טרנספורמציה ושיבוט שמרים

שמרים או Saccharomyces cerevisiae, הוא אורגניזם מודל אאוקריוטי פשוט נפוץ המשמש בחקר הגנטיקה וביולוגיה של התא שיכול לתת תובנות על תהליכים תאיים אנושיים. וידאו זה דן טרנספורמציה - ספיגת DNA זר על ידי תא השמרים. זה יציג plasmids שמרים, איך להכין תאי שמרים לשינוי, הליך טרנספורמציה צעד אחר צעד, ויספק כמה יישומים של טכניקה בסיסית זו.

לפני שנדבר על טרנספורמציה של שמרים, בואו נדון תחילה בסוג של דנ"א המשמש בטרנספורמציה: הפלסמיד. פלסמיד הוא דנ"א קטן, מעגלי, כפול גדילים שיכול לאקול את עצמו כך שהוא יכול לעבור בקלות דרך נקבוביות בקרום התא.

Plasmids מכילים אתר שיבוט מרובים או MCS שבו אנדונקולאזים הגבלה, AKA "אנזימי הגבלה", יכול לחתוך DNA. רסיסי דנ"א של עניין לחתוך עם אותם אנזימים אז ניתן קשירה לתוך MCS. Plasmids מכילים גם מקור של שכפול או ORI המסמן לתא שבו השכפול צריך להתחיל. בנוסף, plasmids יש סמן לבחירה, אשר מאפשר לתאי שמרים המכילים plasmid לגדול בתנאים סביבתיים ספציפיים. שמרים שאינם משלבים בהצלחה את plasmid לא ישרדו במדיה המכילה את הסמן לבחירה. הסמנים הניתנים לבחירה יכולים לקודד גנים המאפשרים עמידות לתרופות או גנים המקודדים אנזימים המאפשרים לזן שמרים לסנתז חומצות אמינו שאחרת הם אינם יכולים לייצר.

וקטורים של מעבורת הם פלסמידים שיכולים לשכפל ביותר ממין מארח אחד. לדוגמה, פלסמיד מ E. Coli יכול לגדול בשמרים. שמרים Plasmids יכול להיות לא שילוב או שילוב, אומר כי plasmid או משלב עם ה- DNA הגנומי או נשאר עצמאי.

ישנם חמישה סוגים כלליים שונים של plasmids או וקטורים המשמשים שמרים. שני המשמשים לרוב בהפיכת שמרים הם פלסמיד אפיזומלי שמרים או YEp ואת פלסמיד centrometic שמרים או YCp . שני סוגים אלה של וקטורים מכילים רצף שכפול אוטונומי או ARS. ARS מכיל את מקור השכפול ומאפשר שכפול חוץ-טרומוזומלי בשמרים.

ישנם מספר הליכים שונים שניתן להשתמש בהם כדי להפוך שמרים הכוללים את שיטת spheroplast, electroporation, ו ליתיום אצטט-תיווך טרנספורמציה. עבור וידאו זה נתמקד בהליך ליתיום אצטט.

בשיטת טרנספורמציה זו טעונים חיובית ליתיום cations לנטרל מטענים על קרום התא ו- DNA plasmid חד גדילי DNA - הוסיף לתערובת הטרנספורמציה - נקשר לקיר התא של השמרים ומשאיר את ה- DNA plasmid זמין לספיגה על ידי תאי השמרים . החשיפה לעלייה פתאומית בטמפרטורה, או הלם חום יוצרת הבדל לחץ בין החלק הפנימי והימצעי של התא ויוצרת נקבוביות ש- DNA plasmid יכול לעבור דרכם. כאשר הטמפרטורה יורדת, קיר תא השמרים יהיה רפורמה והשינוי הושלם.

בואו נתחיל עם הליך צעד אחר צעד של איך להכין שמרים לשינוי. תאי שמרים חייבים להיות מוכנים על ידי בחירת מושבה תחילה מצלחת אגר והגברת המושבה בתמצית שמרים פפטונה דקסטרוז בינוני, מקוצר YPD - מדיום שלם לצמיחת שמרים.

