Name: שימוש Coculture לזהות אינטראקציות interspecies המתווכת כימית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-31T19:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: חקור אינטראקציות מיקרוביאליות מתווכות כימית באמצעות coculture של Bacillus subtilis עם מיקרואורגניזמים סביבתיים. השיטה מאפשרת זיהוי תרכובות מופרשות המשנות ביטוי גנים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחבר מודה רוברטו Kolter (בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד) לקבלת הייעוץ לא יסולא בפזו וסיוע במהלך הפיתוח של מסך coculture זה. היא גם הודות מתיו פאוורס לקריאת כתב היד לבהירות, וChia-יי נג לקבלת סיוע בקבלת איור 6.

<ol><li>Berdy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+microbial+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot%22%5BJournal%5D)">Bioactive microbial metabolites.</a> J. Antibiot. 58, 1-26 (2005).</li>
<li>Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multiple+cell+types+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis.</a> FEMS Microbiol. Rev. 33, 152-163 (2009).</li>
<li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22, 945-953 (2008).</li>
<li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li>
<li>Shank, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+interactions+that+result+in+Bacillus+subtilis+forming+biofilms+are+mediated+mainly+by+members+of+its+own+genus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interspecies interactions that result in Bacillus subtilis forming biofilms are mediated mainly by members of its own genus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1236-1243 (2011).</li>
<li>Piston, D. W., Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J., Claxton, N. S., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPiston%2C+DW+%22Introduction+to+Fluorescent+Proteins%22">Introduction to Fluorescent Proteins</a>. , (2013).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol. Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> J. Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Nicolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condition-dependent+transcriptome+reveals+high-level+regulatory+architecture+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Condition-dependent transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis.</a> Science. 335, 1103-1106 (2012).</li>
<li>Middleton, R., Hofmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+shuttle+vectors+for+ectopic+insertion+of+genes+into+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">New shuttle vectors for ectopic insertion of genes into Bacillus subtilis.</a> Plasmid. 51, 238-245 (2004).</li>
<li>Shimotsu, H., Henner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+single-copy+integration+vector+and+its+use+in+analysis+of+regulation+of+the+trp+operon+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Construction of a single-copy integration vector and its use in analysis of regulation of the trp operon of Bacillus subtilis.</a> Gene. 43, 85-94 (1986).</li>
<li>Guerout-Fleury, A. M., Frandsen, N., Stragier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmids+for+ectopic+integration+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plasmids for ectopic integration in Bacillus subtilis.</a> Gene. 180, 57-61 (1996).</li>
<li>Semsey, S., Blaha, B., Koles, K., Orosz, L., Papp, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integrative+elements+of+rhizobiophage+16-3+can+integrate+into+proline+tRNA+%28CGG%29+genes+in+different+bacterial+genera%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Site-specific integrative elements of rhizobiophage 16-3 can integrate into proline tRNA (CGG) genes in different bacterial genera.</a> J. Bacteriol. 184, 177-182 (2002).</li>
<li>Charpentier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cassette-based+shuttle+vector+system+for+gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Novel cassette-based shuttle vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6076-6085 (2004).</li>
<li>Yang, H. Y., Kim, Y. W., Chang, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+integration-proficient+vector+based+on+the+site-specific+recombination+mechanism+of+enterococcal+temperate+phage+phiFC1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Construction of an integration-proficient vector based on the site-specific recombination mechanism of enterococcal temperate phage phiFC1.</a> J. Bacteriol. 184, 1859-1864 (2002).</li>
<li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites%3A+example+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Protoc. 1, 153-161 (2006).</li>
<li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn7%3A+a+target+site-specific+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Mol. Microbiol. 5, 2569-2573 (1991).</li>
<li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (60), e3796(2012).</li>
<li>Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structurally+diverse+natural+products+that+cause+potassium+leakage+trigger+multicellularity+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).</li>
<li>Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., Wade, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+culture+of+%27unculturable%27+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Strategies for culture of 'unculturable' bacteria.</a> FEMS Microbiol. Lett. 309, 1-7 (2010).</li>
<li>Romano, J. D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas-Saccharomyces+interactions%3A+influence+of+fungal+metabolism+on+bacterial+physiology+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas-Saccharomyces interactions: influence of fungal metabolism on bacterial physiology and survival.</a> J. Bacteriol. 187, 940-948 (2005).</li>
<li>Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+protein+component+of+the+Bacillus+subtilis+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix.</a> Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).</li>
<li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivating+the+uncultured%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cultivating the uncultured.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 15681-15686 (2002).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אחת המגבלות הטבועות של הפרוטוקול הזה הוא שהוא מסתמך על cultivability של אורגניזמים מיקרוביאלי. כפי שכבר תעד 24 היטב, רוב החיים מיקרוביאליים על פני כדור הארץ לא יכולים (עדיין) להיות מבוגרים בתנאי culturing נחקרו עד כה. לפיכך, מספר עצום של יחסי גומלין בין מינים של חיידקים המתרחשים בסביבה טבעית יהיה ללכת מבלי שיבחינו באמצעות גישה זו. עם זאת, מאחר שהרצון שלנו הוא לזהות לא רק את קיומה של אינטראקציות כאלה, אבל אז גם ללמוד את המנגנונים ומולקולות מעורבים בתיווכם, את היכולת לעבד...

