העשרה וטיהור של תאי גזע עובריים אנושיים על ידי זיהוי אנטיגנים משטח התא באמצעות נוגדנים חד שבטיים TG30 ו GCTM-2

המטרה הכוללת של הליך זה היא למיין תת-קבוצות של תאי גזע עובריים אנושיים על ידי קשירת האנטיגן שלהם על פני התא של שני הנוגדנים החד-שבטיים TG 30 ו-GC TM. זה מושג על ידי פירוק תאי גזע עובריים אנושיים או תרביות HESC לתרחיפים של תא בודד. בשלב השני, ה-HESC מוכתמים בנוגדנים חד-שבטיים, TG 30 ו-GCTM 2.

לבסוף, התאים מופרדים על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי ומוחזרים לתרבית. בסופו של דבר, ניתן להעריך את יכולת יצירת המושבה של התאים הממוינים על ידי ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ ניגודיות פאזה. הדימוי העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו תצפית חזותית, הוא שהיא מספקת מדד אובייקטיבי של פלוריפוטנטיות על בסיס תא אחר תא עבור מספר רב של תאים, וזה מקל על הפרדת תאי הגזע העובריים מהתאים הממויינים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפלוריפוטנטיות, כגון כיצד שינויים בתנאי התרבית משפיעים כמותית על תאי גזע עובריים אנושיים שונים וקווי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים על ידי בני אדם. ידגימו את ההליך היום מדעני מחקר מהמעבדה שלי, ג'ורג' זואי הון צ'י וביי וואנג, כדי ליצור תרחיף של תא בודד הס להתחיל בשאיבת מצע תרבית הס משתי צלוחיות T 75 המכילות קו תאי הס מתורבת. שטפו כל בקבוק עם 10 מיליליטר DPBS ולאחר מכן דגרו על כל תרבית עם שלושה מיליליטר של תמיסת דיסוציאציה משולשת E ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.

לאחר חמש דקות, חבט בצד הבקבוק כדי לעקור את התאים ואז אשר את הניתוק במיקרוסקופ. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של אמצעי תרבית קרה לכל בקבוק בעזרת פיפטה סטרילית של 10 מיליליטר. טרטר בעדינות את התאים המנותקים מספר פעמים כנגד דופן הבקבוק כדי להשיג תרחיף של תא בודד בעיקר.

כעת אגד את מתלי התא הבודד דרך מסננת תאים של 70 מיקרון לתוך צינור פוליפרופילן סטרילי של 50 מיליליטר כדי להכתים את האנטיגנים של פני השטח של תאי הס. ראשית, Eloqua כ-100,000 תאים ב-150 מיקרוליטר של מדיה בכל אחד מששת צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, דגרו את צינורות הבקרה ואת דגימת המיון הנותרת עם הנוגדנים העיקריים המעניינים בנפחי תגובה סופיים של 200 מיקרוליטר וכ-9 מיליליטר בהתאמה באמצעי תרבית כולל בקרות האיזוטיפ.

מניחים את הצינורות בצורה אופקית על קרח ומערבבים אותם בעדינות במשך 30 דקות על משטח נדנדה. לאחר סיבוב התאים, השליכו את הסופרנטנט ולאחר מכן שטפו את דגימת המיון ב-20 מיליליטר של מצע תרבית קרה ואת דגימות הבקרה ב-200 מיקרוליטר מאותו הדבר. כעת דגרו את דגימת המיון בנפח סופי של 2.5 מיליליטר עם הנוגדנים המשניים המתאימים באמצעי תרבית קרה והבקרות בנפח סופי של 200 מיקרוליטר של אותו הדבר, הוסיפו נוגדן PE אנטי-US CD 90.2 שהוכן לאחרונה גם לצינור הבקרה המתאים בשלב זה.

