בידוד של כלי הדם האנדותל צינורות מעורקי עכבר התנגדות
25 בנובמבר 2013
אנו מציגים הכנה להדמית מניפולציה סידן איתות בהאנדותל כלי הדם מקומי, ללא פגע. צינורות אנדותל מבודדים טריים מעורקי התנגדות עכבר אספקת שרירים שלד לשמור במורפולוגיה vivo ואיתות דינמית בתוך ובין תאי שכנים. ניתן להכין צינורות אנדותל מmicrovessels של רקמות ואיברים אחרים.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד צינורות של תאי אנדותל מעורקי ה-superior epigastric של עכבר (SEA), כדי לחקור את דינמיקת האיתות התוך-תאית והבין-תאית של אנדותל מיקרו-וסקולרי טבעי ושלם. זאת משיגים תחילה על ידי בידוד ה-SEA מדופן השריר השלדי הבטני של העכבר. בשלב השני, כלי הדם עובר עיכול סומטי עדין, ולאחר מכן TAT 조심ני כדי להפריד את תאי השריר החלק והאדוונטיציה (adventitia) מצינור תאי האנדותל.
בשלב הסופי, המבחנה מקובעת בתא זרימה ומוצפת בתמיסת סליין פיזיולוגית. לבסוף, ניתן להשתמש בדימות קונפוקלי כדי להדמיות של איתות סידן בתוך צינור אנדותל מיקרו-וסקולרי שלם ובמצבו הטבעי. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרבית של תאי אנדותל, הוא שתאי האנדותל המרכיבים את הצינור שומרים על המורפולוגיה, ביטוי החלבונים והתגובתיות הטבעיים שלהם. האנדותל הוא חלק בלתי נפרד מבקרת זרימת הדם בכל הגוף.
יישום טכניקה זו מאפשר לנו לחקור את אירועי האיתות בין תאים המתווכים את הבקרת זרימת הדם, וכיצד הם עלולים להשתבש במהלך תפקוד לקוי של כלי הדם. כדי לבודד תחילה את ה-SEA, בצעו חתך קטן בעור ממש מעל אזור הפובו של עכבר הרדום, הרחיבו את החתך לצדדים בכל כיוון עד לגפיים האחוריות המתאימות, ולאחר מכן המשיכו את החתך לאורך קו האמצע הגבני (ventral midline) עד לחלק העליון של כלוב הצלעות, תוך הרחבה נוספת של החתך לצדדים בכל כיוון עד לארבע הגפיים המתאימות. כעת הרימו בעדינות את העור וכרתו את רקמת החיבור המחברת את העור לשריר שמתחתיו, כדי לחשוף את כל שטח השרירים הבטניים.
שטוף את השריר החשוף בתמיסת סלין בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאו, הרם את רקמת השומן הממוקמת בתחתית העצם הסטרנום (sternum). בצע חתך דרך רקמת השומן ולאורך הצלע התחתונה.
כעת ה-SEA אמור להיות גלוי; תוך הקפדה שלא לפגוע בעורק, יש לשטוף את הרקמה החשופה בתמיסת סלין נוספת בטמפרטורת החדר. לאחר הרחקה של השכבה העליונה של השריר השלדי, יש לסמן את אורכו של ה-SEA ולאחר מכן להסיר בזהירות את שכבת השריר הדקה שמתחת לעורק. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה זוויתית כדי להעביר חוט תפירה מסוג silk 6-0 מתחת ל-SCA.
לאחר מכן, בצעו ליגציה לעורק ולוריד הסמוך לו כדי לשמור על הלחץ ולמנוע דליפת דם מחלל כלי הדם. לאחר ביצוע ליגציה ל-SCA בצד קונטרלטרלי, בצעו חתך לאורך קו האמצע של שרירי הבטן כדי להפריד בין שני הצדדים, ולאחר מכן הרחיבו את החתך לצדדים בכל כיוון, כפי שבוצע בעור. המשיכו את החתך אנכית לאורך הקצה החיצוני כדי להפריד לחלוטין את שריר הבטן מהגוף.