אנחנו מעוניינים להבין כיצד מטבוליטים שחיידקים מפרישים משפיעים על הפיסיולוגיה והתפתחות של חיידקים שכנים. מטבוליטים רבים כבר מאופיינים לתופעות ביו בחיידקים אחרים. שתי דוגמאות שתוארו היטב כוללות אנטיביוטיקה, אשר לעכב את הצמיחה של חיידקים אחרים, ומולקולות חישת מניין, אשר משנה את ביטוי הגנים העולמי של חיידקים אחרים. עם זאת, חיידקים מייצרים מוצרים רבים אחרים קטנים מולקולה טבעיות שאין להם bioactivities ידוע 1. אנו משערים כי חיידקים התפתחו ונשמרו את היכולת לייצר כמה מטבוליטים אלה משום שהם מאפשרים להם לווסת את הפיסיולוגיה התאית של חיידקי שכניהם בקהילות חיידקים המורכבים שבתוכה רוב החיידקים להתקיים. סוגי תאי subtilis Bacillus אנו מתמקדים המחקרים שלנו על אינטראקציות של חיידקים בתיווך כימי הכרוכים בBacilsubtilis lus. זה לא רק בגלל מעמדו כחיידק מודל גראם חיובי והכלים גנטיים כתוצאה זמינות למניפולציה שלו, אלא גם בגלל יכולתה להתמיין לסוגים מאופיינים תא. דוגמאות כוללות תאים שהם: שחייה; הפקת המטריצה ​​תאית הנדרשת ליצירת biofilm חזקה; מוסמך לקחת את ה-DNA מהסביבה, והמתנבג בין יתר 2,. כל אחד מסוגי התאים מבטא regulon תעתיק מאפיין שהופך אותם מבחינה פיזיולוגית ו / או פיזי להבדיל מהאחים זהים מבחינה גנטית שלהם. בתנאי גידול רבים, סוגי תאים מרובים לדור בכפיפה אחת אוכלוסיות שונות כמו בתוך מושבה אחת של B. תאי subtilis 3. למרות שמינים רבים של חיידקים עשויים להפגין את ההטרוגניות מקבילה סוג התא, תופעה זו כבר בעיקר למדה היטב ב &#39; subtilis. בפרט, הגנים שהם UPRegulated בתוך כל אחד מB. הספציפי אלה סוגי subtilis תאים זוהו. זיהוי גנים שהוגברו כזה הוא חיוני לעבודה המתוארת כאן כי רבים של פנוטיפים חיידקים אלה של עניין קשה או בלתי אפשריים להתבונן באופן ישיר. לדוגמא, אנחנו לא יכולים מבחינה ויזואלית לזהות תכונה כגון שחייה על צלחות מוצקות (1.5%) אגר, למרות שsubpopulation של B. תאי subtilis לייצר שוטונים בתנאים אלה 3. דוגמא נוספת היא מטריצת ייצור biofilm. ייצור מטריקס ניתן דמיינו ידי מורפולוגיה מושבה (כפי תוצאות מושבות macroscopically מקומטות), אלא רק במדיום גידול מסוים, ורק אחרי ימים רבים של צמיחת 4. עם זאת, על ידי לדעת אילו גנים שהוגברו במהלך התמיינות, אנחנו יכולים לבנות לכתבים תעתיק המשמשים כסמנים להתמיינות לסוגי התאים. כתב בונה לא ניאון אלהכתבי ranscriptional מורכבים מהיזמים עבור גנים תאים מסוג מסוימים נוהגים בייצור של גן כתב, למשל חלבון פלואורסצנטי. דוגמאות כוללות מכשפה-YFP P (לשחייה בתאים), P טאפה-YFP (לתאים מייצרי מטריצת biofilm), ו-P-sspB YFP (להמתנבג תאים), כאשר x P מציין את האזור המקדם עבור x גן. כתב בונה אלה משולבים לוקוס ניטראלי בכרומוזום (איור 1 וראה להלן), כך שרגולצית יליד פנוטיפ נותרה בשלמותה. עם זאת, כעת, כאשר תא מבטא פנוטיפ זה, זה גם מבטא את חלבון פלואורסצנטי. זה מספק דמיינו בקלות לקריאה מתוך ההפעלה מסוימת פנוטיפי התנהגות, מאפשר לנו להקרין לחיידקים שמפעילים את תגובה פיזיולוגית זה. למרות שכתבים כאלה משמשים בדרך כלל במיקרוביולוגיה, הם לא יושמו באופן רחב במסכים לidentifאינטראקציות מטבוליות y בין חיידקים לפני שיטה זו תוארה 5. ישנם מספר השיקולים החשובים בתכנון והבנייה של תאים מסוג ספציפי לזני כתב. יש לנו מנוצלים באופן בלעדי כתבי ניאון תעתיק, אם כי סוגים אחרים של מבנים הם בהחלט אפשריים. אנו לעודד את השימוש בשילובי translational כסמנים לבידול סוג התא במסך שלנו, לעומת זאת, משתי סיבות: 1) הרצון להשאיר מהסוג ספציפי של תאי החלבון האם של שלוות נפש, ו2) ההכרה בכך מפוזר, תא הקרינה רחבה תהיה יותר קלה לזהות מאשר puncta מקומי בתוך תאים (משותף עם התכה translational). בחירת גן כתב לאחר שהחליט להשתמש בתעתיק כקריאה החוצה, גן הכתב יש לבחור (לדוגמא LacZ, הקרינה, או בלוציפראז). יש LacZ היתרון של צורך מיוחד לפחותized ציוד לגילוי, אך קיימת סבירות גבוהה הרבה יותר של תוצאות חיוביות שגויות בקרב חיידקים סביבתיים. בידיים שלנו, ברמת הרקע לאק + אורגניזמים בין החיידקים קרקע הייתה גבוהה להחריד (&gt;&gt; 10% מחיידקי אדמה היו כחולות (Lac +) על צלחות X-gal, מידע לא מוצג). יתכן כי על ידי titrating הריכוז של X-gal במדיום, זה יכול להיות מותאם כדי לאפשר את השימוש בכתב X-gal, למרות שאנחנו לא ניסינו את זה. לוציפראז מספק רגישות גבוהה של איתור והוא הכתב מאונך ביותר: אין כמעט סיכוי לחיידקים סביבתיים להיות זורח מיסודו. עם זאת, מצאנו את זה קשה לזהות מכשור במוסד שלנו, שאיפשר גילוי הארה פני צלחות פטרי כולו, כפי שרובן נועדו לסרוק אזורים רק מקומיים בצלחות רב גם. ייתכן שקיים גם סיבוכים באופן חזותי מושבות זורח באופן שאפשר גם הפיזי בו זמנית הואolation של אורגניזמים וישכנע. בעת השימוש בנאמנים ייתכן שעשה את זה אפשרי, אנחנו במקום שנבחרו לשימוש כתבי תעתיק ניאון, אשר הוכחו לעבוד בB. subtilis, ובלבד רגישות נאותה של זיהוי ושיעורים חיוביים כוזבים נמוכים בקרב אורגניזמים קרקע, ומותר להשתמש במכשור בקלות זמין עבור שניהם להדמיה ונהלי בידוד. בחירת Fluorophore Fluorophore הספציפי שנבחר יהיה תלוי במינים החיידקים שלך, המדיום אגר צמיחתו אתה משתמש, ומסנן הקרינה המסוים קובע שיש לך זמין. עם המכשור שלנו, מצאו ששניהם B. subtilis מושבות עצמם ואגרו הם גדלו על הקרינה רקע פחות הוצגה כאשר מסנני YFP (חלבון פלואורסצנטי צהוב) היו בשימוש, מה שהופך את הכתב שעדיף על ה-GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) בידיים