRN באמצעות DmWRNexo רקומביננטי מטוהר ואוליגונוקלאוטידים פלואורסצנטיים עם תווית קצה. מערכת זו מאפשרת יכולת שחזור גדולה יותר מאשר בדיקות רדיואקטיביות מכיוון שהאוליגונוקלאוטידים של הסובסטרט נשארים יציבים במשך חודשים, ומספקת שיטה בטוחה ומהירה יחסית לניתוח מפורט של פעילות נוקלאז, המאפשרת קביעת קוטביות נוקלאז, תהליכיות והעדפות מצע.

ביצוע ניתוח in vitro של פעילות אקסונוקליאז דורש מספר שלבי הכנה בנוסף לניתוח עצמו. סקירה כללית של הפרוצדורות מוצגת ב-איור 1.
לפני ביצוע בדיקות אקסונוקלאז המבוססות על פלואורסצנציה, קריטי לבצע אופטימיזציה של זיהוי תת-המצע (substrate) האוליגונוקלאוטידי המסומן פלואורסצנטית לאחר הפרדה על ג'לי urea-acrylamide באמצעות מערכת דימוי פלואורסצנטית מתאימה. בחירת המסנן חשובה ביותר, שכן לה יש השפעה ניכרת על הרגישות של הבדיקה הכוללת - תת-המצע האוליגונוקלאוטידי שלנו מסומן ב-fluorescein...

Exonucleases ממלאים תפקידים קריטיים בהבטחת יציבות הגנום. אובדן תפקוד האקסונוקלאז של WRN גורם להזדקנות מוקדמת. חקר מצעים ודרישות אחרות של הנוקלאז במבחנה יכול לעזור להבהיר את תפקידו in vivo. כאן אנו מדגימים בדיקה מבוססת פלואורסצנטית מהירה וניתנת לשחזור כדי למדוד את פעילות הנוקלאז שלו.

Assay exonuclease הקרינה מבוסס לאפיין DmWRNexo, Orthologue של האדם Progeroid WRN exonuclease, ויישומו nucleases אחר

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. ...