לאחר המושבה הוא הרים מצלחת להציב לתוך מדיום YPD, התרבות היא דגירה לילה ב 30 °C עם עצבנות על שייקר או מנגנון רולר, כמו שאתה רואה כאן. תאי השמרים הם גלולה על ידי צנטריפוגה ואת supernant מוסר. התאים המנוקדים הם resuspened עם חיץ הרצוי או מים סטריליים. תאי שמרים מוכנים מוסמכים אלה ישמשו בהליך הטרנספורמציה.

לאחר שתאי שמרים הוכנו, טרנספורמציה יכולה להתבצע על ידי הכנת תערובת הטרנספורמציה הראשונה.

תערובת ריאגנט זה צריך לכלול: מים מזוקקים סטריליים; פתרון של 50% פוליאתילן גליקול או PEG, 1M ליתיום אצטט, פתרון 10 מ"ג/מ"ל של DNA חד גדילי, DNA plasmid ותאי שמרים מוסמכים. הפרופורציות המדויקות של כל פתרון צריך להיות מחושב לפני תחילת הניסוי על ידי התייעצות פרוטוקול הסטנדרטי של המעבדה שלך עבור טרנספורמציית שמרים.

התערובת היא לאחר מכן דגירה ב 30 °C (30 °F) במשך 30 דקות עם רועד. הפתרון צריך להיות מעורב, לא מערבולת, כדי להבטיח את תאי שמרים לא להתפרק.

התאים מזועזעים בחום על ידי מיקום באמבט מים 42 °C (42 °F) במשך 15 דקות ואחריו קירור על קרח במשך 2 דקות. לאחר מכן, התאים נקצרים על ידי צנטריפוגה.

התאים נפנים מחדש במים מזוקקים כפולים ומצויים על לוחות אגר שיבחרו עבור הטרנספורמטים הרצויים. לוחות טרנספורמציה הם לאחר מכן דגירה ב 30 °C (50 °F) במשך יומיים עד ארבעה ימים עד המושבות טופס.

הליכי טרנספורמציה צריכים תמיד לכלול לוחות בקרה חיוביים ושליליים עד שהם ממוטבים. השליטה החיובית צריכה להיות השעיית תא שמרים עם DNA plasmid על צלחת YPD שאינו מכיל כל סמן לבחירה. זה מראה שהתאים בריאים בעקבות הליך הטרנספורמציה. צלחת הבקרה השלילית צריכה להיות השעיית תא שמרים על צלחת בחירה מתאימה, כגון אחד המכיל אנטיביוטיקה. הלוח לא צריך להיות מושבות ומראה כי אין זיהום.

ישנם מספר עצום של יישומים שונים עבור טרנספורמציה שמרים. יישום אחד של שמרים שעברו טרנספורמציה הוא להשתמש במערכת היברידית שמרים-שתיים כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם חלבון העניין שלך, או חלבון הפיתיון. כאשר פלסמיד מספרייה של שותפים מחייבים מועמדים, או חלבוני טרף, משתנים ויש אינטראקציה, משתחרר גורם שעתוק שיפעיל גן עיתונאי, כגון Beta-galactosidase. גן הכתב יהפוך מושבות שיש להן אינטראקציה כחולה כאשר על לוחות המכילים X-gal - מצע עבור בטא-galadosidase.

מחיקות מרובות ניתן להנדס לתוך שמרים באמצעות טכניקה באמצעות רכיבה על אופניים מיניים. תאים Haploid המכילים כתב לוקוס נמחק משולבים לתוך תא אחד באמצעות מבחר אקראי או רקומבינציה מיוטית. סמנים ניתנים לבחירה משמשים לבחירה עבור שמרים ששילבו בהצלחה את המחיקות. במקרה זה, ציטומטריית הזרימה משמשת לבחירה עבור תאים המבטאים GFP.

שמרים יכולים להשתנות עם חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי כדי לראות את ההשפעה של מוטציות על אינטראקציות חלבון-חלבון. מאמר וידאו זה השתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את ההשפעות של מוטציות שונות על אינטראקציות חלבון-חלבון חיוני עבור אנדוציטוזיס.

הרגע צפיתם בסרטון של JoVEs על טרנספורמציית שמרים. עכשיו אתה צריך להבין את ההיבטים הבסיסיים של plasmid, איך להכין תאי שמרים לשינוי וכיצד לבצע את הליך הטרנספורמציה. כמו תמיד, תודה שצפית!