שלנו. שימוש קודון של חלבוני ניאוןלעתים קרובות מותאם לאאוקריוטים, שהופך אותו חשוב לבחור fluorophore ידוע או מהספרות לעבודה במינים החיידקים שלך, או לבדוק אותו באופן מפורש באמצעות אמרגן מכונן. מספר גדול של גרסאות חלבון פלואורסצנטי הולכת ומתפתחים זמין 6 כיום, שכבר נבדק במספר המקורות 7,8, שחלקם באופן מפורש לספק הדרכה בבחירת חלבון פלואורסצנטי מתאים לניסוי שלך 9. בחירת יזם הבחירה של אמרגן במידה רבה תהיה תלויה בסוג התא או הפנוטיפ של עניין שלך. לאורגניזמים כגון B. subtilis, כמה גנים כתב תאים מסוג מסוימים הוקמו בספרות. לזני חיידקים אחרים, בחינת microarray או נתונים תעתיק תהיה צורך לספק מידע על אילו גנים שהוגברו מאוד בתנאים שבו סוג התא שלך שלי ענייןבא לידי ביטוי ים. מחקר שנערך לאחרונה מקוטלג השעתוק של B. subtilis תחת 104 תנאי גידול שונים באמצעות מערכי ריצוף 10. מאמר זה מספק מידע מקיף על אילו גנים שהוגברו מאוד בתנאים שונים, שלא יסולא בפז לפנוטיפים-היטב מאופיינים פחות. במקום מיפוי אזורי אמרגן מדויקים לכל גן של עניין, אנחנו בדרך כלל פשוט להשתמש נ&quot;ב הרצף 200-500 במעלה הזרם של הגן כאמרגן. אורך הרצף המדויק תלוי בהקשר הגנומי: אזורים קצרים יותר נמצאים בשימוש בעת צורך כדי להימנע מהכללת אזורי קידוד במעלה הזרם משכן מסגרות קריאה פתוחות. לוקוסים ואינטגרציה ניטראליים איך לשמור על הכתב לבנות בזן החיידקים שלך הופכת להיות השאלה האחרונה בעיצוב זן כתב תעתיק ניאון. בחיידקים, גנים של עניין נשמרים בתדירות גבוההעל פלסמידים באמצעות בחירה אנטיביוטיות. עם זאת, ייתכן שלא ניתן יהיה להשתמש באנטיביוטיקה במהלך coculture בלי להרוג את החיידקים הסביבתיים. אם פלסמידים נשמרים ביציבות במינים החיידקים שלך, זה עשוי להיות אפשרי לגדול החיידקים שלך מכילים כתב שמקורן בפלסמיד בנוכחות של אנטיביוטיקה כדי להכין את הכתב שלך להקרנה, ולאחר מכן לחסל אנטיביוטיקה במהלך coculture עצמו בתקווה שיהיה פלסמיד להישמר במידה מספקת כדי לאפשר לקרינה. עם זאת, אם פלסמידים הולכים לאיבוד בקלות בחיידק שלך, או הולכים לאיבוד בתנאי לחץ, זו לא תהיה אפשרות מעשית. במקרים רבים, הפתרון הטוב ביותר יהיה לשלב את הכתב לבנות על גבי כרומוזום בקטריאלי, המאפשר תחזוקה יציבה של הכתב גם בהיעדר של בחירה. על מנת ששילוב לא לשבש את הביטוי או תקנה הרגיל של גן העניין שלך, אנו ממליצים לשלב לתוך אתר מחוץ לרחם בכרומוזום כי can לשמש &quot;מוקד ניטראלי&quot;. בB. subtilis אתרי אינטגרציה אלה הם גנים ה-- כאשר מוטציה - להעביר פנוטיפ בתקשורת מינימאלית מסוימת (המאפשר integrants להיות מזוהה ללא בחירת אנטיביוטיקה), אך אינו משנה את הצמיחה או שיעורים נביגה במדיה עשירה, וכולל כגון גנים כamyE, lacA, thrC, pyrD, gltA, וsacA (שינוע היכולת לנצל עמילן, β-galactosides, תראונין, אורציל, גלוטמט, וסוכרוז, בהתאמה) 11-13. למרות ששילוב בגנים אלה היה בשימוש באופן אמין במשך שנים רבות בB. subtilis (במיוחד בamyE וlacA), ידע דומה ייתכן שלא יהיה זמין לגנים במינים רבים של חיידקים אחרים. השימוש באתרים מצורפים הפאג חלופות גדולות לאתרי אינטגרציה כרומוזומליות ניטראליים: יש מינים ספציפיים רבים 14-16, כמו גם באתרי אינטגרציה כלליים כגון האתר המצורף Tn7 (Tn7 עו&quot;ד)זוהה ומנוצל להוספות גנים במינים רבים של חיידקי 17,18. חיידקים סביבתיים אנו משתמשים באדמה כמקור ישיר של חיידקים סביבתיים למסך coculture שלנו. האדמה מכילה מגוון גבוה של חיידקים, ורבים מיצורים אלה הם מקור עשיר של מוצרים טבעיים. באמצעות תרחיפים נוזליים של אדמה הונחו ישירות על גבי צלחות עם הזן שלנו ניאון תעתיק כתב (ללא בידוד מוקדם של חיידקים מהאדמה), אנחנו מאוד לפשט הגישה הניסויית. האדמה יכולה לשמש מייד לאחר קציר, או להיות קפוא ב-80 ° C לשימוש עתידי. יש שימוש מיידי את היתרון שמגוון גדול יותר של חיידקים ניתן לגדל באופן פוטנציאלי, כולל אלה שלא ישרדו הקפאה היטב. יש לו את החסרון שהריכוז של אורגניזמים אדמה לעיבוד חקלאיים מדוגמאות אלה אינו ידוע, הגדלת מספר צלחות מסך שחייב להיות בשימוש. דליש שימוש עאיד היתרון ש/ מיליליטר CFU עבור כל מקור אדמה ניתן לקבוע מראש, ומאפשר למספר אופטימלי של מושבות שגדל על כל צלחת מסך. עם זאת, הוא דורש שאורגניזמים האדמה להיות מסוגלים לשרוד הקפאה. שים לב שגיוון בריכת inducer הנבדקת (כלומר מקורות האדמה) מופיע להיות יעילים יותר בזיהוי אינטראקציות interspecies חדשים מאשר הקרנה מעמיקה על אותה האדמה: מגוון פילוגנטי גדול יותר נצפה בנפילות במסך מטריקס האינדוקציה שלנו, כמו מקורות אדמה נוספים נבדקו ולא הקרנה אותם מקורות הקרקע באופן יסודי יותר (EA שאנק ור &#39;Kolter, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד, תוצאות לא פורסמו). סקירה הגישה שאנו מתארים כאן היא פשוטה מבחינת הדרישות טכניות שלה. היא כוללת: 1) בניית כתב תעתיק ניאון בB. subtilis אומיני חיידקים אחרים של עניין, 2) זיהוי תנאים שבם הכתב הזה אינו מופעל, 3) הכנת aliquots של זן הכתב הזה ואורגניזמים שיוקרנו (במקרה של אדמתנו, אבל יכולים להיות מנוצלים מקורות אחרים במקום), 4) ערבוב אלה שתי קבוצות של חיידקים על תקשורת מוצקה, 5) זיהוי ובידוד המשוערת גרימת אורגניזמים, ו6) המאשר כי אורגניזמים אלה אכן להפעיל פנוטיפ זה במסך המשני. לאחר שזוהו, אורגניזמים אלה ומטבוליטים שלהם לספק לנו כלים כימיים כדי לווסת את התנהגות חיידקים, ללמוד פיזיולוגיה חיידקים ויחסי גומלין של חיידקים, ואפשרות לפעול פיגומי רומן כמו לתרכובות טיפוליות עתידיות.