ניסוי זה משתמש בבדיקה פלואורסצנטית חזקה וניתנת לשחזור כדי לקבוע פעילות אקסונוקליאז. דגרו את האנזים המופק עם תסבך ה-DNA הפלואורסצנטי כדי לאפשר לאנזים לפרק את ה-DNA באופן סדרתי. לאחר מכן, בצעו הפרדה של ה-DNA על ג'ל אקרילמיד-אוריאה כדי להפריד את תוצרי הפירוק לפי גודלם.בשלב הבא, השתמשו בדימות פלואורסצנציה כדי לזהות ולכמת את היקף הפעילות של האקסונוקלאז. התוצאות המנותחות יכולות לקבוע את תנאי התגובה המועדפים של הסובסטרט, וכן את הפעילות הפרוססיבית והכללית של האנזים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות המבוססות על רדיואקטיביות הוא שסובסטרט ה-DNA יציב לאורך זמן, מה שמאפשר הדירות מצוינת, הפחתת עלויות והגברת הבטיחות.ראשית, התאימו את הליזט הבקטריאלי לריכוז של 20 millimolar ole, באמצעות נפח מתאים של תמיסת סטוק של emit ole בריכוז שני מולארי. לאחר מכן, התאימו את הנפח ללפחות מילליטר אחד באמצעות 20 millimolar ole wash. שטפו עמודת hist trap של מילליטר אחד עם 10 milliliters של milli Q water. לאחר מכן, השריו את העמודה עם 10 milliliters של 20 millimolar ole.בשלב הבא, העמיסו את הליסאט על העמודה. בעת העמסתו של הליסאט על העמודה, עשוי להיווצר לחץ נגדי משמעותי. זהו מצב תקין לחלוטין. אין להפעיל כוח רב מדי על המזרק ויש לשמור על לחץ קבוע ואחיד.שכיח להבחין בשינוי צבע קל כאשר הליזאט נכנס לעמודה. אספו את השבירה (flow through) לבקבוק ביו (biju) סטרילי בנפח שבעה מיליליטר ואחסנו על קרח. לאחר מכן, שטפו את העמודה עם 10 מיליליטר של 20 מילימולארי emit ole.כעת העבירו חמישה מיליליטר של iole בריכוז 40 millimolar דרך העמודה. עקבו בקפידה אחר בוכנת המזרק כדי למדוד את מקטעי הנפח של מיליליטר אחד הנאספים לתוך כל אחת מבחולות המיקרו-צנטריפוגה. באופן דומה ובסדר עוקב, העבירו חמישה מיליליטר של כל ריכוז של iole ואספו חמישה מקטעים של מיליליטר אחד בכל פעם.בצעו בדיקה של הפראקציות באמצעות dot blotting וסריקה עם נוגדן anti-hiss המשורשר ל-HRP, כדי לזהות את הפראקציות בשיא. שמרו את כל הרגיאנטים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס; חלקו את תערובת המאסטר (master mix) למבחנות מיקרוצנטריפוגה סטריליות בנפח 0.5 מיליליטר הנטולות DNA. כללו גם בקרת "ללא אנזים" כדי להדגים את התסביך (substrate) הראשוני.כעת הגדירו בלוק חימום לטמפרטורה המתאימה לפעילות האנזים. הכינו IDE המכיל תמיסת עצירה ושמרו אותו בטמפרטורת החדר. ארגנו את מרחב העבודה בקרבת בלוק החימום, כולל את הריאגנטים הסופיים שיוספו לתגובה.הכינו פ pipette של 1 עד 10 microliter עם טיפים, טיימר, מעמד קירור (cryo rack) או דלי קרח, ותמיסת עצירה. הפעילו את הטיימר עם הוספת האנזים למבחנה הראשונה והניחו את המבחנה בבלוק חימום. המשיכו להוסיף אנזים לשאר המבחנות במרווחים של 15 שניות, והניחו את המבחנות בבלוק החימום כאשר הטיימר מגיע לזמן הנכון.הוסף 10 µL של תמיסת עצירה לדגימה הראשונה וערבב באמצעות פיפוט. העבר מיד לקרח. המשך לעצור את התגובות במרווחי הזמן המתאימים ובאותו סדר שבו הוכנו, כך שכל תגובה תעבור בדיוק את אותו זמן אינקובציה. טען מחצית או את כולו של כל דגם על ג'ל אקרילמיד. טען תמיסת עצירה בריכוז 1x המכילה צבע באחד או יותר מהנתיבים כדי לוודא את מהירות הריצה של הג'ל.לאחר האלקטרופורזה, הסירו את המפרידים ואחד מלוחות הג'ל. שטפו ונגבו בזהירות את לוח הג'ל ביסודיות כדי להסיר שאריות של Urea משקעת. הניחו את הלוח כאשר הג'ל פונה כלפי מטה על משטח הזכוכית של מחזיק הג'ל והכניסו אותו למכשיר ההדמיה במידת הצורך.רשמו את קואורדינטות הג'ל על הזכוכית. פתחו את התוכנה המתאימה וסרקו את האזור שסומן בשטח הסריקה, בהתאם לתנאים המפורטים בפרוטוקול הכתוב. חתכו את התמונה ודחסו את הנתונים.במידת הצורך, שמרו ולאחר מכן ייצאו כקובץ לצורך ניתוח. ביצוע ניתוח in vitro של פעילות אקסונוקליאז דורש מספר שלבי הכנה. בנוסף לניתוח עצמו עבור בדיקות אקסונוקליאז מבוססות פלואורסצנציה אלו, קריטי לבצע אופטימיזציה של הגילוי במערכת הדימות הפלואורסצנטית.לדוגמה, סובסטרט אוליגנוקלאוטידי המסומן בפלואורסצאין דורש מסנן המאפשר עירור ב-470 nanometers ופליטה ב-520 nanometers. באמצעות מסנן זה, ניתן להגביר את היכולת לזהות ריכוזים נמוכים של סובסטרט או תוצר על ידי כוונון הרגישות והרזולוציה של המדמייר (imager). שימו לב, קיימת רמת סבילות מסוימת בכל הנוגע לרוחב הפס של המסנן.מכיוון שבחירה במסנן שאינו אופטימלי עדיין מאפשרת זיהוי חלקי של התסס (substrate), אם כי ברגישות נמוכה בהרבה, שילוב מתאים של ריכוז אוליגנוקלאוטיד מסומן והגדרות המדמם (imager) יכול להוביל לזיהוי חסון של התסס. דבר זה חשוב, שכן תוצרי הפירוק בעקבות דגירה עם אקסונוקליאז פעיל יופיעו בכמויות נמוכות יותר בכל פס, כיוון שהתסס עבר פרגמנטציה רצופית.בדיקת אקסונוקליאז מוצלחת תגרום לפירוק של הסובסטרט באופן רצפי לכיוון הקצה. כתוצאה מכך, יופיע על הג'ל דפוס אופייני דמוי סולם של DNA, המייצג פירוק על ידי אקסונוקליאז. לאחר אופטימיזציה של הגילוי, ניתן להשתמש בבדיקה כדי לזהות פעילויות דיפרנציאליות, הן באופן איכותני והן באופן כמותי.לדוגמה, ניתן לקבוע את נוכחותה או היעדרה של פעילות במוטציות של נוקלאז בהשוואה לחלבון מסוג בר (wild type). ניתן גם לבחון סובסטראטים שונים כדי לבדוק את יכולתם להתפרק על ידי הנוקלאז. תחת בדיקה.בדיקה זו in vitro יכולה לשמש לבחינת סגוליות השיר (substrate specificity) והתהליך של נוקלאז (nuclease) הנבדק.

a-fluorescence-based-exonuclease-assay-to-characterize-dmwrnexo

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מחקרים גנטיים שמרים יכול להיות מועסק לחקור את הפונקציות מולקולרית תאית של הגנים האנושיים במטבוליזם DNA התאי. מתוארות שיטות לאפיון הגנטי של...

