שימוש Coculture לזהות אינטראקציות interspecies המתווכת כימית

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות אינטראקציות בין מיקרובים שונים המתווכות על ידי תרכובות מופרשות ומובילות לשינויים בביטוי הגנים של חיידקים. זה מושג על ידי תרבית של זן חיידקים המכיל מדווח שעתוק פלואורסצנטי עם חיידקים סביבתיים כמושבות על לוחות אגר פטרי. העיגולים הכתומים מייצגים מושבות של מיקרובים סביבתיים.

בעוד שהעיגולים הכחולים הם מושבות של המדווח, גידול על מצע מוצק מאפשר למטבוליטים שהמושבות הללו מייצרות להתפזר דרך האגר ולהפעיל ביטוי גנים במושבות מדווחות סמוכות. הפגיעות הפוטנציאליות המצוינות כאן עם כוכבים הן אותן מושבות שעשויות להפריש תרכובות שמשנות את ביטוי הגנים במדווח. אורגניזמים אלה מבודדים מלוחות המסך של התרבות המשותפת.

משרים פוטנציאליים אלה נבדקים מחדש במסך משני כדי לאשר שהם היו האורגניזמים המפרישים מולקולות המשנות את ביטוי הגנים של החיידקים במדווח. למרות ששיטה זו מספקת תובנה לגבי האינטראקציות היוצרות ביופילם של עדינות בצילוס עם אורגניזמים באדמה, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון אינטראקציות מיקרוביאליות המשפיעות על ביטוי אלימות במיני סטפילוקוקוס או פסאודומונה. אכן, ניתן ליישם אותו באופן תיאורטי לזיהוי אינטראקציות מיקרוביאליות המשנות את ביטוי הגנים עבור כל מדווח בכל חיידק הניתן למעקב גנטי לאחר יצירת מבני דיווח פלואורסצנטיים עבור האורגניזם שבחרת, על פי פרוטוקול הטקסט, אסוף אדמה על ידי הסרת 0.5 הסנטימטרים העליונים של אדמת פני השטח החשופה לפני השימוש במרית לאיסוף אדמה וצינורות חרוטיים, הוסף 0.85% מי מלח סטריליים ביחס של 10 מיליליטר לגרם אחד של אדמה כדי ליצור תמיסת אדמה ומערבל אותה למשך דקה אחת כדי לעקור את החיידקים מחלקיקי האדמה.

לאחר שנתנו לתמיסת האדמה לשקוע למשך דקה אחת, העבירו את השכבה המימית העליונה לצינור טרי, דללו את המדווח ודגימות הקרקע בהתאם לפרוטוקול הטקסט והבחינו 50 מיקרוליטר מכל אחד מהם במרכז לוחות המסך של תרבית משותפת בתנאים שלא יפעילו את מבנה המדווח לבדו. כמו כן, צלחת דגימת קרקע לבד וכתב לבד כבקרות. הוסיפו כ-23 מילימטר חרוזי זכוכית סטריליים על כל צלחת ופזרו את התאים על ידי השארת הצלחות על הספסל וניעורן קדימה ואחורה.

תוך כדי סיבוב עד שהנוזל נספג, הפוך את הצלחות והשליך את החרוזים לכוס פסולת המכילה אתנול. לאחר הדגירה של לוחות התרבות המשותפת באמצעות פלואורסצנטיות והתחלה מהחלק העליון של הצלחת, הזיזו לאט את הלוח קדימה ואחורה על פני שדה הראייה לנקודות בהירות. לאחר טאטוא מלא אחד, סובב את הצלחת 90 מעלות וחזור על התהליך.

כאשר מתגלה כתם פלואורסצנטי, הפעל לאט את תאורת השדה הבהיר וקבע אם הקרינה קשורה למושבת חיידקים. לבודד אורגניזמים מעוררים משוערים, שיהיו המושבות הלא-פלואורסצנטיות הקרובות למושבות הפלואורסצנטיות. מקם אותם במרכז שדה הראייה ונגיש בידך הדומיננטית, והשאיר את מנורת הפלורסנט דולקת.

הפעל לאט את Brightfield כדי לזהות לפי צורה ולמקם את מושבת הפלואורסצנט והאורגניזמים המעוררים שמסביב בעזרת מוט זכוכית, הרם קצה טעינת ג'ל עגול סטרילי של 200 מיקרוליטר והחזק אותו כמו עיפרון. הנח את כף היד החיצונית על הבמה כדי לייצב אותה על משטח העבודה. לאחר מכן הנח את היד השנייה על צד האגודל הפנימי של היד כדי לייצב את כלי הקטיף, תוך שמירה על קצה הפיפטה מעל פני הצלחת.