<table><tbody><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td></td><td></td><td>כל ספקטרופוטומר המסוגל למדוד ערכי OD600 absorbance.</td></tr><tr><td>מרק לוריא, לנוקס</td><td>VWR</td><td>80017-484</td><td>ייתכן שיהיה צורך במקורות מדיה חלופיים.</td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית, 3 מ"מ</td><td>VWR</td><td>26396-508</td><td></td></tr><tr><td>קצות טעינת ג'ל,</td> מוטות זכוכית <td>עגולים VWR</td><td>29442-666</td><td></td></tr><tr><td>VWR</td><td></td><td>59060-069</td><td></td></tr><tr><td>סטריאוסקופ ניתוח פלואורסצנטי</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>המחבר השתמש בסטריאוסקופ דיסקציה של Zeiss Stemi SV6 עם מקור אור פלואורסצנטי EXFO X-cite 120, קוביית מסנן YFP ארוכת מעבר, אובייקט אכרומט 0.63X, עיניות 10X ו- מצלמה דיגיטלית Axio HRC HR. רוב ההקרנה נעשתה עם תושבת המיקוד ב-2.0-3.2X. כל סטריאוסקופ מנתח עם יכולות פלואורסצנטיות הוא בסדר, בתנאי שיש לך את המסננים הנכונים עבור ה-FP שבו אתה משתמש. עדיף אם יש תריס המאפשר לעבור בקלות בין שדה בהיר לפלורסן, כמו גם במה המאפשרת תאורה מלמעלה ומלמטה. אם אתה רוצה לצלם תמונות, יש צורך גם במצלמה מחוברת.</td></tr></tbody></table>