שוב, ערבבו בעדינות את הצינורות אופקית על קרח למשך 30 דקות על משטח נדנדה. לאחר סיבוב התאים, השעו שוב את דגימת המיון ב-20 מיליליטר של מצע תרבית קרה ואת הבקרות ב-200 מיקרוליטר ושטפו את התאים פעמיים במדיה. השעו מחדש את דגימת המיון בשניים עד שלושה מיליליטר של אמצעי תרבית קרה בתוספת יודיד פרופידיום וכל אחד מהבקרות למעט התאים הלא מוכתמים ב-300 מיקרוליטר מאותו הדבר.

לאחר מכן מסננים כל מתלה תא בודד דרך מסננת תאי מכסה של 35 מיקרון המחוברת למבחנות תחתונות עגולות מפוליסטירן בנפח חמישה מיליליטר וצנטריפוגה את הצינורות כדי לאלץ כל מתלה תאים שיורי על מכסי המסננת לתוך הצינורות. לאחר מכן הקש על דפנות הצינורות כדי להשעות מחדש כל תרחיף תא בודד ולהניח את התאים על קרח. הגדר את ציטומטר הזרימה למיון תאים מופעלים בשני פלואורסצנטיים TG 30 GCTM כך שמתלי תאי הס המנותקים מגודרים כתאים בודדים כדי למנוע גושים וכפילים פוטנציאליים.

לאחר מכן, הסר את הפסולת הפוטנציאלית עם שערי הפיזור הקדמיים והצדדיים כך שרק התאים השלמים ימוינו. לאחר מכן אל תכלול את התאים שאינם ברי קיימא על סמך ביטוי הפרופידיום יודיד שלהם. הוצא את הפיברובלסטים העובריים של העכבר או תאי הזנת המת' על ידי ברירה שלילית על סמך הביטוי שלהם של CD 90.2 pe.

הגדר את ה-TG 30 G CTM שתי הליכה שליליות בהתאם לאוטופלואורסצנציה של הרקע עבור התאים הלא מוכתמים וגם בקרות האיזוטיפ. לאחר מכן ניתן סוף סוף לחלק את שבר ה-HESC המבודד ללא מזיני מת' ל-TG 30, GCT M שלילי, שני TG 30 נמוך, GCT M נמוך, שני TG 30 נמוך, אמצע GCT, TM, שניים בינוניים ו-TG 30 גבוהים, שתי תת-אוכלוסיות גבוהות. לאחר הגדרת ציטומטר הזרימה, הוסף מיליליטר אחד של מדיה ממוזגת מת' לכל אחת משתי מבחנות פוליסטירן עגולות של חמישה מיליליטר והנח אותן על קרח.

לאחר מכן שחזר 400,000 תאים כל אחד מה-TG 30 שלילי GC TM המובחן, שני שליליים וה-TG 30 הפלוריפוטנטי GCTM גבוה שני תת-חלקיקי תאים גבוהים. לאחר סיבוב צינורות האיסוף, יש להשעות כל כדור תא במיליליטר אחד של מדיה מותנית MEF מאוזנת מראש. לאחר מכן זרע בקבוק אחד בשיווי משקל מראש, שליש צפיפות MEF T 75 עם ה-HESC מכל שבר במדיה מותנית מת' מדגרים את תרביות התאים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2, ומרעננים את המדיה מדי יום במשך כשבועיים.

תרביות של TG 30 גבוה GCTM פלוריפוטנטי שני תאים גבוהים מראים מושבות דמויות גזע אנושיות לאחר שבוע אחד ומגיעות לכ-80% שטף ב-9 עד 11 ימים. תרביות של TG 30 שלילי GC TM שני תאים שליליים גדלים בעיקר כמדשאה של תאים דמויי פיברובלסטים שמגיעים לשטף משותף לאחר 11 עד 13 ימים. הזיהוי המשולב של אנטיגנים על פני התא TG 30 ו-GC TM 2 מאפשר הבחנה של מספר תת-קבוצות תאים בשלב הפלוריפוטנטי ובשלבים שונים של התמיינות HESC מוקדמת כפי שמצוין על ידי ביטוי סמני תאי גזע וגורמי שעתוק ספציפיים לשושלת בהסכמה עם דיווחים קודמים, TG 30 GC TM שני שליליים נמוכים, ניתן להבחין בין תת-שברים בינוניים וגבוהים בתוך זכר תאי גזע עובריים אנושיים קו אחד המשמש למחקר זה כאן, האחוזים של תת-האוכלוסיות המגודרות השונות האופייניות לניתוח TG 30 GCTM שתי זרימה ציטומטריה מוצגים בניסוי המוצג כאן.

