Name: בידוד של כלי הדם האנדותל צינורות מעורקי עכבר התנגדות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-25T21:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: למדו לבודד צינורות תאי אנדותל מעורקי עכבר לחקר דינמיקת אותות תוך-תאית ותא-תאית. שיטה זו מאפשרת חקר אנדותל מיקרו-ווסקולרי טבעי ללא שינוי תכונותיו המקוריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לד&quot;ר Pooneh Bagher וד&quot;ר אריקה וסטקוט להערות עריכה בהכנת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי הלאומי ללב, ריאות ודם מכון של המכון הלאומי לבריאות במספרי הפרס R37-HL041026 וR01-HL086483 לSSS וF32-HL107050 לMJS. תוכן זה הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

<ol><li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circ. Res. 78, 415-423 (1996).</li>
<li>Crutchley, D. J., Ryan, J. W., Ryan, U. S., Fisher, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bradykinin-induced+release+of+prostacyclin+and+thromboxanes+from+bovine+pulmonary+artery+endothelial+cells.+Studies+with+lower+homologs+and+calcium+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Bradykinin-induced release of prostacyclin and thromboxanes from bovine pulmonary artery endothelial cells. Studies with lower homologs and calcium antagonists.</a> Biochim. Biophys. Acta. 751, 99-107 (1983).</li>
<li>Kruse, H. J., Grunberg, B., Siess, W., Weber, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+biologically+active+autacoids+is+regulated+by+calcium+influx+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb%22%5BJournal%5D)">Formation of biologically active autacoids is regulated by calcium influx in endothelial cells.</a> Arterioscler. Thromb. 14, 1821-1828 (1994).</li>
<li>Busse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDHF%3A+bringing+the+concepts+together%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">EDHF: bringing the concepts together.</a> Trends Pharmacol. Sci. 23, 374-380 (2002).</li>
<li>Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-activated+K%2B+channels+in+murine+endothelial+cells%3A+block+by+intracellular+calcium+and+magnesium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+-activated K+ channels in murine endothelial cells: block by intracellular calcium and magnesium.</a> J. Gen. Physiol. 131, 125-135 (2008).</li>
<li>Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+conduction+along+endothelial+cell+tubes+from+mouse+feed+arteries%3A+confounding+actions+of+glycyrrhetinic+acid+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives.</a> Br. J. Pharmacol. 166, 774-787 (2012).</li>
<li>Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+intercellular+Ca2%2B+signaling+in+endothelial+cell+tubes+of+mouse+resistance+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries.</a> Microcirculation. 19, 757-770 (2012).</li>
<li>Cohen, K. D., Jackson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+hyperpolarization+is+not+required+for+sustained+muscarinic+agonist-induced+increases+in+intracellular+Ca2%2B+in+arteriolar+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Membrane hyperpolarization is not required for sustained muscarinic agonist-induced increases in intracellular Ca2+ in arteriolar endothelial cells.</a> Microcirculation. 12, 169-182 (2005).</li>
<li>Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effects+on+morphological+integrity+and+Ca2%2B+signaling+in+freshly+isolated+murine+feed+artery+endothelial+cell+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 301, 773-783 (2011).</li>
<li>Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+isoform+expression+in+smooth+muscle+cells+and+endothelial+cells+of+hamster+cheek+pouch+arterioles+and+retractor+feed+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Connexin isoform expression in smooth muscle cells and endothelial cells of hamster cheek pouch arterioles and retractor feed arteries.</a> Microcirculation. 15, 503-514 (1908).</li>
<li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+electrical+conduction+along+endothelial+tubes+of+resistance+arteries+through+Ca2%2B-activated+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels.</a> Circ. Res. 110, 1311-1321 (2012).</li>
<li>Bagher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+intravascular+pressure+activates+endothelial+cell+TRPV4+channels%2C+local+Ca2%2B+events%2C+and+IKCa+channels%2C+reducing+arteriolar+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Low intravascular pressure activates endothelial cell TRPV4 channels, local Ca2+ events, and IKCa channels, reducing arteriolar tone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18174-18179 (2012).</li>
<li>Faraci, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+vascular+effects+of+angiotensin+II%3A+new+insights+from+genetic+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Cerebral vascular effects of angiotensin II: new insights from genetic models.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 26, 449-455 (2006).</li>
<li>Emerson, G. G., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+coupling+between+endothelial+cells+and+smooth+muscle+cells+in+hamster+feed+arteries%3A+role+in+vasomotor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control.</a> Circ. Res. 87, 474-479 (2000).</li>
<li>Ledoux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+signaling+in+restricted+spaces+of+myoendothelial+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9627-9632 (2008).</li>
<li>Tran, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Ca2%2B+wavelets+and+the+induction+of+myoendothelial+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial Ca2+ wavelets and the induction of myoendothelial feedback.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, 1226-1242 (2012).</li>
<li>Nausch, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sympathetic+nerve+stimulation+induces+local+endothelial+Ca2%2B+signals+to+oppose+vasoconstriction+of+mouse+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sympathetic nerve stimulation induces local endothelial Ca2+ signals to oppose vasoconstriction of mouse mesenteric arteries.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 594-602 (2012).</li>
<li>Duza, T., Sarelius, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+endothelial+cell+Ca2%2B+in+response+to+mouse+cremaster+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increase in endothelial cell Ca2+ in response to mouse cremaster muscle contraction.</a> J Physiol. 555, 459-469 (2004).</li>
<li>Colden-Stanfield, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bradykinin-induced+increases+in+cytosolic+calcium+and+ionic+currents+in+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Bradykinin-induced increases in cytosolic calcium and ionic currents in cultured bovine aortic endothelial cells.</a> Circ. Res. 61, 632-640 (1987).</li>
<li>Brunner, F., Kukovetz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioligand+binding+to+muscarinic+receptors+of+bovine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Radioligand binding to muscarinic receptors of bovine aortic endothelial cells.</a> Br. J. Pharmacol. 102, 373-380 (1991).</li>
<li>Tracey, W. R., Peach, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+muscarinic+receptor+mRNA+expression+by+freshly+isolated+and+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential muscarinic receptor mRNA expression by freshly isolated and cultured bovine aortic endothelial cells.</a> Circ. Res. 70, 234-240 (1992).</li>
<li>Adams, D. J., Hill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channels+and+membrane+potential+in+the+modulation+of+intracellular+calcium+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells.</a> J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).</li>
<li>Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+isolation+and+characterization+of+single+vascular+smooth+muscle+cells+from+cremasteric+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles.</a> Microcirculation. 4, 35-50 (1997).</li>
</ol>