שימוש coculture לזהות אינטראקציות interspecies המתווכת כימית

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

בטבע, חיידקים קיימים רק לעתים נדירות בבידוד, הם מוקפים במקום על ידי מערך רחב של מיקרואורגניזמים אחרים המשנים את הסביבה המקומית על ידי הפרשת המטבוליטים. יש מטבוליטים אלה הפוטנציאל לווסת את הפיסיולוגיה ובידול של שכניהם של חיידקים והם גורמים חשובים צפויים בהקמה והתחזוקה של קהילות חיידקים מורכבות. פיתחנו מסך coculture הקרינה מבוססת לזהות אינטראקציות של חיידקים בתיווך כימי מסוג זה. המסך כולל שילוב מתח כתב תעתיק ניאון עם חיידקים סביבתיים על תקשורת מוצקה ומאפשר למושבות לגדול בcoculture. כתב תעתיק הניאון מתוכנן כך שזן החיידקים שנבחר מאיר כאשר הוא מבטא את הפנוטיפ מסוים של עניין (כלומר היווצרות biofilm, נביגה, ייצור גורם ארסיות, וכו &#39;.) הקרנה מתבצעת בתנאי צמיחת wheמחדש פנוטיפ זה לא בא לידי ביטוי (ולכן מתח הכתב הוא בדרך כלל nonfluorescent). כאשר חיידק סביבתי מפריש המטבוליט שמפעיל פנוטיפ הזה, זה מפזר באמצעות אגר ומפעיל את מבנה כתב הניאון. זה מאפשר-ייצור המטבוליט גרימת החיידק כדי להתגלות: הם מושבות nonfluorescent הפרוקסימלי ביותר למושבות ניאון. כך, מסך זה מאפשר זיהוי של חיידקים סביבתיים שמייצרים מטבוליטים diffusible המפעילים תגובה פיזיולוגית מסוימת במתח כתב. פרסום זה דן באופן: א) לבחור תנאי הקרנת coculture מתאימים, ב) להכין את הכתב וחיידקים סביבתיים להקרנה, ג) לבצע את מסך coculture, ד) לבודד משוער גרימת אורגניזמים, וה) לאשר את פעילותם במסך משנית. פיתחנו שיטה זו כדי למסך עבור אורגניזמים אדמה שיפעילו biofilm מטריצת ייצור בsubtilis Bacillus </em&gt;, עם זאת, אנחנו גם לדון בשיקולים ליישום גישה זו לחיידקים גנטי צייתנים אחרים.

מסך זה משמש לזיהוי אורגניזמים אדמה מפריש תרכובות המשנות את הפיסיולוגיה של B. subtilis. התוצאות המתוארות כאן יתמקדו בסוג התא שמייצר מטריצה ​​של B. subtilis, אשר מייצר את החלבון וexopolysaccharide הנדרשים ליצירת biofilm חזקה בחיידק זה. אנחנו בחרנו את האמרגן של אופרון טאפה-sipW-טסה למבנה שלנו ניאון כתב (P טאפה-YFP). אופרון זה מקודד את המרכיב המבני החלבון של מטריקס, והוא שהוגברו במהלך ייצור מטריצת biofilm 23. כתב המטריצה ​​שלנו...

חיידקים מייצרים תרכובות מופרשות שיש לו את הפוטנציאל להשפיע על הפיסיולוגיה של חיידקי השכנים שלהם. כאן אנו מתארים מסך coculture המאפשר זיהוי של אינטראקציות כאלה interspecies תיווך כימי על ידי ערבוב של חיידקים אדמה עם זני כתב תעתיק ניאון של Bacillus subtilis על תקשורת מוצקה.