מחקרים גנטיים של חלבונים תיקון דנ&quot;א אנושי באמצעות שמרים כמודל למערכת

אנו מתארים את שיטת מדידה כמותית בזמן אמת, של ה-DNA glycosylase ופעילויות איי פי endonuclease ב lysates גרעיני התא. Assay מניב שיעורי פעילות תיקון דנ"א מקובל ניתוח הקינטית ניתנת להתאמה עבור כימות של פעילות ה-DNA תיקון רקמות lysates הגידול או עם חלבונים מטוהרים.

כמותי, בזמן אמת, ניתוח של פעילות כריתת מאגר תיקון lysates סלולריים ניצול הנגע ספציפיים משואות מולקולרית

שיטה שאינה שכותרתו, הלא-רדיו-איזוטרופי DNA פולימראז הגהה ואת וזמינותו תיקון של ה-DNA פותחה באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-TOF ברזולוציה גבוהה ואסטרטגיה סיומת נוקלאוטיד יחיד. וזמינותו הוכיחה להיות מאוד ספציפי, פשוט, מהיר וקל לבצע הגהה ותיקון טלאים קצר מ 9-נוקלאוטידים.

הגהה ואת וזמינותו תיקון ה-DNA באמצעות ניתוח ספקטרומטר מסה MALDI-TOF והסיומת נוקלאוטיד יחיד

קרינה פלואורסצנטית תהודה אנרגיה המבוסס על העברת בזמן אמת התבוננות במערכות ה-dna לנטישה של exchange התגובה מתווכת על-ידי Rad51 פותחו. באמצעות פרוטוקולים המובאת כאן, אנחנו מסוגלים לזהות את היווצרות התגובה intermediates, המרה שלהם לתוך מוצרים, במהלך ניתוח גם את קינטיקה אנזימטי של התגובה.

תצפית בזמן אמת של התגובה Exchange גדיל DNA מתווכת על-ידי Rad51

פעילות נוקלאז שונה היתה קשורה לתנאים אנושיים שונים, המשמש כבסיס הפוטנציאל שלה כמו סמנים. מודולרי וקל ליישם את מתודולוגיית ההקרנה הציג בנייר זה מאפשר את הבחירה של חומצות גרעין ספציפיים בדיקה לרתימת פעילות נוקלאז כמו סמנים של מחלה.

קינטי הקרנה של פעילות Nuclease באמצעות חומצות גרעין רגשים

מתיל-טרנספראזות דנ"א הן מטרות פוטנציאליות לתרופות לסרטן. כאן מוצג פרוטוקול להערכת מולקולות קטנות לעיכוב מתיל-טרנספראז של DNA. בדיקה זו משתמשת באנדונוקלאז למתילציה זוגית של דנ"א ליצירת פלואורסצנציה ומאפשרת לנטר את פעילות האנזים בזמן אמת.

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

ננו-מכונות מבוססות DNAzyme יכולות לשמש לזיהוי סלקטיבי ורגיש ביותר של חומצות גרעין. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לתכנון ננו-מכונות מבוססות DNAzyme עם ליבה של 10-23 המשתמשות בתוכנה חופשית ויישומן בזיהוי מקטע וירוס אפשטיין-בר כדוגמה.

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

אנו מציגים פרוטוקולים להערכת מיומנות מסלול תיקון שבר גדיל כפול בתאים באמצעות חבילה של מצעי כתב חוץ-כרומוזומליים מבוססי לומינסנציה.

הערכה של פעילות תיקון שבר גדיל כפול DNA באמצעות תפוקה גבוהה וכמותית מבוססת מבחני כתב

מחקר זה מציג בדיקת FRET רציומטרית פשוטה וידידותית למשתמש לאיתור והערכה כמותית של פעילות DNase, ומדגים את יישומו בניתוח נוקלאז חלש.

הערכת פעילות DNase על ידי העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית רציומטרית

פרוטוקול זה מתאר בדיקה ביוכימית של שינוי ג'ל למדידת פעילות FEN1 (Flap Endonuclease 1) והתפתחות מעכבים.

זיהוי מבוסס פלואורסצנטי של פעילות נוקלאז FEN1 וסינון של מעכבי מולקולות קטנות

למדו שיטת סיוע פלואורסצנטית לבדיקת פעילות אקסונוקלאז ב-DmWRNexo, האורתולוג של WRN האנושי. השיטה מאפשרת ניתוח תנאי ריאקציה וספציפיות למצעים בצורה בטוחה וחוזרת.

Assay exonuclease הקרינה מבוסס לאפיין DmWRNexo, Orthologue של האדם Progeroid WRN exonuclease, ויישומו nucleases אחר

גלה סרטונים נוספים