אף אחד.

כאן אנו מתארים את הבידוד של צינורות אנדותל מהים והשימוש בתכשיר זה כדי להמחיש Ca 2 + אירועי איתות בתוך ECs המכונן שלה. הליך זה הותאם מאחד שפותח במקור לבודד צינורות אנדותל מarterioles של שריר Cremaster האוגר 8. ניצול שינויים קלים של הטכניקות שהוצגו כאן, יש לנו לבודד צינורות אנדותל ממגוון רחב של מיטות וכלי דם, כוללים: עורקי הזנה של שריר מפשק אוגר והלחי arterioles כיס 10, עורק ברום הבטן מעולה עכבר 6,7,9, mesenteric עכבר ומוחות עורקים וmicrovessels הלימפה (תצפיות לא פורסמו; אזכור כלולים לבידוד כלי mesenteric 12 וכלי מוחין 13). בידוד צינורות אנדותל מהמיטות כלי דם חדשים עשוי לדרוש שינויים בפרוטוקול המקורי. אם הבידוד הוא לא מוצלח, עדיף להתחיל על ידי שינוי פעמים עיכול:להגדיל את זמן העיכול אם צינורות אנדותל קשים לבודד מתאי שריר חלק וadventitia ולהפחית את זמן עיכול אם צינור אנדותל לא נותר על כנן. אם שינוי זמני עיכול הוא לא מוצלח, התאמת הריכוז של אנזימי עיכול או טמפרטורת העיכול צריכה להישפט. אפשרות נוספת היא להקטין את הקוטר הפנימי של פיפטה טחינה דקה, אשר מגדילה את כוח גזירה בהסרת תאי שריר חלק. הגדלת המהירות של פליטת נוזל יכול להיות גם ניסיתי במשך אותו האפקט, אבל יש יותר סיכוי לפגוע בהכנה. יש להכיר בכך שזה לא יכול להיות אפשרי לבודד צינורות אנדותל ללא פגע מכלי שבו תאי האנדותל אינם מחוברים היטב זה לזה על ידי חלבוני junctional. דיסוציאציה של תאי שריר חלק הבאים עיכול אנזימטי בתחילה בוצעה באמצעות pipettor בסגנון יד 8. יש לנו מעודן הליך טחינה דקה באמצעות microsyrמערכת אינגה, שאפשרה בידוד עקבי של צינורות אנדותל ארוכים יותר (עד 3 מ&quot;מ) 6. בעת שימוש במערכת זו, פיפטה טחינה דקה היא backfilled עם שמן מינרלים כדי לספק עמודת נוזל רציפה בין הבוכנה שליטה בתנועה וPSS המכיל את קטע כלי נוזל. Incompressibility של נוזל יחד עם כוח המניע המתמיד של תוצאות הבוכנה microsyringe בגזירה קבועה כמו הספינה נאלץ באמצעות קצה פיפטה. לעומת זאת, טכניקות ידיים המשמשות לעתים קרובות לתאים מתנערים (למשל לסחוט נורת גומי בסוף פיפטה פסטר) כרוכה בדחיסה של אוויר, אשר מציגה השתנות בלחץ הנהיגה, ובכך גזירה המופעל בקצה פיפטה. ישנם יתרונות רבים להכנת הצינור ללימוד תפקוד האנדותל בmicrovessels. הראשון הוא שתהליך הבידוד מספק אוכלוסיות מובחנות הומוגנית ילידים סלולריות של ECS ו mu החלקתאי scle. מאז ECs יישאר מחובר פיזי כמו צינורות, הם נבדלים מהתאים בודדים שרירים חלקים, אשר שומרים על תצורת &quot;C&quot; אם הם נשארים רגועים במהלך טחינה דקה. סוגים כך בהתאמה תא בקלות נבדלים, למשל, כאשר קבלת דגימות לשיטות מולקולריות כגון PCR בזמן אמת ואימונוהיסטוכימיה 10. מאז צינורות מרובים מבודדים מכלי אחד (או מכלי דו צדדיים כפי שנעשה לים), ניתן לקבל נתונים מולקולריים ונתונים תפקודיים מאותו כלי של בעלי חיים מסוימים. ביטוי כך מולקולרי יכול להיות מתואם עם ההתנהגות הפונקציונלית של האנדותל כלי הדם. יתר על כן, ניתן לפתור אירועי איתות שני פנים ובין תאית מהותיים להאנדותל כלי הדם עצמאיים מהשפעתם של כוחות המודינמית (לחץ, זרימה), סוכני vasoactive נשאו בזרם הדם (למשל הורמונים), או מתאי שריר חלק שמסביב (לדוגמא60; באמצעות צימוד myoendothelial 14-16), עצבי 17, או parenchyma הרקמה 18. חשוב לציין, שכן האנדותל מבודד טרי מmicrovessels המיועד, אין שינוי של פנוטיפ שקשור בדרך אחרת עם culturing ECs 19-21. לדוגמא, ECS תרבית מאבד ביטוי הקולטן מוסקריניים ובכך לשנות את פרופילי סידן האיתות