שימוש Coculture לזהות אינטראקציות interspecies המתווכת כימית

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות אינטראקציות בין מיקרובים שונים המתווכות על ידי תרכובות מופרשות ומובילות לשינויים בביטוי הגנים של חיידקים. זה מושג על ידי תרבית של זן חיידקים המכיל מדווח שעתוק פלואורסצנטי עם חיידקים סביבתיים כמושבות על לוחות אגר פטרי. העיגולים הכתומים מייצגים מושבות של מיקרובים סביבתיים.בעוד שהעיגולים הכחולים הם מושבות של המדווח, גידול על מצע מוצק מאפשר למטבוליטים שהמושבות הללו מייצרות להתפזר דרך האגר ולהפעיל ביטוי גנים במושבות מדווחות סמוכות. הפגיעות הפוטנציאליות המצוינות כאן עם כוכבים הן אותן מושבות שעשויות להפריש תרכובות שמשנות את ביטוי הגנים במדווח. אורגניזמים אלה מבודדים מלוחות המסך של התרבות המשותפת.משרים פוטנציאליים אלה נבדקים מחדש במסך משני כדי לאשר שהם היו האורגניזמים המפרישים מולקולות המשנות את ביטוי הגנים של החיידקים במדווח. למרות ששיטה זו מספקת תובנה לגבי האינטראקציות היוצרות ביופילם של עדינות בצילוס עם אורגניזמים באדמה, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון אינטראקציות מיקרוביאליות המשפיעות על ביטוי אלימות במיני סטפילוקוקוס או פסאודומונה. אכן, ניתן ליישם אותו באופן תיאורטי לזיהוי אינטראקציות מיקרוביאליות המשנות את ביטוי הגנים עבור כל מדווח בכל חיידק הניתן למעקב גנטי לאחר יצירת מבני דיווח פלואורסצנטיים עבור האורגניזם שבחרת, על פי פרוטוקול הטקסט, אסוף אדמה על ידי הסרת 0.5 הסנטימטרים העליונים של אדמת פני השטח החשופה לפני השימוש במרית לאיסוף אדמה וצינורות חרוטיים, הוסף 0.85% מי מלח סטריליים ביחס של 10 מיליליטר לגרם אחד של אדמה כדי ליצור תמיסת אדמה ומערבל אותה למשך דקה אחת כדי לעקור את החיידקים מחלקיקי האדמה.לאחר שנתנו לתמיסת האדמה לשקוע למשך דקה אחת, העבירו את השכבה המימית העליונה לצינור טרי, דללו את המדווח ודגימות הקרקע בהתאם לפרוטוקול הטקסט והבחינו 50 מיקרוליטר מכל אחד מהם במרכז לוחות המסך של תרבית משותפת בתנאים שלא יפעילו את מבנה המדווח לבדו. כמו כן, צלחת דגימת קרקע לבד וכתב לבד כבקרות. הוסיפו כ-23 מילימטר חרוזי זכוכית סטריליים על כל צלחת ופזרו את התאים על ידי השארת הצלחות על הספסל וניעורן קדימה ואחורה.תוך כדי סיבוב עד שהנוזל נספג, הפוך את הצלחות והשליך את החרוזים לכוס פסולת המכילה אתנול. לאחר הדגירה של לוחות התרבות המשותפת באמצעות פלואורסצנטיות והתחלה מהחלק העליון של הצלחת, הזיזו לאט את הלוח קדימה ואחורה על פני שדה הראייה לנקודות בהירות. לאחר טאטוא מלא אחד, סובב את הצלחת 90 מעלות וחזור על התהליך.כאשר מתגלה כתם פלואורסצנטי, הפעל לאט את תאורת השדה הבהיר וקבע אם הקרינה קשורה למושבת חיידקים. לבודד אורגניזמים מעוררים משוערים, שיהיו המושבות הלא-פלואורסצנטיות הקרובות למושבות הפלואורסצנטיות. מקם אותם במרכז שדה הראייה ונגיש בידך הדומיננטית, והשאיר את מנורת הפלורסנט דולקת.הפעל לאט את Brightfield כדי לזהות לפי צורה ולמקם את מושבת הפלואורסצנט והאורגניזמים המעוררים שמסביב בעזרת מוט זכוכית, הרם קצה טעינת ג'ל עגול סטרילי של 200 מיקרוליטר והחזק אותו כמו עיפרון. הנח את כף היד החיצונית על הבמה כדי לייצב אותה על משטח העבודה. לאחר מכן הנח את היד השנייה על צד האגודל הפנימי של היד כדי לייצב את כלי הקטיף, תוך שמירה על קצה הפיפטה מעל פני הצלחת.העבירו אותו לשדה הראייה ומרכזו אותו מעל המושבה שתרצו לבחור. הטיפ יהיה מחוץ לפוקוס. בעזרת הקצה החיצוני של היד שלך סובב לאט את קצה הפיפטה כלפי מטה אל המושבה שיש לקטוף.גע בו קלות מאוד בניסיון למזער כמה מושבות אחרות הקצה נוגע מבלי לסובב את כלי הקטיף. פס את הקצה על קטע של צלחת טרייה. לאחר קטיף מושבות, דגרו צלחות על פי הנחיות הבדיקה.כאשר מושבות נראות לעין, השתמש בסטריאוסקופ כדי לקבוע אם סוגים בודדים או מרובים של אורגניזמים גדלים על הצלחת מחדש כל סוג מורפו על צלחת טרייה ודוגר עד לגדילה כדי לבדוק אם משרים משוערים הם משרים אמיתיים, הכינו מדשאות של זני ההורים המדווחים והלא פלואורסצנטיים. לאחר ייבוש הצלחות, השתמש בקיסמים סטריליים כדי לבחור תאים ממושבות הבדיקה.טלאי על צלחת ריקה ולאחר מכן על שתי צלחות הדשא. לחלופין, החייאה, השעו את האורגניזמים המעוררים המשוערים במיליליטר אחד של מדיום נוזלי בווטרינר פלסטיק סטרילי, ומדדו את ה-OD 600 של המתלים לאחר נורמליזציה של ה-OD של כל תרחיף כדי להגיע ל-OD 600 של 0.5 נקודה, מיקרוליטר אחד מכל תרחיף על כל אחת משלוש הלוחות. לבסוף, לאחר שאפשרו לאורגניזמים לגדול, השתמשו בפלואורסצנטיות תחת מיקרוסקופ מנתח כדי לזהות אורגניזמים מעוררים משוערים המפעילים את זן המדווח הפלואורסצנטי, אך לא את זן בקרת ההורים.המסך כאן שימש לזיהוי אורגניזמים בקרקע המפרישים תרכובות המשנות את ביטוי הגנים של מרכיב מבני של מטריצת הביופילם בעדינים b באמצעות מדווח שעתוק פלואורסצנטי. באופן אידיאלי, כל צלחת תרבית משותפת צריכה להכיל יחס של אחד לאחד של מדווח למושבות אדמה שהן מושבות בודדות במרווחים קרובים. כאן אנו מדגימים כיצד יחס גבוה של מושבות מדווחות המוצגות כעיגולים כחולים ביחס למושבות אדמה המוצגות כעיגולים חומים מגביר את הביטחון באיתור האורגניזם המעורר בפועל מלוחות תרבית משותפת.האורגניזמים המעוררים באדמה מפרישים תרכובות המפעילות את המדווח. מושבות מדווח מרובות יושרו על הצלחת כאשר יחס המדווח לקרקע הגבוה יותר יקל על זיהוי המשרתים האמיתיים המוצגים באדום מגורמים משוערים אחרים המסומנים על ידי כוכבים. תכולת החומרים המזינים שולטת במידת היווצרות מושבות הגדילה, בעוד שדילול החיסון קובע אם המושבות המתקבלות מפוזרות כראוי.כפי שניתן לראות בתרבית משותפת זו, עדינות תמונה B מייצרת מטריצת ביופילם פלואורסצנטית בתגובה למיקרובים רבים מהאדמה. עבור הקרקעות שבדקנו, היה לנו שיעור פגיעה גבוה עבור מדווח מטריצת Ptap A YFP. זאת בניגוד לתוצאות שלא פורסמו ממסכים מקבילים.באמצעות הספורולציה והיכולת הכתבים היו מעטים עד לא זוהו פגיעות. לפיכך, שיעורי ה-HI עבור סוגי תאים שונים משתנים מאוד וייתכן שיהיה קשה לחזות אותם מראש. מוצגות כאן שתי דוגמאות ללוחות מסך של תרבית משותפת לפני ואחרי שנבחרו מושבות פוטנציאליות לבידוד.תוצאות שליליות וחיוביות הן משיטת המדבקה והן משיטת הספוט מוצגות כאן כאשר כ-50% מהמושבות שנבדקו במסך המשני שלנו הן חיוביות אמיתיות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כדי לענות על שאלות נוספות, למשל ריצוף DNA SR 16 s כדי לקבוע את הזהות הפילוגנטית של האורגניזם המעורר, או שימוש בספקטרומטריית מסה HPLC ב-NMR כדי לקבוע את הזהות הכימית של התרכובת הפעילה.

