פרוטוקולים ליישום חיידקי Escherichia בהתבסס TX-TL סלולרי ללא ביטוי של ביולוגיה סינתטית

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מערכת ביטוי נטולת תאים מבוססת אי קולי המכונה תרגום שעתוק או TX tl. זה מושג על ידי ייצור ראשוני של שלושה רכיבים ראשוניים לתמצית תאים גולמיים TX TL, תמיסת חומצות אמינו ותמיסת אנרגיה. תמיסת חומצת האמינו ותמיסת האנרגיה ישולבו מאוחר יותר ליצירת מאגר TX TL.

השלב השני הוא כיול תמצית התאים הגולמיים כדי לקבוע ריכוזים אופטימליים של מגנזיום, אשלגן ו-DTT כדי לייצר תגובות TX TL עם רמות ביטוי מקסימליות. לאחר מכן, תוצאות הכיול משמשות לייצור מערכת TX TL בעלת שלושה צינורות העשויה מתמצית תאים גולמיים ו-DNA. השלב האחרון הוא ביצוע תגובת TX TL באמצעות הריאגנטים שזה עתה נוצרו.

בסופו של דבר, TX TL משמש להדגמת מעגלי ביולוגיה סינתטית כמו גם יישומי ביטוי מסורתיים ללא תאים. שיטה זו יכולה לסייע בבדיקת מעגלים בתחום הביולוגיה הסינתטית על ידי מתן סביבה שווה במבחנה, המחקה את זו in vivo. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לכיוון הגברת מהירות התכנון הביולוגי הסינתטי על ידי ביטול הצורך לבצע את כל שלבי האב טיפוס in vivo.

מסייעת בהליך קלייר הייז, עוזרת מחקר בקבוצה שלנו. שימו לב שסרטון זה יעבור רק על חלקים נבחרים של הפרוטוקול הקריטיים לצילומים. הפרוטוקול המלא זמין עם מאמר הטקסט.

מוקדם יותר בפרוטוקול זה, תאי חיידקים גודלו וגלולים. כעת תאי החיידקים יעברו ליזה באמצעות מקצף חרוזים. שמור את כל צינורות הבז בנפח 50 מיליליטר המכילים תרחיף תאים על קרח.

למטרות סרטון זה, חרוזי חרוזים יודגמו עבור צינור אחד בלבד. יש להוסיף את החרוזים לסירוגין לשפופרת הבז בשלוש אליקוטים כל אחד באמצעות שליש מכלל החרוזים. מוסיפים את המנה הראשונה של החרוזים למערבולת הצינור למשך 30 שניות ומניחים על קרח.

באותו אופן, מוסיפים את המנה השנייה של חרוזים, מערבולת, ומניחים על קרח. לאחר הוספת האליקוט האחרון והמערבולת מוודאים שהחרוזים מפוזרים באופן אחיד, יש ליצור משחה עבה לאחר שלב המערבולת השלישי. הניחו את הצינור על קרח.

הכן קצה פיפטה בנפח חמישה מיליליטר באמצעות מספריים סטריליים כדי לחתוך את הקצה. כדי ליצור פתח של שלושה עד ארבעה מילימטרים, חייג את הפיפטה לשני מיליליטר. מניחים 20 צינורות חרוזי חרוזים סטריליים על קרח.

השתמש בפיפטה שהשתנתה כדי לאמת את הצמיגות הגבוהה של תמיסת תאי החרוז. זה צריך להיות צמיג עד כדי בקושי לצאת מקצה הפיפטה. במהלך הפליטה, הסר את תמיסת תאי החרוז מצינור הבז והעביר לצינור חרוזי חרוזים.

ממלא אותו שלושת רבעי סיבוב מלא לזמן קצר ביותר במיני צנטריפוגה. כדי להסיר בועות אוויר מבלי להפיץ מחדש את החרוזים, סיים להוסיף תמיסת תאי חרוזים לצינור ליצירת מניסקוס קעור. לאחר מכן, הוסף טיפה קטנה מאוד של תמיסת תאי חרוזים על החלק הפנימי של מכסה צינור חרוזי חרוזים.