מספר מוגדר של TG 30 GCT M שלילי שני תאים שליליים תרבית ברצף לאחר המיון במשך כשבועיים, ולאחר מכן נאלצו לאסוף רק את TG 30 GCT M שלילי שני שברים שליליים לפני הציפוי מחדש. בכל מעבר, התוצאות מצביעות על כך שה-TG 30 שלילי הראשוני gct M שני תת-חלקים שליליים מעשיר עבור TG 30 שלילי GCT M שני תאים מובחנים שליליים לאחר אריזה עוקבת. אוכלוסייה מינורית של TG 30 GCT M גבוה שני תאים גבוהים מתגלה במעבר הראשוני, אך בסופו של דבר נעלמת עם אריזה נוספת ומשאירה רק דגימות חופשיות של תאי גזע פלוריפוטנטיים.

כאן מוצגת המורפולוגיה האופיינית של הדשא של TG 30 שלילי GCT M מובחן שני תאים שליליים לאחר 14 יום. שימו לב כי מושבות דמויות HESC ספורדיות שנראו לאחר 14 יום התערבבו עם TG 30 GC TM שלילי שני תאים שליליים שככל הנראה נוצרים על ידי TG 30 גבוה GCT M מזהם שני תאים גבוהים. שימו לב שזה קורה רק לעתים רחוקות ובקטע הפוסט-עובדות הראשוני המבוסס על תצפיות קודמות המשתמשות בבדיקה זו, צפוי כי האיסוף והתרבית של TG 30 גבוה GCTM שני תאים גבוהים צריכים להעשיר עבור HSCs פלוריפוטנטיים היוצרים מושבה.

לכן, אריזה עוקבת של TG 30 High GCTM פלוריפוטנטי שני תאים גבוהים לאחר מיון לפי זרימה ציטומטרית נחקרה גם בתרבויות מייצגות אלה, התאים מוינו בפקס באמצעות TG 30 ו- G CT M שניים, והחליפו רק את TG 30 High G CTM שני תאים גבוהים בכל מעבר. באופן זה, נצפה כי רוב התאים ממוקמים בתת-שברים הקשורים לפלוריפוטנטיות המעידים על אוכלוסייה מועשרת של תאים פלוריפוטנטיים השומרת גם על יכולת להתמיין וליצור מחדש אחוז קטן של TG 30 שלילי G CTM שני תאים שליליים. יתר על כן, תרביות עוקבות של TG 30 High G CTM שני תאים ממוינים גבוהים מציגות מספר רב של מושבות דמויות HESC לאחר המעבר המצביעות גם על שמירה על מצב פלוריפוטנטיות.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לכייל את מכשיר הפקס לפני השימוש בכל פעם כדי להבטיח את יכולת השחזור של התוצאות לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרו-מערכים, ריצוף גנום שלם או טרטומות כדי לענות על שאלות כגון האם תאים אלה באמת פלוריפוטנטיים לאחר התפתחותם? טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לחקור את הבטיחות והיציבות של תאים אלה בהשוואה לתאי גזע עובריים אנושיים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין בזהירות ולהכתים תרביות מעורבות של תאי גזע אנבר אנושיים על מנת להעשיר את תאי הזיפים. אל תשכח שעבודה עם תאים אנושיים עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי הזהירות כגון לבישת כפפות ועבודה עם מחלקה שנייה על ידי ארון בטיחות בעת ביצוע הליך זה.