שלהם. יתר על כן, מאפייני אלקטרו של ECs יכולים לשנות בתרבות 22. בגלל ECs הבודד להישאר יחד בערוצי צומת פער פונקציונליים, צינור אנדותל מציג מודל אידיאלי לחקר ההולכה של 2 + אותות חשמליים בין התאים וCa 6,7. צריכים גם להכיר בכך שתאי שריר חלק ניתקו נלמדים בקלות עם טכניקות תיקון מהדק לנתונים משלימים שבסיס תפקוד כלי הדם 23. מגבלה העיקרית למ &#39;צינור אנדותלאודל הוא חוסר היציבות של התכשיר עם הגדלת טמפרטורה. בעוד ההכנות שלנו מהים הוכיחו יציבה ובריאים בטמפרטורת הסביבה חדר (~ 24 ° C) ובמשך כמה שעות ב32 ° C, השפלה מורפולוגיים ופונקציונלית מתרחשת בפחות משעה על 37 ° C 9. הגבלה חשובה שנייה של צינור אנדותל היא האובדן של צמתים myoendothelial ותחומים האיתות הטבועות בם, כי הם חלק בלתי נפרד מתפקוד EC בדפנות כלי הדם בשלמותה 14-16. צריך גם להכיר בכך שבעוד שצינורות ארוכים יותר יאפשר איתות אינטר להיחקר על פני מרחקים גדולים יחסית 6, הכנת הצינורות מסובכת כפי שהם מקבלים יותר, כי זה הופך להיות קשה יותר כדי לנתק באופן מלא המקיף את תאי שריר חלק וadventitia. מצאנו כי צינורות ארוכים יותר מ1-2 מ&quot;מ גם קשים יותר למצב ובטוח בתא הזרימה. בניגוד לכך, בעוד שצינורות קצרים יותר (לדוגמא: &lt;1 מ&quot;מ) ENACa 2 + וחשמל אותות ble להיחקר 8, הם קשה לשמור במהלך superfusion בתא הזרימה. לבסוף, גם עם בידוד אופטימלי של צינורות בילטרלי, יש חומר מספיק לכימות מסורתי של ביטוי חלבון באמצעות כתמים מערביים, אם כי immunolabeling מספק מדד של ביטוי חלבון ולוקליזציה. למרות מגבלות אלה, צינור אנדותל מייצג הכנה חדשנית למתן תובנה חדשה מנגנונים של תפקוד תא אנדותל כלי הדם בגוף חי.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הבידוד של צינורות תא האנדותל מהים העכבר. הים נובע מהדם בעורק ואספקת בית החזה הפנימי מחומצן לשרירי בטן הקדמי. שלנו עובד עם הים כמודל ניתן לייחסו לזה מתן מגזרים ארוכים יחסית, unbranched דם קטן שמתאים גם ללימוד אירועי איתות אינטר בדבר תפקידה הבסיסי של האנדותל בשלטון ותיאום הרפיה תא שריר חלק. למעוניינים ברקמות אחרות מאשר שרירי שלד, מצאנו בטכניקה זו כדי להתאים בקלות להשגת צינורות אנדותל מmicrovessels של מערכת הלימפה במוח, מעיים ו. התכונות העיקריות של שיטה זו הן שאורכים שלמים (1-3 מ&quot;מ) של האנדותל כלי הדם מבודדים, מאובטח נגד coverslip זכוכית בתא זרימה שבו הם superfused עם PSS, וצלמת עבור Ca 2 + איתות 7-9 אומשופד ל6,8 איתות החשמלי. בתוך תא הזרימה, חיצו העליון של צינור חשוף לפתרון superfusion ומגיב להתערבויות ניסיוניות, בעוד החצי התחתון (במגע עם coverslip) מוגן ונשאר שקט. בנוסף ללימוד שני 2 אירועי Ca התוך ואינטר + איתות, צינורות האנדותל יכולים לשמש בזמן אמת PCR כמוני להערכת ביטוי גני 6,10, אימונוהיסטוכימיה לחקור ביטוי חלבון 6,10, ומחקרי אלקטרו להגדיר מאפייני biophysical של 6,11 הולכה חשמליות. ישנם מספר יתרונות להכנת צינור אנדותל ללימוד תפקוד האנדותל. הראשון הוא שתהליך הבידוד מספק הבחנה פשוטה בין שתי אוכלוסיות תאים: תאי האנדותל (שיישארו בהיווצרות צינור) ותאי שריר חלק (ניתקה בנפרד, בדרך כלל &quot;C&quot; בצורה שבירגוע). זה מאפשר לדגימה ומחקר של מאפיינים ייחודיים שבבסיס תרומת תאי בהתאמה לתפקוד כלי סלקטיבית. שנית, מודל זה מאפשר הרזולוציה של איתות אירועים מהותיים לאנדותל, עצמאי מההשפעה של זרימת הדם, המקיף את שריר חלק, עצבים, וparenchyma. שלישית, האנדותל הוא למד תוך מבודד טרי, ובכך להימנע משינויים בגן או ביטוי חלבונים הקשורים בתרבית תאים.