העבירו אותו לשדה הראייה ומרכזו אותו מעל המושבה שתרצו לבחור. הטיפ יהיה מחוץ לפוקוס. בעזרת הקצה החיצוני של היד שלך סובב לאט את קצה הפיפטה כלפי מטה אל המושבה שיש לקטוף.

גע בו קלות מאוד בניסיון למזער כמה מושבות אחרות הקצה נוגע מבלי לסובב את כלי הקטיף. פס את הקצה על קטע של צלחת טרייה. לאחר קטיף מושבות, דגרו צלחות על פי הנחיות הבדיקה.

כאשר מושבות נראות לעין, השתמש בסטריאוסקופ כדי לקבוע אם סוגים בודדים או מרובים של אורגניזמים גדלים על הצלחת מחדש כל סוג מורפו על צלחת טרייה ודוגר עד לגדילה כדי לבדוק אם משרים משוערים הם משרים אמיתיים, הכינו מדשאות של זני ההורים המדווחים והלא פלואורסצנטיים. לאחר ייבוש הצלחות, השתמש בקיסמים סטריליים כדי לבחור תאים ממושבות הבדיקה.

טלאי על צלחת ריקה ולאחר מכן על שתי צלחות הדשא. לחלופין, החייאה, השעו את האורגניזמים המעוררים המשוערים במיליליטר אחד של מדיום נוזלי בווטרינר פלסטיק סטרילי, ומדדו את ה-OD 600 של המתלים לאחר נורמליזציה של ה-OD של כל תרחיף כדי להגיע ל-OD 600 של 0.5 נקודה, מיקרוליטר אחד מכל תרחיף על כל אחת משלוש הלוחות. לבסוף, לאחר שאפשרו לאורגניזמים לגדול, השתמשו בפלואורסצנטיות תחת מיקרוסקופ מנתח כדי לזהות אורגניזמים מעוררים משוערים המפעילים את זן המדווח הפלואורסצנטי, אך לא את זן בקרת ההורים.

המסך כאן שימש לזיהוי אורגניזמים בקרקע המפרישים תרכובות המשנות את ביטוי הגנים של מרכיב מבני של מטריצת הביופילם בעדינים b באמצעות מדווח שעתוק פלואורסצנטי. באופן אידיאלי, כל צלחת תרבית משותפת צריכה להכיל יחס של אחד לאחד של מדווח למושבות אדמה שהן מושבות בודדות במרווחים קרובים. כאן אנו מדגימים כיצד יחס גבוה של מושבות מדווחות המוצגות כעיגולים כחולים ביחס למושבות אדמה המוצגות כעיגולים חומים מגביר את הביטחון באיתור האורגניזם המעורר בפועל מלוחות תרבית משותפת.

האורגניזמים המעוררים באדמה מפרישים תרכובות המפעילות את המדווח. מושבות מדווח מרובות יושרו על הצלחת כאשר יחס המדווח לקרקע הגבוה יותר יקל על זיהוי המשרתים האמיתיים המוצגים באדום מגורמים משוערים אחרים המסומנים על ידי כוכבים. תכולת החומרים המזינים שולטת במידת היווצרות מושבות הגדילה, בעוד שדילול החיסון קובע אם המושבות המתקבלות מפוזרות כראוי.

כפי שניתן לראות בתרבית משותפת זו, עדינות תמונה B מייצרת מטריצת ביופילם פלואורסצנטית בתגובה למיקרובים רבים מהאדמה. עבור הקרקעות שבדקנו, היה לנו שיעור פגיעה גבוה עבור מדווח מטריצת Ptap A YFP. זאת בניגוד לתוצאות שלא פורסמו ממסכים מקבילים.

באמצעות הספורולציה והיכולת הכתבים היו מעטים עד לא זוהו פגיעות. לפיכך, שיעורי ה-HI עבור סוגי תאים שונים משתנים מאוד וייתכן שיהיה קשה לחזות אותם מראש. מוצגות כאן שתי דוגמאות ללוחות מסך של תרבית משותפת לפני ואחרי שנבחרו מושבות פוטנציאליות לבידוד.

תוצאות שליליות וחיוביות הן משיטת המדבקה והן משיטת הספוט מוצגות כאן כאשר כ-50% מהמושבות שנבדקו במסך המשני שלנו הן חיוביות אמיתיות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כדי לענות על שאלות נוספות, למשל ריצוף DNA SR 16 s כדי לקבוע את הזהות הפילוגנטית של האורגניזם המעורר, או שימוש בספקטרומטריית מסה HPLC ב-NMR כדי לקבוע את הזהות הכימית של התרכובת הפעילה.