Dithranol כמו מטריקס לליזר Desorption / יינון ההדמיה מטריקס Assisted על Fourier Transform יון הציקלוטרון התהודה ספקטרומטר מסות

נוהל זה מבצע מיקום מרחבי של מספר ליפידים אנדוגניים בתוך עדשה של בקר. הפעולה מתבצעת באמצעות טכניקת דיונון בסיוע מטריצה ודסורפציה בלייזר (MALDI), המיועדת לדימות ספקטרומטרי של מסות. ראשית, יש להכין פרוסה דקה של רקמת עדשה מבקר ולהחיל עליה מטריצה רב-מרכיבית, ולאחר מכן לרכוש סט נתונים של ספקטרום מסות בשיטת MALDI.

עבדו את מערך הנתונים לייצוג חזותי של הליפידים שזוהו בחתך רקמת העדשה. יחד, תוצאות אלו יכולות לקבוע את המיקום ואת השכיחות היחסית של הליפידים בתוך עדשת בקר, ולהפיק ייצוג חזותי של התפלגות זו. בהשוואה לשיטות אחרות, כגון מיצוי ליפידים ואחריו אנליזת LCMS, דימות באמצעות ספקטרומטריית מסות MALDI מאפשר ויזואליזציה של ליפידים מרובים בו-זמנית מבלי לאבד את המיקום המרחבי שלהם. הוציאו את דגימות הרקמה שהוקפאו בהקפאה מהירה מהאחסון בטמפרטורה של 80- °C.

הסיר את הקפסולה מפני העדשה כדי לקבע נתח של עדשה שלירת עגלה מלאה. הנח טיפה אחת או שתיים של מים על משטח חיתוך הרקמות של הקריוסטט. הנח במהירות את העדשה במים לפני שהם יקפיאו, כאשר הקריוסטט הגיע לטמפרטורה אופטימלית.

חתכו את הרקמה במישור השוואתי לפרוסות בעובי 20 micron. השליכו את פרוסות הרקמה הראשונות והשתמשו רק בפרוסות הקרובות למישור השוואתי או חתוכות בו לצורך דימות של רקמת העדשה של העין. הוסיפו 1.5 µL של formic acid כדי להרטיב מראש את פניו של סלייד זכוכית מצופה ITO.

לאחר מכן, העבירו בזהירות את חיתוכי הרקמה לסמידה בתוך הקריוסטט. בשלב הבא, בצעו ליופיליזציה לסמידות למשך 15 דקות לפני יישום המטריצה של ה-maldi. בעזרת טיפק correção fluid, הוסיפו שלושה סימני הנחיה על פני השטח הבלתי-מוליך של שקופית הזכוכית המצופה ב-ITO.

כעת צלם תמונה אופטית של שקופית הרקמה באמצעות סורק שולחני ושמור אותה בפורמט מתאים, כגון TIFF או jpeg. ראשית, כסה את הקצוות על פני השטח הקדמיים של שקופיות הזכוכית המצופות ב-ITO באמצעות סרט הדבקה, כדי שהמטריצה לא תצפה את קצוות השקופית. הכן את המטריצה לשימוש בממס מתאים.

לאחר מכן, מרחו תמיסות מטריצה על פני השטחים של נתיחי הרקמה. כסו את שקופית הזכוכית באמצעות 20 מחזורי ציפוי מטריצה. לחלופין, ניתן להשתמש במרסס פניאומטי להחלת המטריצות במידה והממס אינו תואם למרסס המטריצה האלקטרוני.

עבור תמיססת כיול המסה, דללו את תמיססת הסטנדרט של תערובת כוון ה-ES ביחס של 1:200 ב-60% Isopropanol; הניעו שני מיקרוליטר לדקה של תמיססת תערובת כוון ה-ES המדוללת אל מקור יינון הזרקה חשמלית במצב כפול (dual mode electro spray ionization) במכשיר four a transform ion cyclotron resonance ms. הפעילו את מכשיר ה-F-T-I-C-R במצב ESI של יינונים חיוביים עם גילוי רחב-פס (broadband detection) וגודל רכישת נתונים של 1024 kilobytes לשנייה. הגדירו בדרך כלל את פרמטרי ה-ESI למתח זריקה חשמלית של 3,900 volts בקפילרי.

מתח מגן ריסוס של 3,600 volts, ספיקת גז חנקן של הנבולייזר בשני ליטר לדקה. ספיקת גז חנקן יבש של ארבעה ליטר לדקה וטמפרטורה של 200 degrees Celsius. כמו כן, הגדירו את מתח ה-skimmer one ל-15 volts.

זמן מעוף ל-0.01 seconds, זרימת גז ארגון להתנגשות ל-0.4 liters per second, זמן צבירת יונים במקור ל-0.1 second וזמן צבירת יונים בתא ההתנגשות ל-0.2 seconds. כעת כוון את פרמטרי ההפעלה של ה-F-T-I-C-R כדי למקסם את הרגישות האנליטית בטווח המסה מיחס מסה למטען של 200 עד 1400, תוך שמירה על אותות free induction decay תקינים במישור הזמן. לאחר מכן רכוש את ספקטראי המסות של ה-ESI וכייל את המכשיר באמצעות מסות הייחוס של תרכובות הסטנדרט בתמיסת ה-E es tuning mix.