<table><tbody><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>סיגמא</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ניטרופרוסיד</td><td>סיגמא</td><td>431451</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>מוצרי USB</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>פפאין</td><td>סיגמא</td><td>P-4762</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז</td><td>סיגמא</td><td>C-8051</td><td></td></tr><tr><td>דיתיאוריתריטול</td><td>סיגמא</td><td>D-8255</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית בורוסיליקאטית (פיפטות קנולציה והצמדה)</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>G150-4</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית בורוסיליקאט (פיפטות טריטורציה)</td><td>World Precision Instruments</td><td>4897</td><td></td></tr><tr><td>מזרק ננוליטר מיקרומזרק</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>B203MC4</td><td>עודכן לננוליטר 2010 מ Nanoliter 2000</td></tr><tr><td>Micro4 בקר</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>12 מ"מ x 75 מ"מ צינורות תרבות</td><td>פישר</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור 3 צירים</td><td>Siskiyou Corp</td><td>DT3-100</td><td>החזקה ומיקום של פיפטות</td></tr> <tr><td>הצמדהתא זרימה</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>RC-27N</td><td></td></tr><tr><td>100-1,000 ומיקרו; l פיפטה</td><td>אפנדורף</td><td>3120000062</td><td>להעברת מקטע כלי מעוכל לתא הזרימה</td></tr><tr><td>1 מ"ל קצות פיפטה</td><td>פישר</td><td>02-707-405</td><td>להעברת מקטע כלי מעוכל לתא הזרימה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ זקוף</td><td>אולימפוס</td><td>BX51W1</td><td>המיקרוסקופ בפועל תלוי במשתמש</td></tr><tr><td>מערכת קונפוקלית דיסק מסתובב</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>הדמיה קונפוקלית היא אופציונלית</td></tr><tr><td>מצלמת XR / TURBO EX</td><td>סטנפורד פוטוניקה</td><td>XR / TURBO EX</td><td>אידיאלי לצרכים שלנו; עשוי להשתנות בהתאם למשתמש</td></tr><tr><td>תוכנת בקרת פייפר</td> תוכנת הדמיה של <td>סטנפורד פוטוניקה</td><td></td><td>עבור מצלמת TURBO EX</td></tr><tr><td>סטריאו Microscrope</td><td>Leica</td><td>MZ8</td><td>עשוי להשתנות עם המשתמש</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיקרו-דיסקציה</td><td>כלי מדע עדין</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont מלקחיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td> <td>#5/45</td><td></td></tr><tr><td>Minutiens סיכות חרקים</td><td>Austerlitz</td><td>M גודל 0.15 מ"מ</td><td></td></tr><tr><td>GP Millipore Express PLUS ממברנה</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר ניקוד פיפטה</td><td>Austin Flameworks</td><td>כלי ניקוד כף יד קטן</td><td>austinflameworks.com</td></tr><tr><td>גוזם חיות מחמד קומפקטי</td><td>וואהל קליפר קורפ</td><td>דגם 9966</td><td>נקה היטב לאחר כל שימוש כדי לשמור על החיים</td></tr></tbody></table>

בידוד של כלי הדם האנדותל צינורות מעורקי עכבר התנגדות

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

השליטה על זרימת דם בכלי הדם על ידי ההתנגדות מווסתת את אספקת חמצן וחומרים מזינים במקביל עם ההסרה של חילוף חומרים לפי מוצרים, כפי שהודגמה על ידי פעילות גופנית שרירי שלד. תאי אנדותל (ECs) מרפדים את אינטימה של כל כלי ההתנגדות ולשרת את התפקיד מרכזי בשליטה בקוטר (vasodilation למשל תלוי האנדותל), ובכך, את הגודל וההפצה של זרימת דם לרקמות. הרגולציה של התנגדות כלי דם על ידי ECs הוא התבצע על ידי Ca 2 + איתות תאית, שמובילה לייצור של autacoids diffusible (למשל תחמוצת חנקן ומטבוליטים חומצה הארכידונית) 1-3 וhyperpolarization 4,5 כי לעורר רגיעה תא שריר חלק. לכן הבנה של הדינמיקה של Ca 2 + איתות אנדותל היא צעד מפתח להבנת מנגנונים המסדירים בקרת זרימת דם. בידוד צינורות אנדותל מבטל משתנים מבלבלים קשורים blood בלומן הכלי ועם תאים המקיפים את שריר חלק ועצבי perivascular, אשר אחרת להשפיע על מבנה EC ותפקוד. כאן אנו מציגים את הבידוד של צינורות האנדותל בעורק מעולה ברום הבטן (SEA) באמצעות פרוטוקול מותאם לכלי זה. כדי לבודד צינורות אנדותל מעכבר הרדים, הים הוא את הגבעול באתר כדי לשמור על דם בתוך לומן הכלי (כדי להקל על לדמיין את זה בזמן נתיחה), ואת כל הגיליון של שרירים בטן הוא נכרת. הים הוא גזור חופשי מסביב סיבי שריר שלד ורקמות חיבור, דם סמוק מהלום, ועיכול אנזימטי מתון מתבצע כדי לאפשר הסרת adventitia, עצבים ותאי שריר חלק באמצעות טחינה דקה עדינה. הכנות טריות מבודדים אלה של האנדותל בשלמות לשמור על המורפולוגיה האם שלהם, עם ECs הבודד שנותר בשילוב פונקציונלי זו לזו, תוכל להעביר כימית וחשמלי signals intercellularly דרך צמתים פער 6,7. בנוסף לאספקת תובנה חדשה ביופיסיקה איתות סיד והקרום, הכנות אלה יאפשרו מחקרים מולקולריים של ביטוי גנים ולוקליזציה חלבון בתוך האנדותל כלי הדם מקומי.