using-coculture-to-detect-chemically-mediated-interspecies

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: Speare, L., et al. בדיקת חממת מטבעות לכימות אינטראקציות תחרותיות בין מבודדי Vibrio fischeri . J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים בדיקת דגירה משותפת המשמשת לחקר האופן שבו זני חיידקים מתחרים בסביבה משותפת. הוא מיושם באופן נרחב במיקרוביולוגיה כדי לזהות מנגנונים, כגון הרג תלוי מגע או הרג שאינו תלוי במגע, המניעים אינטראקציות אלה.

בדיקת חממת מטבעות לחקר אינטראקציות תחרותיות בין זני חיידקים

מקור: Nathoo, N., et al. מערכת גידול משותף הידרופונית לניתוח סימולטני ושיטתי של אינטראקציות ואיתות מולקולריות של צמח/חיידק. J. Vis. Exp. (2017).סרטון זה מדגים מערכת גידול משותף הידרופונית לחקר אינטראקציות בין צמחים לחיידקים בתנאים סטריליים. שתילי צמחים מועברים למצע גידול סטרילי וחומצי, מודגרים ונבדקים לאיתור זיהום לפני החיסון באגרובקטריום. החיידקים הפעילים נצמדים לשורשי הצמח, מעבירים T-DNA לתאי הצמח ומקדמים שינויים מולקולריים המשפרים את ההתיישבות של החיידקים.