לאחר מכן, גזרו את ה-SEA מעל לאתר הליגציה כדי לשמור על האיטום, והניחו את השריר והעורק המבודדים בכוס כימית של 50 milliliters המכילה 10 milliliters של תמיפת דיסקציה בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius. לאחר בידוד השריר מהצד השני של הבטן, הדגירו את הרקמות בתמיפת הדיסקציה למשך 10 דקות. כעת, הניחו את שריר הבטן המכיל את ה-SEA בצלחת פטרי בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius, המצופה בשכבת cyl guard ומכילה תמיפת דיסקציה. השתמשו בסיכות חרקים של 0.15 millimeter כדי למתוח את ה-SEA ואת השריר לאורכיהם המשוערים in vivo שצוינו קודם לכן.
קבעו את ה-SEA למגן הגליל תוך התכוון השריר כך שהשכבה הדקה הפונה לפריטוניאום תהיה למעלה. לאחר מכן, החל מהאתר העליון (upstream) של הליגציה ובכיוון הקצה התחתון (downstream), נקו כ-1 עד 2 סנטימטרים של ה-SEA מהוריד הזוגי וממהרקמה הסובבת עד לאתר הפיצול העיקרי הראשון. חתכו את ה-SEA מעט מעל אתר הפיצול ומעט מתחת לליגציה.
בשלב הבא, השתמשו בצינור גומי אלסטי כדי לחבר את החלק האחורי של פיפטה למזרק של 5 ml המכיל תמיסת באפר לדיסקציה קרה מאוד. קבעו את קצה פיפטת הקניולציה בתוך תא הדיסקציה ובצעו קניולציה ל-SEA. לאחר שכל התאי האדומים (erythrocytes) נשטפו החוצה, הוציאו את ה-SEA מפיפטת הקניולציה והוציאו את הפיפטה ממעט של הדיסקציה כדי לבודד את הצינורות האנדותליאליים.
ראשית, מלאו חצי מבחנת תרבית זכוכית של 12 על 75 מילימטר בבופר דיסקציה קר מאוד. לאחר חיתוך ה-SEA לחתיכות של 1 עד 3 מילימטר, השתמשו בפינצטה זוויתית כדי להעביר את חתיכות העורקים למבחנת התרבית והניחו את המבחנה על קרח. לאחר מכן, ערבבו אנזימי עיכול עם בופר דיסוציאציה לנפח סופי של 1 מיליליטר במבחנת תרבית נפרדת של 12 על 75 מילימטר, וחממו מראש את תמיסת האנזימים ל-37 °C באמצעות בלוק חימום.
הוציאו את מבחנת התרבית המכילה את חלקי העורקים מטמפרטורה של 4 °C והניחו אותה בטמפרטורת החדר להתחממות, בזמן שתמיסת האנזים מתחממת ל-37 °C. שאבו בזהירות את בופר הדיסקציה, שנמצא כעת בטמפרטורת החדר, ממבחנת התרבית, והשאירו נפח קטן המכיל את מקטעי כלי הדם. כעת, הוסיפו לאט בופר דיסוציאציה בטמפרטורת החדר ללא אנזימים למקטעי כלי הדם, באופן שחלקי העורקים יישארו בתחתית מבחנת התרבית, כדי לשטוף את שאריות בופר הדיסקציה.
ברגע שתמיסת האנזימים תגיע ל-37 °C, שאבו שוב את בופר הדיסוציאציה מתוך מבחנת התרבית המכילה את מקטעי כלי הדם, והשאירו נפח קטן המכיל את מקטעי כלי הדם. כעת העבירו את תמיסת האנזימים בטמפרטורה של 37 °C למבחנת התרבית והדגירו את מבחנת התרבית בבלוק חימום למשך 30 דקות ב-37 °C. במהלך הדגירה, הכינו פיפט לליטרציה ממולא בשמן מינרלי, סמנו את הפיפט, בצעו שבירה נקייה, שברו את הפיפט באמצעות פינצטה לוהטת, פולטשו את קצה הפיפט וחברו אותו למיקרו-מזרק המותקן על מיקרו-מניפולטור.
לאחר מכן, משוך את בוכנת המיקרו-מזרק כדי למלא את הפפיטה ב-2 nanoliters של תמיפת דיסוציאציה, ומקם את קצה הפפיטה מעל תא הזרימה בסיום הדגירה. לאחר שאיבה זהירה של התמיפה כפי שהודגמה כעת, שטוף את מקטעי העורק ב-4 milliliters של תמיפת דיסוציאציה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאב בעדינות מקטע כלי דם אחד באמצעות מיקרו-פפיטה של 1 milliliter והעבר את כלי הדם אל תא זרימה המכיל 1 milliliter של תמיפת הדיסוציאציה.