כדי לכייל את המכשיר להפעלה ב-MALDI, המיסו מספר מנות של 1 µL של תמיסת סטנדרט מעורבת של turine ו-INE בתמיסת המטריקס בריכוז של 1 µM לכל אחד, והטביעו תמיסות אלו ישירות על אחד מחתכי רקמת הדגימה. הניחו את השקופית במתאם לשקופיות רקמה והכניסו את המתאם מהצד של ה-MALDI אל מקור היונים הכפול ESI maldi. לאחר מכן, בצעו אופטימיזציה לפרמטרי ההפעלה המתאימים של ה-MALDI עבור הספק הלייזר ומספר פולסי הלייזר לצבירת אות MALDI עבור כל סריקת מסה.

לאחר כיוון, כיול ואופטימיזציה של המכשיר עבור ניסויי maldi MSI, יישרו את המיקום הפיזי של נתח הרקמה המיועד לדימות ביחס לתמונתו האופטית המתועדת בתוך תוכנת הדימות. יישרו את שלושת סימוני נוזל התיקון באמצעות שיטת טריאנגולציה של שלוש נקודות. לאחר מכן, התחילו פעולת ESI MALDI סימולטנית, כך שכל ספקטרום מס יכיל את שיאי מס הייחוס של תמיסת ה-E ES tuning mix לצורך כיול מס פנימי לאחר הרכישה.

ראשית, הנחילו את אות ה-ESI על ידי הפחתת מתח הנימי עד שאותות ה-MALDI יהיו השולטים בספקטרום, בעוד שאותות כיול ה-ESI עדיין יהיו גבוהים דיו עבור כיול מסה פנימי. לאחר מכן, הגדירו שיטה אוטומטית לסריקה של קרינת הלייזר, תוך שימוש בניתוח נקודות אקראי.

הגדירו את אזורי הרקמה לצילום וקבעו את גודל הצעד המתאים לסריקת הלייזר (RA). כיילו את ספקטרי המסות של ה-MALDI באמצעות כיול פנימי לצורך ההשוואה הראשונית, ובחרו שיאים עבור MSMS-de isotope ובחרו את השיאים המונו-איזוטופיים באמצעות סקריפט VBA מותאם אישית, ולאחר מכן ייצאו את רשימות השיאים המונו-איזוטופיים שהתקבלו. הזינו את ערכי יחס המסה למטען שנמדדו למסדי הנתונים Melin nine ו/או HMDB metabolome לצורך התאמת מסות עם רשומות הספריה.

בשלב הבא, הפיקו תמונות MALDI עבור כל ישויות הליפידים שזוהו לאורך כל חתך הרקמה, באמצעות תוכנת דימות עם רוחב מסנן מסה של חלק אחד למיליון בשיא הפסגה. לאחר הפקת תמונות עבור כל ערכי יחס המסה למטען התואמים לרשומות במאגר הנתונים, הפקו תמונות גם עבור כל שאר הפסגות כדי לחפש דפוסי התפלגות ייחודיים שניתן יהיה לבחון מאוחר יותר עבור רקמות ספציפיות, כגון עדשת בקר. לעיתים קרובות נצפית קריעה נרחבת של הרקמה כאשר נעשה שימוש בהרכבה לאחר הפשרה ישירה.

טיפול מקדים של שקופית ה-IT OAS באתנול או בחומצה פורמית מסייע בשמירה על שלמותם של חתכי הרקמה במהלך קיבוע הרקמה. הן בחירת המטריצה והן בחירת הממס הם גורמים חשובים המשפיעים על איכות ספקטרי ה-MALDI. דוגמאות אלו משוות ספקטרום שהופק עם ממס מטריצה יעיל לעומת בחירה לקויה של ממס מטריצה עבור דיול.

לאחר השגתו של סט ספקטרומי מסות מניסוי Maldi MSI, ניתן להפיק תמונה עבור כל אחד מהיונים שהזוהו. כל פיקסל מייצג נקודת הקרנה של לייזר מפני השטח של חתך רקמה. ניתן לפרט את הריכוזים היחסיים של האנליטים בחלקים השונים של חתך הרקמה.

ברוב הניסויים, הנתונים מנורמלים לפי זרם היונים הכולל בכל ספקטרום. ללא נורמליזציה זו, אזורים עם מטריצת אנליט טובה יותר או התגבשות COC עלולים לגרום לאותים חזקים יותר עבור האנליטים, דבר שיוביל להטיה של הנתונים. הכנת הרקמה עשויה גם היא לשנות באופן דרמטי את התמונה שנוצרת.

אם הדגימה רטובה מדי, האנליטים יתפזרו ברקמה ומידע מרחבי רב יאבד. הדגמה זו של ניסוי דימוי רקמה בעדשת העין השתמשה ב-diol כמעטריקס רב-שימושי (multi Matrixx) כדי לקבוע את ההתפלגות המרחבית של ליפידים באמצעות F-T-I-C-R-M-S. ניתן לבצע דימוי של ליפידים בסוגים שונים של רקמות באמצעות diol או מטריקס אחר באופן דומה.