מערכת גידול משותף לחקר התגובות המולקולריות של מארחי צמחים וחיידקים המקיימים אינטראקציה

מקור: טמקין, מ. איי. ואחרים. בדיקות קו-קולטורה בתפוקה גבוהה לחקירת אינטראקציות מיקרוביאליות. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים בדיקה חוץ-גופית לחקר אינטראקציות מיקרוביאלית בין Corynebacterium propinquum ל-Staphylococcus בקולטורציה משותפת.

בדיקת In-Vitro לחקר אינטראקציות מיקרוביאליות בקוואקולטורה

חיידקים עשויים לצבור מוטציות מזיקות או מועילות במהלך חייהם. באוכלוסייה של תאים אנשים שצברו מוטציות מועילות עשויים במהירות עולים על חבריהם. כאן אנו מציגים הליך פשוט כדי לדמיין תחרות intraspecies באוכלוסיית תאים חיידקיים לאורך זמן באמצעות אנשים בעלי תווית פלואורסצנטית.

ניטור תחרות תוך-מין באוכלוסיית תאים חיידקיים על ידי Cocultivation של זנים שכותרתו פלואורסצנטית

מערכת cocultivation הידרופוני שתואר תומך צמחים שלם עם מסכי רשת מתכת cocultivates אותם עם חיידקים. רקמות הצמח, חיידקים, ומולקולות מופרדים אז ניתן לקצור בנפרד עבור ניתוחים במורד הזרם, בו זמנית מאפשר תגובות מולקולריות של שני המארחים צמח אינטראקציה חיידקים או microbiomes להיחקר.

הידרופוני Co- טיפוח מערכת לניתוח סימולטני ושיטתי של הצמח / מיקרובי אינטראקציות מולקולרית איתות

שילובים תרופתיים סינרגטי הם וממושכת לזהות את הנתונים באופן אמפירי. כאן נתאר שיטת זיהוי ואימות של מולקולות קטנות סינרגטי.

זיהוי תפוקה גבוהה של שילובים תרופתיים סינרגטי בשיטת חפיפה2

חיידקים לקודד מנגנונים שונים לעוסקים בתחרות הבינחיידקית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על תרבות לאפיון אינטראקציות תחרותיות בין מבודד חיידקי וכיצד הם משפיעים על המבנה המרחבי של אוכלוסיה מעורבת.

המשך הדגירה של האינטראקציה התחרותית בין vibrio פישרי מבודד

האינטראקציה עם התרבות המשותף המוצגת בפרוטוקול זה היא זולה, תפוקה גבוהה ופשוטה. ניתן להשתמש בתנאים אלה כדי להתבונן באינטראקציות מיקרוביאלית בתרבות המשותף, לזהות דפוסי אינטראקציה, ולאפיין את הפוטנציאל המעונה של מאמץ מחיידקים של התעניינות במחלות אנושיות וסביבתיות.

התפוקה הגבוהה-שיתוף תרבות החברה לחקירת אינטראקציות מחיידקים

פרוטוקול הדמיה זה של תאים חיידקיים חיים מאפשר הדמיה של אינטראקציות בין מינים חיידקיים מרובים ברמת תא יחיד לאורך זמן. הדמיה של זמן-לשגות מאפשרת להתבוננות של כל מין חיידקי במונוקולטורה או coculture לחקור אינטראקציות בין מינים בקהילות חיידקים מרובי מינים, כולל תנוענות תאים בודדים וכדאיות.

הדמיה קינטית של אינטראקציות חיידקים בין-מינים חד-תאיים

אנו מתארים גישה לאיתור ולכידת תת-אוכלוסיות של תאים פולשניים בזמן אמת. התכנון הניסויי משתמש באנליזה תאית בזמן אמת על ידי ניטור שינויים בעכבה החשמלית של תאים. סרטן פולשני, תאי חיסון, אנדותל או סטרומל ברקמות מורכבות יכולים להיתפס, וניתן להעריך את ההשפעה של תרביות משותפות.

זיהוי ולכידה בזמן אמת של תת-אוכלוסיות תאים פולשניות מתרביות משותפות

פרוטוקול זה מספק הנחיה מקיפה להגדרה ולניטור כמותי של תרביות משותפות, כולל ציאנובקטריה מפרישת סוכר פוטו-אוטוטרופיים ושמרים הטרוטרופיים.

הרכבה וכימות של תרביות משותפות המשלבות שמרים הטרוטרופיים עם ציאנובקטריה מפרישת סוכר פוטוטרופית

חקור אינטראקציות מיקרוביאליות מתווכות כימית באמצעות coculture של Bacillus subtilis עם מיקרואורגניזמים סביבתיים. השיטה מאפשרת זיהוי תרכובות מופרשות המשנות ביטוי גנים בזמן אמת.

שימוש Coculture לזהות אינטראקציות interspecies המתווכת כימית

גלה סרטונים נוספים