יכולות להיות יזם תגובות סידן בצינורות מבודדים טרי אנדותל באמצעות אצטילכולין (ACH). בסרט הזה, צינור אנדותל עמוס 10 מיקרומטר fluo-4 AM האם מגורה עם superfusion של מיקרומטר ACH 1 (סרט 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/SochaandSegal_movie1.avi" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בסרט.</a> הצבע הוא נרגש ב491 ננומטר ופליטה נרשמת 500-550 ננומטר באמצעות מצלמת מכשיר תשלום מצמידים התעצמה. ערימות תמונה נרכשות ב120 פריימים / השני לתקופה שניות 25 ואז יכולות להיות בממוצע (למשל ל40 מסגרות / sec). תמונות הקרינה נציג לאורך הזמן מוצגות באיור 4. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig1.jpg" width="500px" /> איור 1. תא הזרימה וטפטפות שימוש במהלך הבידוד של צינורות אנדותל. </stro<html> ng&gt;) דוגמאות תא הזרימה מורכבת עם coverslip זכוכית x 50 מ&quot;מ 24 מ&quot;מ כבסיס. ב) (מימין) פיפטה משך (משמאל) ומשך, שבורה, מלוטשת וזווית cannulation. פיפטה זה משמשת כדי לשטוף אריתרוציטים מלומן של העורק לאחר נתיחה. דוגמאות בקנה מידה בר = 200 מיקרומטר. ג) (מימין) פיפטה משך (משמאל) ומשך, שבורה ומלוטשת טחינה דקה. הקוטר הפנימי של פיפטה זה נקבע על ידי הקוטר החיצוני של העורק. דוגמאות בר סולם = 200 מיקרומטר. ד) פיפטה משכה, שבורה ומלוטשת (משך (משמאל) וימין) מצמיד. קצה פיפטה זה מעוגל ואטום לגמרי כדי לאבטח את צינור אנדותל בתא הזרימה. בר = 200 מיקרומטר קנה המידה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> class = &quot;jove_content&quot; עבור: לשמור-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig2.jpg" width="500px" /> איור 2. ספינינג מיקרוסקופ confocal דיסק להדמיה של Ca 2 + אותות.) מיקרוסקופ הזקוף המשמש להדמית סידן. (א) יחידת דיסק ספינינג confocal עם מטרות טבילה (ב) התעצמה מצלמה מכשיר תשלום מצמידים. ג) (א) 63X (ב &#39;) NA = 1) ו (ב) 20X (NA = 0.5) המשמש להדמיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig3.jpg" width="500px" /> איור 3. בידוד של השרירים הבטן ועורק ברום הבטן מעולה. </st<html> rong&gt;) מורדם עכבר עם שרירי בטן חשופה ושלחין עם תמיסת מלח 0.9% טמפרטורת חדר. חיצים אדומים מסמנים את האתרים תחת רפידות שומן שבימי בהתאמה להיכנס כל שריר rectus abdominis (כלומר היכן יש מקשרים את כלי דם). בקנה מידה בר = 1 סנטימטר. B) שרירים בטן מבודדים (חד צדדי) וSEA תלו בחדר נתיחה לmicrodissection. חץ אדום מציין את האתר הגדול הראשון של הסתעפות של הים (כלומר, הנקודה שבה ניקוי של הכלי הופסק). בקנה מידה בר = 1 סנטימטר. C) צינור מבודד אנדותל תא מים. תמונת ההפרש התערבות ניגודיות של צינור אנדותל הבא דגירה 1 שעות בטמפרטורת חדר. צינור אנדותל היה superfused עם חיץ superfusion ב3 מיליליטר / דקה. בר = 50 מיקרומטר קנה המידה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> ether.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig4.jpg" width="500px" /> איור 4. הקרינה סידן בצינור תא האנדותל. תמונות ניאון נציג של צינור אנדותל בתגובה לגירוי עם אצטילכולין 1 מיקרומטר.) פלואורסצנטי לפני גירוי. ב &#39;) הקרינה צינור אנדותל בזמן ממשל אצטילכולין, t = 0 שניות. C) הקרינה צינור אנדותל ב t = 5 שניות. ד) הקרינה צינור אנדותל ב t = הקרינה 10 שניות. E) אנדותל צינור ב t = 15 שניות הקרינה צינור אנדותל. F) בזמן t = 20 שניות. ברים סולם = 40 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

אנו מציגים הכנה להדמית מניפולציה סידן איתות בהאנדותל כלי הדם מקומי, ללא פגע. צינורות אנדותל מבודדים טריים מעורקי התנגדות עכבר אספקת שרירים שלד לשמור במורפולוגיה vivo ואיתות דינמית בתוך ובין תאי שכנים. ניתן להכין צינורות אנדותל מmicrovessels של רקמות ואיברים אחרים.