היזהר לא להכניס תמיסה לשפה החיצונית של המכסה. אחרת, צינור חרוזי החרוזים לא ייסגר מספיק. הקש על המכסה על משטח ישר וודא שאין בועות אוויר בתחתית המכסה.

מכסה את צינור הכאת החרוזים. אם נעשה נכון, יש לאטום היטב את הכובע. לא אמורות להיות בועות אוויר גלויות ומעט אם בכלל תמיסת תאי חרוזים אמורה לעלות על גדותיה מכאן והלאה, נדרשים שני אנשים כדי לבצע את חרוזי החרוזים ביעילות.

מסרו את הצינור המלא לעוזר לחרוזי חרוזים בזמן שהמדגים הראשון ממשיך למלא צינורות חרוזים נוספים בתמיסת תאי החרוזים שנותרה. קח את צינור חרוזי החרוזים המלא והניח אותו על קרח. לאחר שנאספו שני צינורות חרוזי חרוזים מלאים והיו על הקרח לפחות דקה.

התחל חרוז חרוזים צינור אחד למשך 30 שניות ב 46 סל"ד. מניחים הפוך על קרח למשך 30 שניות תוך כדי הכאת הצינור השני. חזור על החרוזים והציפוי כך שכל צינור חרוזי חרוזים מלא מוכה במשך דקה אחת בסך הכל.

לאחר שכל צינורות חרוזי החרוזים המלאים עובדו, בנה מכשיר סינון מצינור בז של 15 מיליליטר. ראשית, הוסף מכסה חרוזים חדש חלק שטוח עם הפנים כלפי מעלה לתחתית הצינור. לאחר מכן הסר את המכסה מצינור חרוזי חרוזים מעובד ולחץ בחוזקה על עמוד מיקרו כרומטוגרפיה על קצה צינור חרוזי החרוזים המעובד עד לאיטום מלא.

נתק את הקצה האלוציאני של עמודת המיקרו כרומטוגרפיה והנח אותו אלוסיאני. סיים לתוך צינור חרוזי חרוזים ריק. הכניסו את הקומפלקס הזה לתוך שפופרת הבז של 15 מיליליטר.

בנה את מנגנוני הסינון עבור כל צינורות הכאת החרוזים המלאים ושמור אותם על קרח. כאשר צנטריפוגה מלאה, מנגנוני הסינון צינור פלקון לא מכוסים ב-6,000 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להפריד תמצית וגלולה מחרוזים. לאחר צנטריפוגה, ודא שכל צינור חרוזי חרוזים ייצר תמצית בת קיימא.

תמצית מוכה כהלכה לא תהיה עכורה ולגלולה יהיו שתי שכבות נפרדות כפי שמודגם על ידי הצינור משמאל. יש להשליך צינורות עכורים כפי שמוצג בדוגמה מימין. העבירו את הסופרנטנט מצינורות שאינם טורידים לצינורות מיקרו צנטריפוגות בודדים של 1.75 מיליליטר, תוך נטילת כמה שפחות גלולה.

המשיכו על הקרח עד שכל צינורות חרוזי החרוזים מעובדים. לאחר מכן, סובבו את צינורות המיקרו-צנטריפוגה ואספו את הסופרנטנט. לאחר איחוד 500 מיקרוליטר של סופרנטנט ללא כדורים לצינור חרוזים חדש.

דגרו את הצינורות עם מכסים שהוסרו ב -220 סל"ד ו -37 מעלות צלזיוס למשך 80 דקות. זה יעכל את חומצות הגרעין הנותרות באמצעות אקסונוקלאז אנדוגני המשתחרר במהלך תהליך חרוזי החרוזים. לאחר השלמת הדגירה, התמצית צריכה להיראות עכורה.

לאחד תמצית בצינורות מיקרו צנטריפוגות של 1.75 מיליליטר עד 1.5 מיליליטר לצנטריפוגה של צינור ב-12,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שימוש בפיפטה מאחד סופרנטנט נטול כדורים לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.75 מיליליטר לתפוקות קטנות יותר או צינור בז של 15 מיליליטר לתפוקות גדולות יותר על קרח. מכסים את הצינור ומערבבים היטב על ידי היפוך.