מקמו את קצה פ pipette התנודה (tation pipette) ליד אחד מקצותי מקטע כלי הדם, ולאחר מכן שאבו את מקטע כלי הדם לתוך פ pipette התנודה בקצב של כ-225 nanoliters לשנייה, כדי למנוע מאמץ מכני לתאי האנדותל, והחזירו את כלי הדם אל תוך התא. אם העיכול הצליח, תאי השריר החלק והאדוונטיציה (adventitia) יופרדו מהצינור האנדותליאלי. הסירו את האדוונטיציה מהצינור האנדותליאלי בהקדם האפשרי כדי למנוע ממנה להסתבך בצינור, ולאחר מכן חזרו על פעולת התנודה כפי שהודגמה כעת, עד שכל תאי השריר החלק יופרדו.
לאחר החזרה האחרונה, הניחו את הצינור האנדותלי המבודד במרכז תא הזרימה, מיושר לאורך כיוון הזרימה, והסירו את פיפט הטריגר. קיבעו את פיפטי הקיבוע במיקרו-מניפולטורים המותקנים בכל קצה של תא הזרימה, ולאחר מכן מקמו את קצותיהם בקצותיו המתאימים של הצינור האנדותלי. הורידו את פיפטי הקיבוע, אחד אחרי השני, מעל הקצוות הנגדיים של הצינור, תוך לחיצה של הצינור אל קרקעית התא, במרחק של כ-50 micrometers מכל קצה של הצינור.
ברגע שפיפטת הקיבוע נוגעת בצינור, החלק אותה לאט לאחור לאורך ציר הצינור, כך שתמתח אותו לאורכו המשוער ב-in vivo. לחץ את הפיפטה אל תחתית התא כדי לקבע את הצינור, ולאחר מכן התחל את זרימת תמיסת הסופרפוזיה באמצעות משאבה פריסטלטית כדי לשמור על זרימה קבועה של תמיסת הסופרפוזיה על פני הצינור האנדותליאלי. בתמונה זו במיקרוסקופ ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC), מוצג צינור תאים אנדותליאליים מבודד מ-SEA לאחר שעה אחת של סופרפוזיה עם בופר סופרפוזיה בקצב של 3 mL לדקה בטמפרטורת החדר.
סרטון זה מדגים את תגובות הסידן של צינור תאי אנדותל הטעון ב-fluo-4 בתגובה לגירוי של אצטילכולין בריכוז 1 µM. תמונות פלואורסצנציה מייצגות אלו נאספו בנקודות זמן שונות לאחר גירוי של צינור האנדותל באצטילכולין. שימו לב כיצד רמות הסידן התוך-תאי תנודתיות לאורך הזמן.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להימנע מגרימה לנזק מכני לצינור האנדותל במהלך המיקום והקיבוע בסיכות, שכן תאי האנדותל עדינים ביותר ונפגעים בקלות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבודד צינורות אנדותל מהעורק האפיגסטרי העליון של העכבר, ובכך לחקור אנדותל מיקרו-וסקולרי טבעי ושלם.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לוויזואליזציה ומניפולציה של איתות סידן באנדותל מיקרו-וסקולרי טבעי. הטכניקה כוללת בידוד של צינורות אנדותל מעורקי התנגדות של עכבר, השומרים על המורפולוגיה שלהם in vivo ועל יכולות איתות דינמיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעיו של המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה וסקולרית
רקע
- האנדותל ממלא תפקיד מכריע בויסות זרימת הדם.
- הבנת איתות הסידן בתאי אנדותל חיונית לחקר התפקוד הכלי.
- שיטות מסורתיות כוללות לעיתים קרובות תרבית תאים, דבר שעלול לשנות את מאפייניהם הטבעיים.
- טכניקה זו מאפשרת לחקור תאים בסביבתם הטבעית.
מטרת המחקר
- לבידוד צינוריות תאי אנדותל לצורך חקירת דינמיקות של סיגנלינג תוך-ותבין-תאי.
- לשימור המורפולוגיה המקורית והתגובתיות של תאי אנדותל.