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד צינורות של תאי אנדותל מעורקי ה-superior epigastric של עכבר (SEA), כדי לחקור את דינמיקת האיתות התוך-תאית והבין-תאית של אנדותל מיקרו-וסקולרי טבעי ושלם. זאת משיגים תחילה על ידי בידוד ה-SEA מדופן השריר השלדי הבטני של העכבר. בשלב השני, כלי הדם עובר עיכול סומטי עדין, ולאחר מכן TAT 조심ני כדי להפריד את תאי השריר החלק והאדוונטיציה (adventitia) מצינור תאי האנדותל.בשלב הסופי, המבחנה מקובעת בתא זרימה ומוצפת בתמיסת סליין פיזיולוגית. לבסוף, ניתן להשתמש בדימות קונפוקלי כדי להדמיות של איתות סידן בתוך צינור אנדותל מיקרו-וסקולרי שלם ובמצבו הטבעי. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרבית של תאי אנדותל, הוא שתאי האנדותל המרכיבים את הצינור שומרים על המורפולוגיה, ביטוי החלבונים והתגובתיות הטבעיים שלהם. האנדותל הוא חלק בלתי נפרד מבקרת זרימת הדם בכל הגוף.יישום טכניקה זו מאפשר לנו לחקור את אירועי האיתות בין תאים המתווכים את הבקרת זרימת הדם, וכיצד הם עלולים להשתבש במהלך תפקוד לקוי של כלי הדם. כדי לבודד תחילה את ה-SEA, בצעו חתך קטן בעור ממש מעל אזור הפובו של עכבר הרדום, הרחיבו את החתך לצדדים בכל כיוון עד לגפיים האחוריות המתאימות, ולאחר מכן המשיכו את החתך לאורך קו האמצע הגבני (ventral midline) עד לחלק העליון של כלוב הצלעות, תוך הרחבה נוספת של החתך לצדדים בכל כיוון עד לארבע הגפיים המתאימות. כעת הרימו בעדינות את העור וכרתו את רקמת החיבור המחברת את העור לשריר שמתחתיו, כדי לחשוף את כל שטח השרירים הבטניים.שטוף את השריר החשוף בתמיסת סלין בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאו, הרם את רקמת השומן הממוקמת בתחתית העצם הסטרנום (sternum). בצע חתך דרך רקמת השומן ולאורך הצלע התחתונה.כעת ה-SEA אמור להיות גלוי; תוך הקפדה שלא לפגוע בעורק, יש לשטוף את הרקמה החשופה בתמיסת סלין נוספת בטמפרטורת החדר. לאחר הרחקה של השכבה העליונה של השריר השלדי, יש לסמן את אורכו של ה-SEA ולאחר מכן להסיר בזהירות את שכבת השריר הדקה שמתחת לעורק. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה זוויתית כדי להעביר חוט תפירה מסוג silk 6-0 מתחת ל-SCA.לאחר מכן, בצעו ליגציה לעורק ולוריד הסמוך לו כדי לשמור על הלחץ ולמנוע דליפת דם מחלל כלי הדם. לאחר ביצוע ליגציה ל-SCA בצד קונטרלטרלי, בצעו חתך לאורך קו האמצע של שרירי הבטן כדי להפריד בין שני הצדדים, ולאחר מכן הרחיבו את החתך לצדדים בכל כיוון, כפי שבוצע בעור. המשיכו את החתך אנכית לאורך הקצה החיצוני כדי להפריד לחלוטין את שריר הבטן מהגוף.לאחר מכן, גזרו את ה-SEA מעל לאתר הליגציה כדי לשמור על האיטום, והניחו את השריר והעורק המבודדים בכוס כימית של 50 milliliters המכילה 10 milliliters של תמיפת דיסקציה בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius. לאחר בידוד השריר מהצד השני של הבטן, הדגירו את הרקמות בתמיפת הדיסקציה למשך 10 דקות. כעת, הניחו את שריר הבטן המכיל את ה-SEA בצלחת פטרי בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius, המצופה בשכבת cyl guard ומכילה תמיפת דיסקציה. השתמשו בסיכות חרקים של 0.15 millimeter כדי למתוח את ה-SEA ואת השריר לאורכיהם המשוערים in vivo שצוינו קודם לכן.קבעו את ה-SEA למגן הגליל תוך התכוון השריר כך שהשכבה הדקה הפונה לפריטוניאום תהיה למעלה. לאחר מכן, החל מהאתר העליון (upstream) של הליגציה ובכיוון הקצה התחתון (downstream), נקו כ-1 עד 2 סנטימטרים של ה-SEA מהוריד הזוגי וממהרקמה הסובבת עד לאתר הפיצול העיקרי הראשון. חתכו את ה-SEA מעט מעל אתר הפיצול ומעט מתחת לליגציה.בשלב הבא, השתמשו בצינור גומי אלסטי כדי לחבר את החלק האחורי של פיפטה למזרק של 5 ml המכיל תמיסת באפר לדיסקציה קרה מאוד. קבעו את קצה פיפטת הקניולציה בתוך תא הדיסקציה ובצעו קניולציה ל-SEA. לאחר שכל התאי האדומים (erythrocytes) נשטפו החוצה, הוציאו את ה-SEA מפיפטת הקניולציה והוציאו את הפיפטה ממעט של הדיסקציה כדי לבודד את הצינורות האנדותליאליים.