שמור 10 מיקרוליטר של סופרנטנט על קרח למדידה מאוחרת יותר של ריכוז החלבון. קבע את הכמות הכוללת של התמצית המיוצרת והרטיב את המספר הדרוש של 10 קלטות דיאליזה במשקל מולקולרי על ידי טבילה במאגר S 30 B למשך שתי דקות. טען קלטות עם עד 2.5 מיליליטר תמצית.

כל יכולה לקחת עד שתי קלטות תוך דיאליזה תוך ערבוב בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. עיין במאמר הכתוב לשלבי עיבוד לאחר דיאליזה. לתגובת תרגום שעתוק בסיסית יש שלושה חלקים, תמצית תאים גולמיים, מאגר ו-DNA.

למרות שהתגובות יכולות להשתנות בנפח, פרוטוקול זה משתמש בתבנית כתובה מראש כדי לבצע תגובה של 10 מיקרוליטר. הנה. פריטים בסגול מציינים ערכי קלט של המשתמש, ופריטים בכחול מציינים ריאגנטים נוספים כדי להוסיף לעיצוב התגובה את הניסוי בסילי באמצעות קטע הכנת תערובת המאסטר וסעיף הכנת ה-DNA. בדרך כלל ניתן להכניס קבועים לסעיף הכנת תערובת המאסטר ואילו משתנים ניתן להכניס לסעיף הכנת ה-DNA.

צמצם דגימות לכל ניסוי כדי למנוע אידוי דגימה והטיית זמן התחלה ניסיונית. הגדרה לדוגמה מוצגת בטבלה זו. כדי להכין דגימות DNA עבור כל דגימה, יש לזהות את מי ה-DNA המצוינים ואת הפריטים שסופקו על ידי המשתמש לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה.

בטמפרטורת החדר, הכינו את תערובת המאסטר המורכבת מתמצית חיץ וכל פריט שסופק על ידי המשתמש העולמי שומר על קרח ומערבולת. לאחר הוספת כל פריט, הוסף את הכמות המתאימה של תערובת מאסטר לכל דגימת DNA ושמור בטמפרטורת החדר. התייחסו לזה כאל שעת התחלת התגובה.

מערבולת כל דגימה וצנטריפוגה ב-10,000 גרם למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר כדי להוריד כל דגימה שיורית ולהפחית בועות. הפעל את התגובה בצלחת באר 384 בטמפרטורה של 29 מעלות צלזיוס. זמני הריצה ישתנו בהתאם לניסוי, אך בדרך כלל נמשכים פחות משמונה שעות.

בסיום הריצה ניתן לקרוא את הנתונים מקורא לוחות. מאמר זה מציג פרוטוקול בן חמישה ימים להכנת תרגום שעתוק מבוסס אי קולי אנדוגני או מערכת ביטוי נטולת תאים TXTL. תנאי הביטוי של מערכת זו עברו אופטימיזציה באמצעות בדיקת ההשפעות של שיטות עיבוד פלסמיד שונות והמאגר האלוציאני.

יש לכייל מראש משתנים מסוימים שהוכנסו למערכת TXTL לצורך רעילות, למשל, בהשוואה בין שיטות עיבוד פלסמיד שיטת טיהור אחת משתמשת רק בערכת הכנה מיני ספין של קאיה בעוד שבשיטת הטיהור השנייה, הפלסמיד מוכן באמצעות אותה ערכת הכנה מיני ולאחר מכן לאחר התהליך עם קיאק. ערכת טיהור PCR מהירה. גרף זה מציג את הקרינה של נקודת הקצה לאחר שמונה שעות, כמו גם את קצב ייצור החלבון המקסימלי המבוסס על תנועה של 12 דקות פסי שגיאה ממוצעים הם סטיית תקן אחת מארבע ריצות עצמאיות בימים שונים.