- לחקירת אירועי סיגנלינג השולטים בזרימת דם והשלכותיהם על תפקוד לקוי של כלי דם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד של העורק האפיגסטרי העליון (superior epigastric artery) משריר שלד בבטנו של עכבר.
- עיכול עדין של כלי הדם כדי להפריד תאי שריר חלק מצינורות אנדותליאליים.
- קיבוע הצינור בתא זרימה לצורך דימות.
- שימוש בדימות קונפוקאלי להדמיית איתות סידן.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של צינורות אנדותליאליים השומרים על מאפייניהם in vivo.
- ויזואליזציה של דינמיקת אותות סידן באנדותל מיקרו-וסקולרי שלם.
- הדגמת יתרונות הטכניקה לעומת שיטות מסורתיות של תרביות תאים.
- תובנות לגבי מנגנוני האיתות המווסתים את זרימת הדם.
מסקנות
- השיטה מספקת כלי רב-עוצמה לחקר השיגנלינג של תאי אנדותל.
- היא משפרת את הבנתנו לגבי תפקוד וליקוי תפקודי כלי דם.
- ניתן להחיל גישה זו על רקמות ואיברים אחרים למשמעויות מחקריות רחבות יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד של צינורות אנדותל מיקרו-וסקולריים שלמים מאפשר מחקר ישיר של דינמיקת איתות הסידן הטבעית ללא השפעות מטריות של שריר חלק או רכיבי דם. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות בביולוגיה של כלי דם על ידי שימור תקשורת בין-תאית פיזיולוגית באמצעות צמתי פער (gap junctions). השיטה מספקת מערכת רלוונטית למחלות לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים של תרכובות המשפיעות על תפקוד האנדותל ועל ויסות זרימת הדם.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי שמירה על מורפולוגיה אנדותליאלית טבעית וביטוי חלבונים.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות שימור סיגנלינג בין-תאי דרך צמתי פער (gap junctions).
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד מסלולי סיגנלינג של סידן הספציפיים לאנדותל.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת צינורות אנדותליאליים סטנדרטיים למדידות שטף כמותיות בתאי סופרפוזיה.
- שחזוריות: יצירת תכשירים עקביים השומרים על תגובתיות טבעית לאגוניסטים כגון acetylcholine.
- יכולת הרחבה: תמיכה בשימוש חוזר בפלטפורמה לסריקת תרכובות המשפיעות על מסלולי התרחבות כלי דם תלויי סידן.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה אנדותל מיקרו-וסקולרי מעורקי התנגדות, החיוניים לבקרת פרפוזיה של רקמות.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לאימות פרה-קלני על ידי שימור ארכיטקטורת הסיגנלינג המקורית.
- קידום מותאם סיכון: מספק בסיס להחלטות go/no-go על סמך מנגנון פעולה ספציפי לאנדותל.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), ומספקת מדדים תפקודיים ספציפיים לאנדותל לפני קמפיינים של סריקה פנוטיפית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבירור מסלולים באמצעות בידוד דינמיקת אותות סידן ברשתות מיקרו-וסקולריות שלמות.
- סריקה: מספקת תכשירים מוכנים לבדיקה עם פלטי זרימה כמותיים להערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה של תנודות סידן תוך-תאיות כמדד תפקודי לוויסות מסלולים.
- מחקר תרגומי: שומרת על רצף מהשלב של הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני על ידי שימור תכונות רקמה אנדותליאלית טבעיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת יכולת ניתנת לשימוש חוזר לחקר תפקוד לקוי של האנדותליום ברחבי מיטות כלי דם שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי בתיקוף המטרה באמצעות שימור איתות אנדותליאלי טבעי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור של הכשרות צינורות אנדותליאליים בין ניסויים שונים.
- ערך אסטרטגי: הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי הפחתת סיכונים במנגנונים אנדותליאליים בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון של תרכובות המכוונות לוויסות טונוס כלי דם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של מיקרו-vessels ובהכנה אנזימטית של רקמות.
- תלוי בתאי פרפוזיה ובמערכות דימוי סידן לקבלת מדדים תפקודיים.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד כלי דם ולהפרדה של שריר חלק.
- שיקולי התאמה כוללים שונות בגודל כלי הדם בין דגמים ומינים שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות את שבירותם של צינוריות האנדותל במהלך הטיפול והגדרת הפרפוזיה.
