Dithranol כמו מטריקס לליזר Desorption / יינון ההדמיה מטריקס Assisted על Fourier Transform יון הציקלוטרון התהודה ספקטרומטר מסות

הליך זה ממקם מרחבית מספר שומנים אנדוגניים בתוך עדשת בקר. שימוש בטכניקה של יינון לייזר בעזרת מטריצה, הדמיה ספקטרומטרית מסה. ראשית, הכן קטע רקמת עדשת בקר דק והחל מולטי מטריקס, ולאחר מכן רכוש מערך נתונים ספקטרלי של מסה מאלדי.

עבד את מערך הנתונים לייצוג חזותי של השומנים שזוהו בקטע רקמת העדשה. יחד תוצאות אלו יכולות לקבוע את המיקום והשפע היחסי של השומנים בתוך עדשת בקר ולייצר ייצוג חזותי של התפלגות זו בהשוואה לשיטות אחרות כגון מיצוי שומנים ואחריו ניתוח LCMS, הדמיית ספקטרומטריית מסה של מלדי מאפשרת הדמיה של מספר שומנים בו זמנית מבלי לאבד את הלוקליזציה המרחבית שלהם. הסר את דגימות הרקמה הקפואות מאחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס.

הסר את הקפסולה מפני השטח של העדשה כדי לתקן קטע שלם של עדשת עגל בקר. הניחו טיפה אחת או שתיים של מים על שלב חיתוך הרקמות של קריוסטט. הנח במהירות את העדשה במים לפני שהיא מתמצקת כאשר הקריוסטט התאזן לטמפרטורה אופטימלית.

חותכים את הרקמה בקו המשווה לחלקים בעובי 20 מיקרון. השליכו את חלקי הרקמה הראשונים והשתמשו רק בפרוסות הקרובות או הוסיפו את המישור המשווני להדמיית רקמת עדשת העין. הוסף 1.5 מיקרוליטר של חומצה פורמית כדי להרטיב מראש את פני השטח של שקופית זכוכית מצופה ITO.

לאחר מכן העבירו בזהירות את חלקי הרקמה למגלשה שבתוך הקריוסטט. לאחר מכן, ליופיליזציה של השקופיות למשך 15 דקות לפני יישום מטריצת מלדי. בעזרת עט נוזל תיקון, הוסף שלושה סימני הוראה על המשטח הלא מוליך של מגלשת הזכוכית המצופה ITO.

כעת צלם תמונה אופטית של שקופית הטישו באמצעות סורק שטוח ושמור אותה בפורמט מתאים כגון TIFF או jpeg. ראשית, כסו את הקצוות על המשטח הקדמי של שקופיות הזכוכית המצופות ITO בנייר דבק כך שהמטריצה לא תצפה את שולי המגלשה. הכן את המטריצה לשימוש בממס מתאים.

לאחר מכן יש למרוח פתרונות מטריצה על משטחי חלקי הרקמה. מצפים את שקופית הזכוכית באמצעות 20 מחזורי ציפוי מטריצה. לחלופין, ניתן להשתמש במרסס מברשת אוויר בסיוע פנאומטי כדי ליישם את המטריצות אם ממס אינו תואם למרסס המטריצה האלקטרוני.

עבור תמיסת כיול המסה, יש לדלל את התמיסה הסטנדרטית של תערובת כוונון ES בפקטור של אחד עד 200 ב-60% איזופרופנול הכניס שני מיקרוליטר לדקה של תמיסת תערובת הכוונון ES המדוללת לתוך מקור היונים היינון האלקטרו-ריסוס במצב כפול במכשיר למשך ארבעה תהודה ציקלוטרון של יון טרנספורמציה ms. הפעל את מכשיר ה-F-T-I-C-R במצב ESI של היון החיובי עם זיהוי פס רחב וגודל רכישת נתונים של 1024 קילו-בייט לשניה. בדרך כלל מגדירים את פרמטרי ה-ESI של מתח ריסוס אלקטרו נימי של 3, 900 וולט.

מתח מגן ריסוס של 3, 600 וולט זרימת גז חנקן נבולייזר בשני ליטר לדקה. זרימת גז חנקן יבש בארבעה ליטר לדקה וטמפרטורה של 200 מעלות צלזיוס. הגדר גם את הרחפן מתח אחד ל -15 וולט.

זמן טיסה ל-0.01 שניות: זרימת גז ארגון התנגשות ל-0.4 ליטר לשנייה, זמן הצטברות יוני מקור ל-0.1 שניות וזמן הצטברות יונים של תא ההתנגשות ל-0.2 שניות. כעת כוונן את פרמטרי הפעולה של F-T-I-C-R על מנת למקסם את הרגישות האנליטית על פני טווח המסה מיחס מסה למטען 200 עד 1400 תוך שמירה על אותות דעיכת אינדוקציה ללא תחום זמן טוב. לאחר מכן רכוש את ספקטרום המסה של ESI וכיול את המכשיר באמצעות מסות הייחוס של התרכובות הסטנדרטיות בתמיסת תערובת הכוונון E es.