ההבדל בביטוי שנצפה נובע מההבדל בתכולת המלח. עם זאת, פריטים אחרים עשויים שלא להראות השפעה על TXTL כגון מאגר אלוציאני. ריכוזים שונים של TS כלוריד הושוו בתגובת ביטוי נטולת תאים על סמך ביטוי של אנו-מולארי אחד של פלסמיד.

הריכוזים שניתנו הם ריכוזים סופיים של טריס כלוריד. בתגובה המאגר האלוציאני המשמש הוא 10 מילי-מולרי פסי שגיאה טריס כלוריד הם סטיית תקן אחת משלוש ריצות עצמאיות בימים שונים. איור זה מציג עלילות כיול אופייניות לתמצית תאים גולמיים, מכוילות לרמות מגנזיום גלוטמט נוספות, אשלגן גלוטמט ו-DTT.

מוצגת פלואורסצנטית נקודת קצה לאחר שמונה שעות וכן קצב מקסימלי של ייצור חלבון המבוסס על ממוצע נע של 12 דקות. שימו לב שכל תמצית תאים גולמיים צריכה להיות מכוילת באופן עצמאי עבור שלושת המשתנים הללו. באופן כללי, התוצאות מצביעות על כך שתמצית התאים הגולמיים רגישה ביותר לרמות מגנזיום גלוטמט ואחריה לרמות אשלגן גלוטמט.

בהתבסס על עלילות אלה, טווח מקובל של מגנזיום גלוטמט נוסף הוא ארבעה מילי-מולארי, אשלגן גלוטמט הוא 60 עד 80 מילי-מולרי ו-DTT הוא אפס עד שלושה מילי-מולארי בצד התחתון. היעילות הסופית של כל תכשיר תמצית תאים גולמיים יכולה להשתנות בהתאם למיומנות המשתמש ולתנאי הסביבה. למרות ששונות התפוקה האופיינית היא בין 5% ל-10%, הקרינה הסופית של שתי תמציות גולמיות שהוכנו בתאריכים שונים מוצגת כאן.

קווי שגיאה הם סטיית תקן אחת משלוש ריצות עצמאיות בימים שונים. כדי להדגים את מערכת הביטוי נטולת התאים, נבנתה לולאת משוב שלילית המבוססת על דיכוי טט ונבדקה אותו מעגל עם ובלי TC הראה ביטוי נקודת קצה פי שבעה. החלפת מדווח D-E-G-F-P לאחר שמונה שעות של פסי שגיאת ביטוי הם סטיית תקן אחת משלוש ריצות עצמאיות בימים שונים.

המעגל הגנטי מוצג בשיבוץ. נתון סופי זה מתאר את ניתוח העלות והביטוי של תמציות תאים גולמיים מתחרות. תרשים העוגה מפרט את עלויות העבודה והחומרים של מערכת הביטוי ללא תאים TX TL בהתבסס על עלויות ריאגנטים נכון לדצמבר 2012 ועלויות עבודה של 14 לשעה.

פאנל B משווה את עלויות מערכת הביטוי ללא תאי TX לעומת מערכות מסחריות אחרות. העלויות מחולקות למיקרוליטר, אם כי נפחי התגובה עשויים להשתנות לכל ערכה. עלויות החומר עבור מערכת זו הן כ-3 סנט לתגובה של מיקרוליטר, המהווה הפחתה של 98% בהשוואה למערכות מסחריות דומות ללא תאים.

פאנל C מציג השוואה של תפוקת מערכת הביטוי נטולת התאים TX TL לעומת מערכות מסחריות אחרות. מערכת זו יכולה לייצר עד 0.75 מיליגרם למיליליטר של חלבון מדווח באמצעות מקדם מבוסס סיגמא 70 עם מפעילי פאג'ים למבדה או מקדם מונע T 7. השוואות אלו מצביעות על כך שמערכת הביטוי נטולת התאים TX TL יכולה לייצר כמויות שוות ערך של חלבון מכיוון שמערכות מבוססות T 7 מוסיפות הפחתה אדירה בעלויות למערכות מסחריות דומות.

אנו מקווים שטכניקה זו סוללת את הדרך לפישוט תהליך הנדסי בביולוגיה סינתטית.