ראשית, מלאו חצי מבחנת תרבית זכוכית של 12 על 75 מילימטר בבופר דיסקציה קר מאוד. לאחר חיתוך ה-SEA לחתיכות של 1 עד 3 מילימטר, השתמשו בפינצטה זוויתית כדי להעביר את חתיכות העורקים למבחנת התרבית והניחו את המבחנה על קרח. לאחר מכן, ערבבו אנזימי עיכול עם בופר דיסוציאציה לנפח סופי של 1 מיליליטר במבחנת תרבית נפרדת של 12 על 75 מילימטר, וחממו מראש את תמיסת האנזימים ל-37 °C באמצעות בלוק חימום.הוציאו את מבחנת התרבית המכילה את חלקי העורקים מטמפרטורה של 4 °C והניחו אותה בטמפרטורת החדר להתחממות, בזמן שתמיסת האנזים מתחממת ל-37 °C. שאבו בזהירות את בופר הדיסקציה, שנמצא כעת בטמפרטורת החדר, ממבחנת התרבית, והשאירו נפח קטן המכיל את מקטעי כלי הדם. כעת, הוסיפו לאט בופר דיסוציאציה בטמפרטורת החדר ללא אנזימים למקטעי כלי הדם, באופן שחלקי העורקים יישארו בתחתית מבחנת התרבית, כדי לשטוף את שאריות בופר הדיסקציה.ברגע שתמיסת האנזימים תגיע ל-37 °C, שאבו שוב את בופר הדיסוציאציה מתוך מבחנת התרבית המכילה את מקטעי כלי הדם, והשאירו נפח קטן המכיל את מקטעי כלי הדם. כעת העבירו את תמיסת האנזימים בטמפרטורה של 37 °C למבחנת התרבית והדגירו את מבחנת התרבית בבלוק חימום למשך 30 דקות ב-37 °C. במהלך הדגירה, הכינו פיפט לליטרציה ממולא בשמן מינרלי, סמנו את הפיפט, בצעו שבירה נקייה, שברו את הפיפט באמצעות פינצטה לוהטת, פולטשו את קצה הפיפט וחברו אותו למיקרו-מזרק המותקן על מיקרו-מניפולטור.לאחר מכן, משוך את בוכנת המיקרו-מזרק כדי למלא את הפפיטה ב-2 nanoliters של תמיפת דיסוציאציה, ומקם את קצה הפפיטה מעל תא הזרימה בסיום הדגירה. לאחר שאיבה זהירה של התמיפה כפי שהודגמה כעת, שטוף את מקטעי העורק ב-4 milliliters של תמיפת דיסוציאציה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאב בעדינות מקטע כלי דם אחד באמצעות מיקרו-פפיטה של 1 milliliter והעבר את כלי הדם אל תא זרימה המכיל 1 milliliter של תמיפת הדיסוציאציה.מקמו את קצה פ pipette התנודה (tation pipette) ליד אחד מקצותי מקטע כלי הדם, ולאחר מכן שאבו את מקטע כלי הדם לתוך פ pipette התנודה בקצב של כ-225 nanoliters לשנייה, כדי למנוע מאמץ מכני לתאי האנדותל, והחזירו את כלי הדם אל תוך התא. אם העיכול הצליח, תאי השריר החלק והאדוונטיציה (adventitia) יופרדו מהצינור האנדותליאלי. הסירו את האדוונטיציה מהצינור האנדותליאלי בהקדם האפשרי כדי למנוע ממנה להסתבך בצינור, ולאחר מכן חזרו על פעולת התנודה כפי שהודגמה כעת, עד שכל תאי השריר החלק יופרדו.לאחר החזרה האחרונה, הניחו את הצינור האנדותלי המבודד במרכז תא הזרימה, מיושר לאורך כיוון הזרימה, והסירו את פיפט הטריגר. קיבעו את פיפטי הקיבוע במיקרו-מניפולטורים המותקנים בכל קצה של תא הזרימה, ולאחר מכן מקמו את קצותיהם בקצותיו המתאימים של הצינור האנדותלי. הורידו את פיפטי הקיבוע, אחד אחרי השני, מעל הקצוות הנגדיים של הצינור, תוך לחיצה של הצינור אל קרקעית התא, במרחק של כ-50 micrometers מכל קצה של הצינור.ברגע שפיפטת הקיבוע נוגעת בצינור, החלק אותה לאט לאחור לאורך ציר הצינור, כך שתמתח אותו לאורכו המשוער ב-in vivo. לחץ את הפיפטה אל תחתית התא כדי לקבע את הצינור, ולאחר מכן התחל את זרימת תמיסת הסופרפוזיה באמצעות משאבה פריסטלטית כדי לשמור על זרימה קבועה של תמיסת הסופרפוזיה על פני הצינור האנדותליאלי. בתמונה זו במיקרוסקופ ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC), מוצג צינור תאים אנדותליאליים מבודד מ-SEA לאחר שעה אחת של סופרפוזיה עם בופר סופרפוזיה בקצב של 3 mL לדקה בטמפרטורת החדר.סרטון זה מדגים את תגובות הסידן של צינור תאי אנדותל הטעון ב-fluo-4 בתגובה לגירוי של אצטילכולין בריכוז 1 µM. תמונות פלואורסצנציה מייצגות אלו נאספו בנקודות זמן שונות לאחר גירוי של צינור האנדותל באצטילכולין. שימו לב כיצד רמות הסידן התוך-תאי תנודתיות לאורך הזמן.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להימנע מגרימה לנזק מכני לצינור האנדותל במהלך המיקום והקיבוע בסיכות, שכן תאי האנדותל עדינים ביותר ונפגעים בקלות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבודד צינורות אנדותל מהעורק האפיגסטרי העליון של העכבר, ובכך לחקור אנדותל מיקרו-וסקולרי טבעי ושלם.