כדי לכוון את המכשיר לפעולת MALDI, יש להמיס כמה מיקרוליטר אחד של תמיסה סטנדרטית של טורין מעורב ו-INE בתמיסת המטריצה בריכוז של מיקרומולרית אחת כל אחת ולאתר את התמיסות הללו ישירות על אחד מקטעי רקמת הדגימה. הנח את השקופית לתוך מתאם שקופיות טישו וטען את המתאם מהצד של MALDI לתוך מקור היונים הכפול של ESI maldi. לאחר מכן, בצע אופטימיזציה של פרמטרי ההפעלה המתאימים של MALDI עבור עוצמת הלייזר ומספר צילומי הלייזר להצטברות אותות MALDI עבור כל סריקה המונית.

לאחר כוונון, כיול ואופטימיזציה של המכשיר לניסויי maldi MSI, יישר את המיקום הפיזי של קטע רקמה להדמיה עם התמונה האופטית המוקלטת שלו בתוך תוכנת ההדמיה. יישר את שלושת סימוני נוזל התיקון בשיטת טריאנגולציה של שלוש נקודות. לאחר מכן התחל פעולת ESI MALDI בו-זמנית כך שכל ספקטרום מסה יכיל את שיאי מסת הייחוס של פתרון תערובת הכוונון E ES לכיול מסה פנימית לאחר רכישה.

ראשית יש להחליש את אות ה-ESI על ידי הפחתת המתח הנימי עד שאותות ה-MALDI שולטים בספקטרום, בעוד שאותות הקליבר של ESI עדיין גבוהים מספיק לכיול מסה פנימית. לאחר מכן, הגדר שיטת גידול אוטומטית ללייזר קרינה. שימוש בניתוח נקודתי אקראי.

הגדר את אזורי הרקמה להדמיה והגדר את גודל צעד ה-RA המתאים בלייזר. כייל את ספקטרום המסה של MALDI באמצעות כיול פנימי להשוואה הראשונית, וכדי לבחור פסגות עבור MSMS de isotope ובחר את הפסגות האיזוטופיות המונו באמצעות סקריפט VBA מותאם אישית וייצא את רשימות השיאים המונו-איזוטופיות המתקבלות. הזן את ערכי יחס המסה למטען הנמדדים לתוך מסדי הנתונים של Melin nine ו/או HMDB metabolome לצורך התאמת מסה לערכי הספרייה.

לאחר מכן, צור תמונות מאלדי עבור כל ישויות השומנים שזוהו על פני כל קטע הרקמה באמצעות תוכנת הדמיה עם רוחב מסנן מסה של חלק אחד למיליון בשיא. לאחר שנוצרו תמונות עבור כל ערכי יחס המסה למטען התואמים לערכי מסד הנתונים, צור תמונות גם עבור כל הפסגות האחרות כדי לחפש דפוסי התפלגות ייחודיים שניתן לחקור מאוחר יותר עבור כמה רקמות ספציפיות, כגון עדשת בקר. קריעה נרחבת של הרקמה נצפית לעתים קרובות כאשר משתמשים בהרכבה ישירה של הפשרה ישירה.

Preco של שקופית ה- IT OAS עם אתנול או חומצה פורמית מסייע בשמירה על שלמות חלקי הרקמה במהלך הרכבת הרקמות. גם בחירת המטריצה וגם בחירת הממס הם גורמים חשובים המשפיעים על איכות ספקטרום MALDI. דוגמאות אלה משוות ספקטרום המיוצר עם ממס מטריצה יעיל עם בחירה גרועה של ממס מטריצה עבור דיול.

לאחר שנרכש מערך ספקטרום המסה מניסוי Maldi MSI, ניתן ליצור את התמונה עבור כל אחד מהיונים שזוהו. כאשר כל פיקסל מייצג נקודת הקרנת לייזר מפני השטח של קטע רקמה. ניתן לפרט את הריכוזים היחסיים של האנליטים בחלקים השונים של חתך הרקמה.

ברוב הניסויים, הנתונים מנורמלים את זרם היונים הכולל בכל ספקטרום. ללא אזורי נורמליזציה אלה עם מטריצת אנליטים טובה יותר, התגבשות COC עלולה לגרום לאותות חזקים יותר עבור האנליטים, וזה יטה את הנתונים. הכנת רקמות יכולה גם לשנות באופן דרמטי את התמונה שנוצרת.

אם הדגימה רטובה מדי, האנליטים יתמקמו על הרקמה וחלק גדול מהמידע המרחבי יאבד. הדגמה זו של ניסוי הדמיית רקמות על עדשת העין השתמשה בדיול כמולטי-מטריקס כדי לקבוע את ההתפלגות המרחבית של שומנים על ידי F-T-I-C-R-M-S. הדמיה של שומנים בסוגים שונים של רקמות יכולה להתבצע באמצעות דיול או מטריצה אחרת בצורה דומה.