isolation-microvascular-endothelial-tubes-from-mouse-resistance

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד צינורות האנדותל מפרנכימה מוחית של עכבר. באמצעות שילוב של עיכול אנזימטי ודיסוציאציה מכנית, התהליך מניב צינור שלם עם תאי אנדותל.

הכנת צינורות אנדותל מוחיים מעורקים פרנכימליים של עכבר

היכולת לבודד תאי אנדותל של מסתמי הלב (VECs) היא קריטית להבנת מנגנוני התפתחות, תחזוקה ומחלות של מסתמים.  כאן אנו מתארים את הבידוד של VECs מעכברי Tie2-GFP עובריים ובוגרים באמצעות FACS שיאפשר מחקרים הקובעים את תרומתם של VECs בתהליכי התפתחות ומחלות.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

תאי האנדותל של כלי הדם ממלאים תפקיד משמעותי בהפרעות לב וכלי דם חשובות רבות. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה לבידוד והרחבה של תאי אנדותל מאבי העורקים של העכבר ללא שימוש בציוד מיוחד. הפרוטוקול שלנו מספק אמצעי יעיל לזיהוי מנגנונים בפיזיופתולוגיה של תאי אנדותל.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

כתב יד זה מתאר במבחנה מיקרוסקופ וידאו פרוטוקולים להערכת הפונקציה כלי הדם בעכברוש מוחי התנגדות העורקים. כתב היד מתאר גם טכניקות להערכת צפיפות microvessel עם fluorescently שכותרתו זלוף לקטין ורקמות באמצעות לייזר Flowmetry דופלר.

הערכה של מנגנוני הבקרה וסקולרית ניצול מיקרוסקופ וידאו מבודד התנגדות העורקים של חולדות

המודגמות כאן הם פרוטוקולים לבידוד (1) טרי שלם מוחי אנדותל "צינורות" ומדידות (2) בו זמנית הסידן אנדותל של קרומית אפשרית במהלך אנדותל, נגזר hyperpolarization. עוד, שיטות אלה מאפשרים כוונון תרופתי של תאי אנדותל סידן, איתות חשמלי כמשתנים ניסיוני בודדים או אינטראקטיביות.

מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

אנו מציגים שיטה לבידוד תאי אנדותל וגרעינים מלומן של עורקי הצוואר של עכברים החשופים לתנאי זרימה יציבים או מופרעים כדי לבצע ניסויים באומיקה חד-תאית.

בידוד תאי אנדותל מהלומן של עורקי הצוואר של עכברים לניסויים רב-תאיים חד-תאיים

במאמר זה, תאי אנדותל ריאתיים ראשוניים בודדו וגודלו בתרבית מעכברים ילודים.

בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

הכנה אינטנסיבית של "צינורות" אנדותל מוחיים של עכבר שלמים מעורקיים פרנצ'ימליים מוחיים מודגמת לחקר ויסות זרימת הדם במוח. יתר על כן, אנו מדגימים את החוזקות הניסיוניות של מודל מחקר אנדותל זה להדמיית פלואורסצנטיות ומדידה אלקטרופיזיולוגית של מסלולי איתות תאיים מרכזיים, כולל שינויים בתאיים [Ca2+] ופוטנציאל הממברנה.

בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של מפרקת מוח עכבר

מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל מורין מנימי לימפה עוריים. תאי האנדותל הלימפטיים המבודדים יכולים לשמש לניסויים במבחנה במורד הזרם ולניתוח ביטוי חלבונים.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי אנדותל עכבר מלבלב שלם.

בידוד תאי אנדותל של לבלב עכבר

למדו לבודד צינורות תאי אנדותל מעורקי עכבר לחקר דינמיקת אותות תוך-תאית ותא-תאית. שיטה זו מאפשרת חקר אנדותל מיקרו-ווסקולרי טבעי ללא שינוי תכונותיו המקוריות.

בידוד של כלי הדם האנדותל צינורות מעורקי עכבר התנגדות

גלה סרטונים נוספים